Ex Vivo חוט השדרה מושרה לייזר הפגיעה דגם להערכת מנגנוני axonal הניוון בזמן אמת
25 בנובמבר 2014
אנו מציגים פרוטוקול המשתמש במיקרוסקופ זמן-lapse של עירור שני פוטונים כדי לדמיין בו זמנית את הדינמיקה של פגיעות אקסון ומיאלין בזמן אמת. פרוטוקול מוצע זה מאפשר מחקרים של גורמים פנימיים וחיצוניים כאחד שיכולים להשפיע על גורל האקסון המיאליני המרכזי לאחר פציעה ולתרום לנכות קלינית קבועה.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להעריך מנגנוני ניוון אקסונליים חריפים בזמן אמת. זה מושג על ידי בידוד רקמת נוירו-חוט שדרה חיובית YFP בירך, תוך החדרה מתמדת של הרקמה בנוזל מוחי מוחי מלאכותי דל סידן מחומצן. לאחר מכן רקמת חוט השדרה מיושרת תחת מטרה של מיקרוסקופ של שני פוטונים תוך שמירה על תנאים פיזיולוגיים, והמיאלין נצבע בצבע פלואורסצנטי ליפופילי אדום נילוס.
לאחר מכן, נגע בגודל מיקרוס נוצר על פני השטח הגביים של עמוד הגב על ידי התאמת עוצמת הלייזר על מנת לחצות אקסונים מיאליניים בתוך העמודים. התוצאות מראות נסיגה של האקסונים הפגועים, פרי אקסונלי, נפיחות מיאלין ותגובות תאיות אחרות המבוססות על מדידות כמותיות של התמונות. אז היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות הוא שאנו משתמשים בכל חוט השדרה הצווארי ולכן סיבי עמוד הגב נשארים שלמים.
כך שזה מונע נזק לסיבים המיאליניים המרכזיים הבסיסיים, המתרחש בדרך כלל במהלך הכנת רצועות החומר הלבן. מי שידגים את ההליך הזה יהיה ד"ר סטארלין אדה, פוסט-דוקטורנט במעבדה שלי שבאמת דגל בטכניקה הזו כדי להתכונן לזלוף תוך לבבי. הכינו דל סידן, נוזל עמוד שדרה מוחי מלאכותי, או CSF עם תמיסות BNC מרוכזות פי שניים לשפע של חוט השדרה ex vivo.
במהלך ההדמיה, הכינו A CSF רגיל עם פתרונות מלאי כפולים A ו-B בבקבוק זכוכית. הצע פתרונות אלה ל-pH 7.4. שמור על הסידן הנמוך A CSF מקורר ליד אזור הדיסקציה ושמור את ה-A CSF הרגיל בטמפרטורת החדר ליד המיקרוסקופ.
מבעבעים את שני התמיסות עם מכונית ודלק במשך חצי שעה לפני השימוש ומבעבעים אותם ברציפות בזמן שהם בשימוש. לאחר מכן, הכינו את תא הזלוף הפתוח להדמיה. ראשית, חבר את פלט המתכת של תנורי החימום המוטבעים לתא.
לאחר מכן הדבק את תא ההדמיה לתא הדליפה עם כמות טובה של חומר דביק כך שיהיה פוטנציאל להתאים מעט את מיקום תא ההדמיה. אבטח את בדיקת טמפרטורת המשוב של תנורי החימום המוטבעים ליד כניסת הנוזל ואבטח את צינור היניקה מנירוסטה לקו הוואקום ביציאת החדר. כעת הפעל את משאבת הוואקום ואת משאבת הזלוף.
לאחר שהתא מתמלא ב-A CSF, חייג את המשאבה ל-1.5 עד שני מיליליטר לדקה. לאחר מכן שלוט בנפח A CF בתא לפי מיקום קו הוואקום. כדי להתאים המתת חסד של TH בן שישה עד 10 שבועות עכבר טרנסגני YFP אחד.
ראשית, ודא שאין תגובה רפלקסיבית לצביטה בבוהן. לאחר מכן גלח את האזור המכסה את חוט השדרה והמוח. לאחר הגילוח יש לנגב את העור החשוף עם בטדין ואתנול 70%.
כעת יש לרסס את אזור החזה והבטן באתנול 70% ולחדל את הטרנס קארדי החיה עם קרבוגן מבעבע סידן A CSF. כאשר הכבד מתחיל להחוויר, חבר את מחט הזלוף ללב בעזרת קליפ. לאחר מכן הפוך את החיה ונגב את צד העור הגבי עם 70% אתנול.
בצע חתך לאורך קו האמצע מהאף לירך כדי לחשוף את כובע הגולגולת ואת הרקמה שמעל החוליות. השתמש בסיכות כדי למשוך הצידה את העור ולאבטח את החיה באף ובהון. כעת העבירו את התכשיר למיקרוסקופ דיסקציה שם עם מספריים חתוכים היטב על פני השטח הגבי של הגולגולת בגובה נורות הריח.
הכנס את קצה המספריים לתוך החתך החדש שנעשה וכדי לחתוך לאורך שני קצוות כובע הגולגולת כדי לחשוף את המוח הקטן. אין לכרות לחלוטין את מכסה הגולגולת. הרם את כובע הגולגולת החושף את המוח וחתוך בזהירות את הקצוות השמאלי והימני של העצם הבין-קודקודית מעל המוח הקטן.
כעת, תוך כדי משיכה עדינה של כובע הגולגולת ומשטח עמוד השדרה הגבי, בצע חתכים נחותים משורשי העצב האחוריים כדי לחשוף עוד יותר את חוט השדרה. לאחר מכן בעזרת מספריים עם קצה דק, חותכים בזהירות את החוליות דו צדדית. בזווית של 45 מעלות, חיוני להימנע מנזק לעמודי הגב
.סיבים לבנים בהירים אלה נפגעים בקלות מבלי להיזהר, ממשיכים למשוך בעדינות לאחור את העצם והשריר שנכרתו תוך חיתוך החוליות. חותכים סנטימטר עד שני סנטימטרים כדי לבודד קטע של רקמת חוט השדרה הצווארי המתאים להדמיה. לאחר מכן השתמש במספריים כדי לחתוך את הרקמה והעצם במקביל לעמוד החוליות.
נקה גם את הרקמה מתחת לעמוד. בצע את החתכים הללו ברמה ככל האפשר מכיוון שחשוב מאוד שהרקמה תשכב שטוחה בגובה החדר להדמיה. לבסוף, השתמש באזמל מספר 11 כדי לחצות את גזע המוח מעבר לסיום סיבי אולו הדשא וברמת בית החזה העליונה.
לאחר מכן השתמש במספריים כדי לחתוך את הרקמה והעצם בשתי הנקודות הללו. הרקמה המבודדת צריכה להכיל שני שליש מעמוד השדרה המקיף את גזע המוח הלבבי, הגדלת צוואר הרחם וחוט השדרה החזי העליון. העבירו את עמוד השדרה המבודד לתא ההדמיה ex vivo והעלו בהדרגה את טמפרטורת ה-8 לטמפרטורה שבין 36 ל-37 מעלות צלזיוס במהלך השעה הקרובה.
שמור על טמפרטורה זו במהלך ההדמיה. היבט קריטי אחד של פרוטוקול זה הוא להבטיח שאתה מבודד את חוט השדרה מבלי לפגוע בסיבי עמוד השדרה הגביים. ההיבט השני הקריטי ביותר של פרוטוקול זה הוא להבטיח שחוט השדרה מוזרם באופן רציף בנוזל מוחי מלאכותי מחומצן.
בעזרת מחזיק שקופיות רקמות שונה, אבטח בזהירות את עמוד החוליה בתא. חשוב להימנע מלגעת בחוט השדרה החשוף, עמודי הגב, או להפעיל עליהם לחץ עם חוטי החוטים החשופים. כעת כדי להכתים את המיאלין, עצור לזמן קצר את זרימת התמיסה והסר את קו הוואקום.
הוסף חמישה עד 10 מיקרוליטרים של צבע אדום נילוס של חמישה מילי-מולרי ליד הקצה החוטי של חוט השדרה. לאחר מכן ערבבו את התמיסה בעדינות בכל תא ההדמיה ואפשרו לרקמה לדגור למשך דקה או שתיים. לאחר הצביעה, החזר את זרימת ה-CSF המחומצן בין 1.5 לשני מיליליטר לדקה והחלף את קו הוואקום באמצעות מיקרוסקופ צילום דו-צדדי.
דמיין את חוט השדרה באמצעות מטרת טבילה במים. הורד לאט את המטרה למשטח A CSF, ולאחר מכן הבא את חוט השדרה למיקוד תחת אור פלואורסצנטי של מיקוד אוטומטי. כעת עבור למצב סריקה להדמיה בסיסית של הדשא העולה.
סיבים מיאליניים של Oculus. כדי לרגש את ה-YFP והאדום של הנילוס, הגדר את העירור ל-950 ננומטר ובודד את פליטות הפלואורסצנט עם מסנני DI כרוניים ומעברי כיפוף. אם תוך שעה מההדמיה אתה מבחין שליותר מ-3% מהאקסונים יש סטרואידים, זה אומר שחוט השדרה נפגע במהלך הבידוד.
כעת עדיף להשליך את התכשיר כדי לפצוע את הרקמה בלייזר. ראשית, אתר אזור ברקמה שנראה ישר. לאחר מכן הגדל את הגדלת אזור הצפייה ל-30.3 x.
כוון את הלייזר ל-800 ננומטר והגדל את עוצמתו לכ-110 מילי-וואט. כעת בצע חמש סריקות לייזר בשדה ראייה. התוצאות צריכות להיות אבלציה מלאה בקוטר 20 מיקרון.
בדוק את הפציעה בהגדרות הדמיה סטנדרטיות עם הלייזר בעוצמה של 17 מילי-וואט ובהגדלה של פי 20.08. אם הסיבים האקסונליים באבלציה אינם עוברים לחלוטין, השליכו את התכשיר. כעת, השתמש בהגדרות דולג הזמן עם צילומי Z כדי לבצע הקלטות דינמיות של תגובה לפציעות.
ניתן לדמיין את התכשיר עד 24 שעות. קטע חוט השדרה בודד והוצב כמתואר בנקודת ההתחלה T-P-L-S-M. ההקלטה מראה סקסונים מפרקיים של דשא מיאליני כאקסונים חיוביים YFP מיושרים במקביל במיאלין מוכתם באדום עם מעט סטרואידים אקסונליים או סימנים מורפולוגיים אחרים של ניוון אקסונלי.
ניתן לראות פרטים עדינים כמו האף של ROM VA המודגש על ידי ראשי חץ. 40 דקות לאחר מכן לאחר פגיעה בחוט השדרה שנגרמה על ידי לייזר. רוב האקסונים הטרנסקטים יוצרים נורות קצה אקסונליות אופייניות ונסוגים מאתר הפגיעה, אקסונים הסמוכים לאתר הפגיעה עוברים ניוון משני ונפיחות אקסונלית בולטת יותר.
בניגוד לסיבים הנסוגים הרבעוניים, רוב נורות הקצה האקסונליות הנסוגות הממוקמות רחוק מהנגע והסטרואידים סומנו בחוזקה באדום הנילוס המרמז על שינוי סביבתי בתוך האקסון. לאחר שבע שעות, האקסונים המשיכו לסגת ממקום הנגע. עם זאת, הדבר ניכר יותר בנורות קצה הממוקמות דיסטליות או רוסטרליות מהנגע מאשר בנורות קצה הממוקמות פרוקסימלי או קורטי לנגע.
בסופו של דבר, אקסונים שנחסכו בתחילה עברו בהדרגה ניוון משני מושהה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד את הנוירולוגי וחוט השדרה ולבצע פגיעה בחוט השדרה הנגרמת בלייזר. לכן, תוכל לבחון את ההיבטים הדינמיים של ניוון אקסונלי ראשוני ושניוני בזמן אמת.
המידע המתקבל משימוש במערכת מודל זו עשוי להוביל להבנה מכניסטית חשובה של נזק הן לאקסון והן למיאלין לאחר פציעה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול המשתמש במיקרוסקופיית צילום רציף (time-lapse) בעקבי עירור דו-פוטוני כדי להנחית ויזואלית פגיעות באקסונים ובמיאלין בזמן אמת. שיטה זו מאפשרת להעריך גורמים פנימיים וחיצוניים המשפיעים על גורלם של אקסונים ממיאלינציה לאחר פגיעה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- מיקרוסקופיה
- דגנרציה אקסונלית
רקע
- הבנת מנגנוני הניוון האקסונלי חיונית לטיפול במוגבלויות קליניות.
- מיקרוסקופיה דו-פוטונית מספקת גישה ייחודית לחקר דינמיקות אלו.
- ויזואליזציה בזמן אמת יכולה לשפר את הבנתנו את התגובות לפגיעה.
- תפקידו של המיאלין בבריאות האקסונים הוא משמעותי בהקשר של פגיעה.
מטרת המחקר
- להערכת מנגנוני דגנרציה אקסונלית חריפה בזמן אמת.
- לוויזואליזציה של הדינמיקה של פגיעות באקסונים ובמיאלין.
- לבחינת גורמים המשפיעים על גורלו של האקסון לאחר פגיעה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד רקמה עצבית ורקמת חוט שדרה חיוביות ל-YFP.
- פרפוזיה עם נוזל מוחי-שדרתי מלאכותי מחומצן בעל ריכוז סידן נמוך.
- יישור של רקמת חוט השדרה תחת מיקרוסקופ דו-פוטוני.
- צביעה של מיאלין בצבע Nile red.
תוצאות עיקריות
- תצפית על נסיגה של אקסונים פגועים.
- זיהוי נפיחות של מיאלין פרי-אקסונלי.
- מדידות כמותיות של תגובות תאיות.
- שימור סיבי עמוד דורסלי במהלך הניסוי.
מסקנות
- הפרוטוקול מאפשר מחקר מקיף של דינמיקת פגיעות אקסוניות.
- דימיון בזמן אמת מספק תובנות לגבי תגובות תאיות לפגיעה.
- לשיטה זו יש יתרונות על פני טכניקות קיימות בשל שמירה על שלמות הרקמה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מודל פגיעה בחוט השדרה ex vivo זה מאפשר ויזואליזציה בזמן אמת של מנגנוני ניוון אקסונלי, ומספק מערכת מבוקרת לניתוח נתיבי פגיעה ראשוניים ושניוניים. באמצעות שמירה על שלמות העמודים הדורסליים ואפשרות למניפולציה סביבתית מדויקת, המודל תומך בהסרת סיכונים מכניסטיים (de-risking) בתהליך תיקוף של מטרות נוירו-תרפויטיות. גישה זו מציעה ערך חיזוי עבור סריקת תרכובות המווסתות נסיגה אקסונלית, שלמות המיילין או תהליכי ניוון שניוניים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי הבחנה בזמן אמת בין קטיעה אקסונית ראשונית לבין מנגנוני דגנרציה משנית.
- ערך תפעולי: מספק פלטפורמה הניתנת לשחזור לצורך תיקוף של מטרות פונקציונליות באמצעות דימוג כמותי של נסיגה אקסונית ונפיחות מיאלין.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי זיהוי תרכובים המעכבים את היווצרות הנורונית של קצה האקסון או מפחיתים דגנרציה פרי-אקסונית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצרת קריאות סטנדרטיות וכמותיות של שלמות אקסונית ודינמיקה של מיאלין עבור קמפיינים של סריקת תרכובות.
- שחזוריות: פגיעת לייזר מבוקרת ומערכת פרפוזיה מבטיחות פרמטריים נגעיים עקביים בין חזרות.
- סקביליות: תואם לצילום time-lapse ופרפוזיה פרמקולוגית לסריקה מכניסטית בקיבולת בינונית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה פתולוגיות אקסוניות רלוונטיות קלינית, כולל היווצרות ספרואידים, נסיגה ודגנרציה של מיאלין הנצפות בפגיעות בחבל השדרה.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין מנגנוני גילוי לאימות פרה-קליני על ידי מתן אפשרות להערכה בזמן אמת של מועמדים לנוירופרוטקציה או לרימיאליניזציה.
- החלטות מותאמות סיכון: תומך בקריטריונים של go/no-go המבוססים על עיכוב של דגנרציה אקסונית משנית או שימור של שלמות המיאלין.
שילוב זרימות עבודה ותהליכי עיבוד
המודל משתלב ברצף הגילוי, החל מתיקוף מטרה, דרך זיהוי מוביל ועד לבדיקות יעילות פרה-קליניות, ובמיוחד עבור אסטרטגיות לנוירופרוטקציה ולשימור אקסונים.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות של נתיבים של דגנרציה אקסונלית ובבירור מכניסטי של תגובות לפגיעה.
- סריקה: מאפשר פיתוח של בדיקות עם נקודות סיום כמותיות, כגון מהירות נסיגה אקסונלית ואובדן של שלמות המיאלין.
- אנליטיקה: מספק נתוני דימות בעלי תוכן גבוה להשוואה סטטיסטית של השפעות טיפול על דינמיקה של אקסונים ומיאלין.
- מחקר תרגומי: מקשר בין תגובות אקסונליות חריות לתהליכי דגנרציה מושהים הרלוונטיים לניורודגנרציה כרונית.
- שימוש חוזר ארגוני: מכונן פלטפורמת דימות הניתנת לשימוש חוזר עבור תוכניות ניהול תרופיתי-נוירולוגיות מרובות המתמקדות ביציבות אקסונלית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית במודלים של פגיעה אקסונית על ידי בידוד אירועי דגנרציה ראשוניים מאירועי דגנרציה משניתים.
- ערך תפעולי: פרוטוקול סטנדרטי של פרפוזיה ופגיעה מבטיח הדירות בין מעבדות ובנקודות זמן שונות.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) באמצעות אספקת אותות יעילות מוקדמים, מבוססי-מכניזם, בשימור אקסוני.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם-סיכון של תרכובות המדגימות הגנה בזמן אמת מפני נסיגה אקסונית או נזק למיאלין.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות במיקרוסקופיה דו-פוטונית ובדימות רקמות חיות לצורך יישום מוצלח.
- המכשור כולל לייזר הניתן לכיוון, עדשת אובייקטיב בטבילת מים, ומערכת פרפוזיה המסוגלת לשמור על טמפרטורה פיזיולוגית וזרימה.
- נדרש סטנדרטיזציה בין-צוותית עבור פרמטרי הפגיעה, פרוטוקולי צביעה בצבעים, ותהליכי ניתוח תמונות כמותיים.
- התאמה למודלי מחלה מחייבת תיקוף של רפורטרים טרנסגניים והערכת רלוונטיות הפגיעה להקשרים פתופיזיולוגיים ספציפיים.
- מגבלות מעשיות כוללות את חלון הדימות של 24 שעות ואת הצורך בשמירה על חיוניות הרקמה ex vivo לאורך כל הניסויים.
