Name: בידוד של תאים הראשוניים Murine מוח כלי הדם האנדותל (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: למדו לבודד תאים אנדותליים מיקרו-ווסקולריים מוחיים ראשוניים מעכברים לחקר מחסום הדם-מוח. השיטה משלבת הומוגניזציה מכנית, עיכול אנזימטי וצנטריפוגה בגרדיאנט צפיפות לקבלת תרביות טהורות לניסויים תפקודיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המרכז הבינתחומי למחקר (IZKF) מינסטר הקליני (SEED 12/03, SB), על ידי Forschungsgemeinschaft דויטשה (DFG), תאים-בתנועה האשכול של אקסלנס (1003 EXC - CIM), אוניברסיטת מינסטר (לSB וSGM) ועל ידי קרונה-Fresenius-Stiftung השאר (2012_A88 לSB וSGM). אנו מודים ליקה בלום לאיורים מעולים.

כל הניסויים בבעלי החיים אושרו על ידי הרשויות המקומיות (&quot;LandesamtfürNatur, Umwelt und Verbraucherschutz NRW; Fachbereich 87, Tiergesundheit, Tierschutz; רקלינגהאוזן, גרמניה&quot;) ומתנהלים על-פי החוק הגרמני של הגנה על בעלי חיים. 1. הערות כלליות לניסויים בעכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את כל הניסויים באמצעות עכברים בהתאם להנחיות הוועדה מוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על העכברים בתנאי הפתוגן ללא ותאפשר להם גישה כלרצונך מזון ומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בעכברים לגיל והתאמת מין בקבוצות ניסוי בגלל מאפיינים ביולוגיים יכולים להשתנות עם גיל ומין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ככל שניתן לנסות ולצמצם, לחדד או להחליף ניסויים בבעלי חיים. </li></ol> 2. הכנת שיפוע Percoll <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב 19 מיליליטר של 1x PBS עם 1 מיליליטר 10x PBS, 1 FCS מיליליטר ו -10 מיליליטר Percoll. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע STEלהרגיז סינון בצינור זכוכית (קוטר נקבוביות מסנן: 0.2 מיקרומטר). לאחר מכן לאחסן את הפתרון על 4 מעלות צלזיוס. </li></ol> 3. הכנת תא האנדותל בינוני והציפוי של צלחות תרבית תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני תא האנדותל: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת 500 מיליליטר בינוני: (. כ -20%) מערבבים 400 מיליליטר DMEM בינוני (. כ 80%) עם 100 PDS מיליליטר, 0.25 ml bFGF (. 20 מיקרוגרם / מיליליטר; כ 0.05%), 0.5 מיליליטר הפרין (100 μl / מיליליטר;. כ 0.1%) ו -0.5 מיליליטר pyrumycin (4 מ&quot;ג / מיליליטר;. כ 0.1%). להוסיף pyrumycin רק למדיום תרבות תא בשימוש ב2 הימים הראשונים של התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע סינון סטרילי בתוך שפופרת זכוכית (קוטר נקבוביות מסנן: 0.2 מיקרומטר). לאחר מכן לאחסן את הפתרון על 4 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציפוי של צלחות תרבית תאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ל1 מיליליטר של תמיסת ציפוי, להכין פתרון של DDH 500 μl 2 O, 400 IV μl קולגן (0.4 מ&quot;ג / מיליליטר) ו -100 μl פיברונקטין (0.1 מ&quot;ג / מיליליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את פני השטח של EAC כלגם שעות של צלחת תרבית תאים עם פתרון הציפוי. אחסן את הצלחת על 4 מעלות צלזיוס למשך לילה. </li></ol></li></ol> 4. בידוד של תאי האנדותל Murine מוח כלי הדם (MBMEC) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב 10 עכברים בוגרים (8-12 שבועות, C57BL / 6) נקע בצוואר רחם. לאחר מכן לבודד את העכבר-המוח וחנות ב 5 מיליליטר של PBS (אזהרה:! עבודה סטרילית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מוח נובע, cerebella וthalami עם מלקחיים. לנתק את קרומי המוח על ידי גלגול בזהירות את מוחם על נייר סופג סטרילית. לאסוף forebrains קרומי המוח-חופשיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את המוח לצינור 50 מיליליטר פלקון המלא 13.5 מיליליטר של DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכך את הרקמה, ראשון עם טפטפת 25 מיליליטר, ולאחר מכן עם פיפטה 10 מיליליטר עד התקשורת הופכת להיות חלבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אז לעכל את הרקמה בתערובת של 0.6 collagenase CLS2 מיליליטר (10 מ&quot;ג / מיליליטר בDMEM) ו0.2 מיליליטר DNAse (1 מ&quot;ג / מיליליטר PBS) בDulbecco של הנשר בינוני (DMEM) השתנה עבור שעה 1 ב 37 ° C על מסלול לנערr ב 180 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 10 מיליליטר של DMEM מתווסף ההשעיה ו צנטריפוגות רקמת התאים XG ב 1000 עבור 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> supernatant בטל (אזהרה:! הגלולה היא קלה לאבד) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר את המיאלין, resuspend את הכדור עם טפטפת 25 מיליליטר ב -25 מיליליטר של BSA-DMEM (20% w / v) (כ. 25 פעמים), ו צנטריפוגות XG ב 1000 עבור 20 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את השכבה העליונה המיאלין (החלבית) עם פיפטה פסטר זכוכית שבורה בקוטר גדול יותר, ולאחר מכן למחוק את שכבת BSA עם פיפטה פסטר נורמלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב9 מיליליטר DMEM ולהוסיף 1 מיליליטר collagenase / dispase (ריכוז סופי הוא 1 מ&quot;ג / מיליליטר) ו -0.1 מיליליטר DNAse. לעכל את הפתרון עבור שעה 1 ב 37 ° C על שייקר מסלולית ב 180 סל&quot;ד (אזהרה: לא להשתמש בפיפטה resuspend - יכולים ללכת לאיבוד תאים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך העיכול, צנטריפוגה פתרון Percoll להקים שיפוע הצפיפות באמצעות ultracentrifuge ב3,000 XG עבור שעה 1 ב 4 מעלות צלזיוס, עם ההאצה, wiבלם thout. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 10 מיליליטר של DMEM להשעית התא מתעכלת. צנטריפוגה ההשעיה XG ב 1000 עבור 10 דקות ב 4 ° C. ואז להשליך את supernatant ו resuspend גלולה ב 2 מיליליטר של DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את תאי resuspended בזהירות על גבי שיפוע Percoll ו צנטריפוגות ב XG 700 במשך 10 דקות ב 4 ° C, ללא האצה ובלימה. הערה: התאים גלויים כענן בשלבי הביניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח כ. 12 מיליליטר של שלבי ביניים עם תאים בעזרת מחט סטרילית ארוכה ולמקם אותו ב-50 מיליליטר פלקון חדש עם 5 מיליליטר של DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים שוב XG ב 1000 עבור 10 דקות ב 4 ° C. לאחר מכן resuspend גלולה במדיום תא האנדותל (השתמש כ. 0.2 מיליליטר של מדיום לסנטימטר 1 2 פני השטח של צלחת תרבית תאים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון ציפוי מצלחות תרבית תאים מצופים (ראה שלב 3.2) ולשטוף היטב כל עם PBS סטרילי בשני שלבי שטיפה ברציפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על תרביות תאי אנדותל במדיום סלולארי על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור סטרילי. לשנות את המדיום כל יומיים עד שלושה ימים. פיצול תאים בנקודת מפגש של 90%. </li></ol>

<ol><li>Neuwelt, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engaging+neuroscience+to+advance+translational+research+in+brain+barrier+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Engaging neuroscience to advance translational research in brain barrier biology.</a> Nature reviews. Neuroscience. 12, 169-182 (2011).</li>
<li>Ohtsuki, S., Terasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+carrier-mediated+transport+systems+to+the+blood-brain+barrier+as+a+supporting+and+protecting+interface+for+the+brain%3B+importance+for+CNS+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Contribution of carrier-mediated transport systems to the blood-brain barrier as a supporting and protecting interface for the brain; importance for CNS drug discovery and development.</a> Pharmaceutical Research. 24, 1745-1758 (2007).</li>
<li>Bittner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+TWIK-related+potassium+channel-1+%28TREK1%29+regulates+immune-cell+trafficking+into+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Endothelial TWIK-related potassium channel-1 (TREK1) regulates immune-cell trafficking into the CNS.</a> Nature Medicine. 19, 1161-1165 (2013).</li>
<li>Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier+in+health+and+chronic+neurodegenerative+disorders.Neuron%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders.Neuron.</a> 57, 178-201 (2008).</li>
<li>Stoll, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+widespread+blood-brain+barrier+alterations+after+cerebral+photothrombosis+as+revealed+by+gadofluorine+M-enhanced+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Transient widespread blood-brain barrier alterations after cerebral photothrombosis as revealed by gadofluorine M-enhanced magnetic resonance imaging.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 29, 331-341 (2009).</li>
<li>Kleinschnitz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid+insensitivity+at+the+hypoxic+blood-brain+barrier+can+be+reversed+by+inhibition+of+the+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid insensitivity at the hypoxic blood-brain barrier can be reversed by inhibition of the proteasome.</a> Stroke. 42, 1081-1089 (2011).</li>
<li>Hawkins, B. T., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier%2Fneurovascular+unit+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+reviews%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease.</a> Pharmacological reviews. 57, 173-185 (2005).</li>
<li>Bazzoni, G., Dejana, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell-to-cell+junctions%3A+molecular+organization+and+role+in+vascular+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+reviews%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell-to-cell junctions: molecular organization and role in vascular homeostasis.</a> Physiological reviews. 84, 869-901 (2004).</li>
<li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier delivery.</a> Drug Discovery Today. 12, 54-61 (2007).</li>
<li>Persidsky, Y., Ramirez, S. H., Haorah, J., Kanmogne, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier%3A+structural+components+and+function+under+physiologic+and+pathologic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroimmunepharmacology+%3A+the+official+journal+of+the+Society+on+NeuroImmune+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier: structural components and function under physiologic and pathologic conditions.</a> Journal of neuroimmunepharmacology : the official journal of the Society on NeuroImmune Pharmacology. 1, 223-236 (2006).</li>
<li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of the blood-brain barrier.</a> Molecular Biotechnology. 30, 57-70 (2005).</li>
<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews Immunology. 7, 678-689 (2007).</li>
<li>Wilson, E. H., Weninger, W., Hunter, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+immune+cells+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Trafficking of immune cells in the central nervous system.</a> Journal of Clinical Investigation. 120, 1368-1379 (2010).</li>
<li>Engelhardt, B., Capture Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((crawl%2C+cross%3A+the+T+cell+code+to+breach+the+blood-brain+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">crawl, cross: the T cell code to breach the blood-brain barriers.</a> Trends in Immunology. 33, 579-589 (2012).</li>
<li>Zonta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron-to-astrocyte+signaling+is+central+to+the+dynamic+control+of+brain+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuron-to-astrocyte signaling is central to the dynamic control of brain microcirculation.</a> Nature Neuroscience. 6, 43-50 (20003).</li>
<li>Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+are+required+for+blood-brain+barrier+integrity+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis.</a> Nature. 468, 562-566 (2010).</li>
<li>Gerhardt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+guides+angiogenic+sprouting+utilizing+endothelial+tip+cell+filopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia.</a> Journal of Cell Biology. 161, 1163-1177 (2003).</li>
<li>Engelhardt, B., Sorokin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+and+the+blood-cerebrospinal+fluid+barriers%3A+function+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+immunopathology%22%5BJournal%5D)">The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction.</a> Seminars in immunopathology. 31, 497-511 (2009).</li>
<li>Perriere, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Puromycin-based+purification+of+rat+brain+capillary+endothelial+cell+cultures.+Effect+on+the+expression+of+blood-brain+barrier-specific+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties.</a> J. Neurochem. 93, 279-289 (2005).</li>
<li>Ruck, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2BNKG2D%2B+T+cells+exhibit+enhanced+migratory+and+encephalitogenic+properties+in+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">CD4+NKG2D+ T cells exhibit enhanced migratory and encephalitogenic properties in neuroinflammation.</a> PLoS One. 8, 81455(2013).</li>
<li>Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+brain+capillary+endothelial+cells+exhibit+improved+barrier+properties+under+the+influence+of+hydrocortisone%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone.</a> Brain Res. 1053, 162-174 (2005).</li>
<li>Gumbleton, M., Audus, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+limitations+in+the+use+of+in+vitro+cell+cultures+to+serve+as+a+permeability+screen+for+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmaceutal+Sci%22%5BJournal%5D)">Progress and limitations in the use of in vitro cell cultures to serve as a permeability screen for the blood-brain barrier.</a> J. Pharmaceutal Sci. 90, 1681-1698 (2001).</li>
<li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracellular+barrier+and+tight+junction+protein+expression+in+the+immortalized+brain+endothelial+cell+lines+bEND.3%2C+bEND.5+and+mouse+brain+endothelial+cell+4%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+%26+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Paracellular barrier and tight junction protein expression in the immortalized brain endothelial cell lines bEND.3, bEND.5 and mouse brain endothelial cell 4.</a> Biological & Pharmaceutical Bulletin. 36, 492-495 (2013).</li>
<li>Omidi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+immortalised+mouse+brain+capillary+endothelial+cell+line%2C+b.End3%2C+as+an+in+vitro+blood-brain+barrier+model+for+drug+uptake+and+transport+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies.</a> Brain Research. 990, 95-112 (2003).</li>
<li>Sacharidou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+lumen+signaling+complexes+control+3D+matrix-specific+tubulogenesis+through+interdependent+Cdc42-+and+MT1-MMP-mediated+events%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Endothelial lumen signaling complexes control 3D matrix-specific tubulogenesis through interdependent Cdc42- and MT1-MMP-mediated events.</a> Blood. 115, 5259-5269 (2010).</li>
<li>Urich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+self-assembled+spheroidal+model+of+the+blood+brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Multicellular self-assembled spheroidal model of the blood brain barrier.</a> Scientific reports. 3, (2013).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תפקוד לקוי של דם למוח-מכשול הוא סימן היכר של מחלות של מערכת העצבים המרכזית מזיקות שונות, למשל פירוט של BBB בטרשת נפוצה באופן נרחב מאפשר הפלישה של מערכת העצבים המרכזית על ידי תאי מערכת חיסון אוטוריאקטיבים ומאפשר מפגש והרס של oligodendrocytes. בשבץ איסכמי שיבוש BBB והיווצרות הבאה של בצקת במוח הם גורמים קריטיים המשפיעים על צמיחת אוטם משנית וההישרדות הכוללת של חולים 6. יתר על כן, על ידי שינויים של BBB באזורים מרוחקים נגעים איסכמיים מוקד יכולים לגרום לשינויים פונקציונליים נרחבים של המוח. עם זאת, המנגנונים המולקולריים שבבסיס הם במידה רבה לא ידועים 5. בניגוד לכך, הצפיפות הגבוהה והמגוון של מובילים בזרימת בBMECs הפונקציונלי מפחיתים את הריכוז של תרופות מועילות כגון chemotherapeutics לממאירויות מוח או אנטיביוטיקה לטיפול במחלות זיהומיות. לכן, הבנה עמוקה יותר של הדם-המוח-ברRier לתפקד בתנאים פיסיולוגיים וpathophysiological נדרש לפתח סוכנים תרופתיים שמסוגלים לווסת באופן ספציפי את תפקוד המחסום בכיוון המועדף 21. אמין במודלים חוץ גופית של BBB הם כלים הכרחיים כדי לחקור את מנגנוני הרגולציה בBBB. שורות תאי אנדותל המוח הונצחו רבות הוקמו והועסקו כבמודלים חוץ גופית BBB 22. שורות תאים אלה מציעים יתרונות מסוימים על פני BMECs העיקרי כפי שהם גדלים מהר יותר ולשמור על מאפייני BBB מסוימים על פני מספר קטעים. עם זאת, שורות תאי אנדותל לא יכולות להחליף באופן מלא לתאים ראשוניים תכונות חשובות כמו משתנות שמתערבבים עם אפשרות ההעברה של ממצאים ניסיוניים למצב in vivo. לדוגמא, שורת תאי אנדותל מוח העכברית bEnd.5 מבטא רמות נמוכות רק של חלבוני צומת הדוקים מופצים discontinuously המוביל לגבוה paracחדירות ellular 23. BEnd.3, עוד שורת תאים המשמשת לעתים קרובות עכברית אנדותל המוח, מדגימה צמתים צפופים ורציפים מופצים הדוקים, התנגדות Transendothelial גבוהה, כמה מובילים בזרימת וחדירות paracellular נמוכות. עם זאת, שכבות תאי bEND.3 לעומת BMECs העיקרי חסרות אפליה של ממש ביחס לחלחול של transcellular מסוים ומצעי paracellular 24. בהכנות של תרביות תאים ראשוניות, תאי זיהום יכולים להפריע באופן משמעותי עם התוקף של ממצאים ניסיוניים. בפרוטוקול המתואר, pyrumicin משמש כסוכן סלקטיבית לתאי אנדותל כדי להשיג טוהר גבוה. עם זאת, בקרת איכות רגילה של תרבית התאים נחוצה באופן בלתי נמנע להבטחת לניסויים אמינות. ישנן מספר שיטות לבקרת איכות, חוץ ממאפיינים טיפוסיים מורפולוגי של תאי האנדותל (ראה איור 1 א &#39;), transendotheliaהתנגדות l עשויה להימדד או הביטוי של סמן תא אנדותל כגון CD31 (ראה איור 1) או גורם פון Willebrand (vWF) עשוי להיות מוערך. מספר תאי אנדותל מוח המבודדים ממוח עכבר אחד הוא יחסית נמוך ולהגדיר את תרבות תאים תקינה לניסויים רבים, מוחם של כמה עכברים צריך להיות ויקווה. מניסיוננו, לפחות 10 עכברים צריכים לשמש לניסוי אחד שעשויה להיות גורם מגביל בהתאם למשאבים של מתקן בעלי החיים בהתאמה. כדי למנוע הטיה או גורמים מבלבלים, עכברים רק עם רקע גנטי וסביבתי זהה יש ייקוו. בניגוד לכך, שור והכנות תא אנדותל המוח חזיריות מספקים מספר רב של תאי האנדותל פנוי במוח במוח אחד. עם זאת, מלבד הרבייה לא מסובכת ודיור, רפרטואר הרחב והולך וגובר של עכברים הטרנסגניים זמינים הופך עכברי העיקרי BMECs כאידאלמודל ללמוד לתפקד דם-המוח-גדר. כמה ממצאים מרכזיים הנוגעים לתפקידי BBB והמנגנונים המולקולריים שבבסיס הגיעו ממחקרים במערכות תרבית רקמת 2D. לאחרונה, מערכות תרבות 3D פותחו 25, שבו תאי אנדותל ממוקמים בתוך מטריצת הקולגן המאפשרת להם ליצור לום ורשתות צינורי. מערכות תרבית תאים החדשות אלה מאפשרים לעוד יותר מדויקים רבייה של תהליכים וכלי דם באורגניזם שלם in vivo. מעורבותם של תאים נוספים של מערכות תרבית תאי NVU ב3D, כגון pericytes והאסטרוציטים עשויה לחולל מהפכה לומדת בתפקוד דם-מוח-מחסום במבחנה; לאחרונה דגמים הראשונים פותחו 26. יש כמה המלצות לפתרון בעיות. קודם כל העבודה סטרילית הוא חיוני לאיכות של תרבית תאי אנדותל. שנית, pyrumycin יש להוסיף רק לתאהתרבות בינונית המשמש ב2 הימים הראשונים של תרבות, יישום עוד עלול להוביל למוות מוגבר MBMEC תא ותפקוד מחסום באיכות נמוכה. שלישית, יש להשתמש באנזימים המיושמים בפרוטוקול זה ומאוחסנים בהתאם להוראות היצרן; אחרת התפקוד התקין שלהם עלול להיות בסכנה. יתר על כן, הציפוי של צלחות תרבית תאים עשוי להיות מתוקן אם תאי האנדותל אינם מייחסים. ריכוזים של פיברונקטין וקולגן עשויים להיות שונה או חלבוני מטריצה ​​אחרים עשויים להתווסף לפתרון הציפוי. לבסוף, גיל, מין, עונה של השנה והתנאים סביבתיים במתקן בעלי החיים הם גורמים חשובים שעשויות להשפיע על איכות בידוד MBMEC וההשוואתיות של ניסויים. יש להבטיח כי תנאים דומים בין ניסויים בלתי תלויים. הפרוטוקול המתואר צריך להיחשב כשיטת neuroimmunological בסיסית לבודד BMECs העכברי. התאים המבודדים יכולים להיות uSED למגוון רחב של יישומים, כדי להעמיק לתוך פונקצית BBB, כגון מבחני הגירה, גן ומחקרי ביטוי חלבון, הערכות אלקטרו או ניסויי חדירות. כאמור לעיל, מערכות תרבית תאי 3D של BMECs עשויות לספק הזדמנויות חדשות לחקור את המנגנונים המורכבים מעורבים בוויסות של BBB בהקשר של NVU. לכן, הבידוד של תאי האנדותל עיקריים יישאר טכניקה לא יסולא בפז בתחום מחקר BBB בעתיד.

<html> monolayers צורת כלי דם במוח בתאי האנדותל (BMEC) שמהווה חלק בלתי נפרד של מחסום הדם-המוח-מחסום מאוד מיוחד (BBB). BMECs הם מחוברים על ידי חלבוני junctional המצורפים קרום במרתף. יחד עם pericytes, תאי שריר חלק, רגלי סוף astrocytic ותאי דם במחזור הם לבנות את היחידה שנקרא עצבים וכלי הדם (NVU) 1. נגד הרעיון הקודם של מחסום בלתי חדיר בין העצבים-המערכת-המרכזית (CNS) בדם ו, NVU הוא ממשק דינמי, מאוד ספציפי ופיקוח השולט על המעבר של נוזלים, מולקולות ותאים בין כלי דם במוח ומערכת העצבים המרכזיים 2 . תפקוד לקוי או חוסר ויסות של NVU עשוי ליזום ו / או לתרום למגוון רחב של עצבים וכלי דם, מחלות זיהומיות, דלקתיות או ניוונית של מערכת העצבים המרכזית, כגון שבץ איסכמי, HIV-אנצפלופתיה, טרשת נפוצה, מחלת פרקינסון 3-6 באלצהיימר או ב. _content &quot;&gt; monolayer BMEC הוא סגור היטב על ידי מורכב junctional היווה של הדוק (TJ) וadherens צמתים 7. ההתנגדות החשמלית הגבוהה וחדירות paracellular הנמוכה של BBB (AJ) מבוססים בעיקר על חלבוני TJ 8. TJS הם מתחמים שהוקמו על ידי החלבונים הטרנסממברני של משפחת claudin וoccludin, שהנם צמודים לשלד התא של תאי האנדותל על ידי מולקולות מתאם, כגון zonulaoccludens (ההסתדרות הציונית) חלבוני ZO1-3 4. צמתים Adherens בעיקר שנאספו על ידי חלבון הקרום נפרד -cadherin כלי דם האנדותל (VE), אשר קשור לשלד התא באמצעות catenins 8. האיטום ההדוק של BBB מונע מעבר חופשי של מצעים ותאים בין הדם לCSF. יוצאים מכלל זה הם מולקולות lipophilic, קטנות עם משקל מולקולרי &lt;400 Da, אשר מסוגל לחצות את BBB על ידי דיפוזיה בתיווך שומנים 9. המעבר של גדולים ו / אומולקולות הידרופילי, כגון גלוקוז, חומצות אמינו, פפטידים, חלבונים ותרופות רבות מוגבלת למערכות מבוקרות מאוד transcellular תחבורת 10, אשר יכול להיות מסווגת לחמש קטגוריות עיקריות: תחבורה בתיווך מוביל, הובלת יון, תחבורת זרימה פעילה, קולטן בתיווך תחבורה, ותיווך caveolae תחבורה 4. מערכות טרנספורטר אלה מסייעים לשמור על הומאוסטזיס של מערכת העצבים המרכזית, אשר נדרש עבור דור אות מדויק, התמרה ואינטגרציה. יתר על כן, BMECs מסוגל לשלוט באופן פעיל את המעבר של מולקולות שונות על ידי הביטוי של מגוון רחב של ectoenzymes. אנזימים אלה הם נקודות על פני התא ולשנות מצעים במשק ומחוצים ספציפיים פוגעים או מאפשרים את המעבר של 11 BBB. ואילו מערכת העצבים המרכזית נחשבת כאיבר חיסוני הרשאות לזמן ארוך, ממצאים חדשים מורים על מערכת ולא דינמית וחזק מוסדרת של surv חיסוניeillance של מערכת העצבים המרכזית. BMECs מעורב באופן ביקורתי ברגולציה של גלגול תא חיסוני. על ידי הביטוי של selectins על הלימפוציטים משטחם באופן סלקטיבי מושרה לצרף לאנדותל באופן רופף. הפרשת כמוקינים שנתקלים עם קולטן ספציפי על כדוריות דם לבנות מובילה לביטוי או שינויי קונפורמציה של integrins ויקוציטים, כגון LFA-1 (פונקצית הלימפוציטים קשור אנטיגן-1) וVLA-4 (אנטיגן-4 מאוד מאוחר). Integrins לתווך הידבקות חברה באמצעות קשירת counterreceptors אנדותל, למשל VCAM-I (מולקולת הידבקות תא וכלי דם),-אני ICAM (מולקולת הידבקות אינטר) המאפשר הגלגול לתוך parenchyma המוח בין אם באמצעות BMECs של 12-14 BBB. אלה וממצאים אחרים מדגישים את התפקיד הפעיל של האנדותל עצמו בהסדרת נדידת תאים חיסונית. יתר על כן, BMECs כחלק מNVU מעורב בוויסות של זרימת דם המוחי linked לדרישות המטבוליות עצביות מקומיות. על גירוי astrocytic תאי האנדותל לייצר חומרי vasoactive כגון תחמוצת חנקן שמובילה להרפיה של תאי שריר חלק בכלי דם 15. אנגיוגנזה ונוירוגנזה בפיתוח, כמו גם בדפוסים מקבילים תכנית המוח הבוגרת ופיתוח ולשתף את נכסים רבים של רגולציה 1, 4. תאי האנדותל מעורבים באופן ביקורתי בתהליכים אלה 16, 17. לסיכום, BMECs מספק תכונות חיוניות כדי להצדיק פיתוח ותפקודה תקין של מערכת העצבים המרכזית. תפקוד לקוי של BBB קשור להפרעות רבות נוירולוגים חמורות. עם זאת, רק מעט מאוד מטרות זוהו בממשק המוח-כלי דם לטיפול ספציפי ויעיל 18. פשוט במודלים חוץ גופית היה בשימוש כדי להבין את המנגנונים מעורבים בתפקוד ורגולציה של מערכות פיזיולוגיות מורכבות עבור loזמן ng. הבידוד כפי שתואר על ידי כתב היד הזה והמחקר במבחנה של BMECs העכברי, בהתחשב במגוון הרחב של נוקאאוט-זני עכבר ספציפי, עשוי לספק הבנה נוספת של פונקצית BBB ורגולציה בתנאים פיסיולוגיים וpathophysiological פתיחת אפיקים טיפוליים חדשים.

<table><tbody><tr><td>bFGF</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי</td></tr><tr><td>BSA</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A9418</td><td>אלבומין סרום בקר</td></tr><tr><td>קולגנאז CLS2</td><td>וורת'ינגטון</td><td>LS004176</td><td>רמה יחסית גבוהה של פעילות פרוטאז</td></tr><tr><td>קולגנאז-דיספאז</td><td>רוש</td><td>10269638001</td><td>קולגנאז מ-V. alginolyticus, Dispase מ-B. polymyxa</td></tr><tr><td>קולגן IV</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>C0543</td><td>מממברנת הבסיס של סרקומה עכברית Engelbreth-Holm-Swarm</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5030</td><td>חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש</td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4513</td><td>Deoxyribonuclease I מלבלב בקר</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6178</td><td>סרום עגל עוברי (נקרא גם סרום בקר עוברי)</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3393</td><td>נוגד קרישה</td></tr><tr><td>PDS</td><td>First Link UK Ltd.</td><td>60-00-850</td><td>סרום שמקורו בפלזמה</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1644</td><td>יש לחמם לטמפרטורת החדר לפני השימוש</td></tr><tr><td>Pyrumycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8833</td><td>יש להשתמש רק ביומיים הראשונים של התרבית</td></tr></tbody></table>

בידוד של תאים הראשוניים murine מוח כלי הדם האנדותל

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

מחסום הדם-מוח מורכב באופן אולטרה-מבני על ידי שכבה חד-שכבתית של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח (BMEC) המחוברים ביניהם על ידי קומפלקס צומת של צמתים הדוקים ונצמדים. יחד עם סוגי תאים אחרים כמו אסטרוציטים או פריציטים, הם יוצרים את היחידה הנוירו-וסקולרית (NVU), המווסתת באופן ספציפי את חילופי הנוזלים, המולקולות והתאים בין הדם ההיקפי למערכת העצבים המרכזית. באמצעות מערכת מורכבת ודינמית זו, BMECs מעורבים בתהליכים שונים השומרים על ההומאוסטזיס של מערכת העצבים המרכזית. תפקוד לקוי של ה-BBB נצפה כצעד חיוני בפתוגנזה של מחלות קשות רבות במערכת העצבים המרכזית. עם זאת, טיפולים ספציפיים וממוקדים מוגבלים מאוד, מכיוון שהמנגנונים הבסיסיים עדיין רחוקים מלהיות מובנים. 
מודלים של בעלי חיים ומודלים במבחנה שימשו באופן נרחב כדי להשיג הבנה מעמיקה של תהליכים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים מורכבים. על ידי צמצום ופישוט ניתן למקד את החקירה בנושא המעניין ולהוציא מגוון גורמים מבלבלים. עם זאת, יכולת ההשוואה ויכולת ההעברה מצטמצמות גם במערכות מודל, שיש לקחת בחשבון לצורך הערכה. המודלים הנפוצים ביותר של בעלי חיים מבוססים על עכברים, בין היתר, בעיקר בשל האפשרויות ההולכות וגדלות של המתודולוגיה. מחקרי מבחנה של BMECs עכברים מבודדים עשויים לאפשר ניתוח מעמיק של תכונותיהם ושל מחסום הדם-מוח בתנאים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים. תובנות נוספות לגבי המנגנונים המורכבים ב-BBB עשויות לספק בסיס לאסטרטגיות טיפוליות חדשות.
פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ראשוניים של עכברים על ידי רצף של שלבי טיהור פיזיקליים וכימיים. נדונים שיקולים מיוחדים לטוהר וטיפוח של MBMECs, כמו גם בקרת איכות, יישומים ומגבלות פוטנציאליים.

מייד לאחר בידוד, BMECs העכברי ותאים לזהם ליצור קונגלומרטים צף במדיום תרבות תא (איור 1 א, יום 0). הטיפול בpyrumycin מוביל לבחירה של BMECs העכברי שכן הם מבטאים רמות גבוהות של מובילים בזרימת כגון P-גליקופרוטאין מוביל להתנגדות ביחס לרעלים. תאי זיהום הם הרבה יותר רגישים לpyrumycin cytotoxicity תיווך 19. במהלך התהליך של בחירת pyrumicin, תאים מזהמים להיכנס מוות של תאים אפופטוטיים או נימקי, ואילו MBMECs מתחיל לצרף לקולגן IV / צלחות פיברונקטין מצופה תרבית תאים (איור 1 א, 1 היום ויום 2). עד שהיום 5, MBMECs להתרבות לצפיפות של כ. 80-90%. הם מאופיינים במראה האופייני דמוי כישור. בנקודת מפגש, הם יוצרים monolayer של תאי קשר עכבות שאינן חופפים צפופים, מיושר אורכית ו( איור 1 א, יום 5). על ידיבחירת pyrumicin, טוהר גבוה של עד 99% MBMEC הוא הגיע, כפי שהודגם על ידי סמן אנדותל תאי CD31 (PECAM1; איור 1). MBMECs יוצר בחוזקה monolayers האטום מחובר על ידי חלבוני צומת הדוקים. אחרי 7 - 8 ימים של תרבות, שכבות תאי אנדותל לבנות את הערכים יציבים להתנגדות חשמלית (לכת ערכים טיפוסיים בין 20-30 Ω x 2 סנטימטר). והקיבול (איור 1 ג ') בנקודת זמן זו מבחני תפקודיים כגון תאי ד' ניסויי הגירה 3, 20,21 וחדירות בדיקות, למשל עם אוונס כחול או Dextran, יש לבצע. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52204/52204fig1highres.jpg" width="500"> איור 1. מורפולוגיים ומאפיינים פונקציונליים של Murine BMECs. (א) במהלך BMECs התרבותי שנצפה על ידי מיקרו אור שידור בזמן הנציגscopy מעל 5 ימים. סרגל קנה מידה חל על כל התמונות. מכתים immunofluorescence (ב ') לCD31 סמן תא אנדותל ביום 5. CD31 (ירוק) ו DAPI (כחול). תאים (ג) היו precultured במשך 5 ימים ולאחר מכן הועברו למערכת אוטומטית ל ניתוח של מאפייני biophysical (התנגדות וקיבוליות). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52204/52204fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח (BMEC) מחוברים זה לזה על ידי חלבוני צומת ספציפיים היוצרים מחסום מווסת מאוד המפריד בין הדם למערכת העצבים המרכזית (CNS), מה שנקרא מחסום דם-מוח (BBB). הבידוד של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ראשוניים במוח העכברים, כפי שנדון בפרוטוקול זה, מאפשר מחקרי מבחנה מפורטים של BBB.

בידוד של תאים הראשוניים Murine מוח כלי הדם האנדותל

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשיג מורין ראשוני, תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח או MBX. זה מושג תחילה על ידי בידוד ולאחר מכן הומוגניזציה של המוח הקדמי החופשי מקרומי המוח של עכברים בוגרים. בשלב השני, הרקמה הומוגנטית מעובדת עוד יותר על ידי עיכול אנזימטי.ואז בשלב האחרון, תאי האנדותל מופרדים על ידי צפיפות, שיפוע, צנטריפוגה ומצופים לתרבית תאים. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בצביעה אימונו-פלואורסצנטית של התאים המבודדים לביטוי CD 31 כדי לאשר את הטוהר של תרבית המכניקה MB. היתרון העיקרי של טכניקה זו של שיטות קיימות, כמו שימוש במוח אימורטליזציה, קווי תאי אנדותל, הוא שהתוצאות המתקבלות עם תאים ראשוניים מספקות העברה טובה יותר למצב in vivo.שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום חיפוש מחסום הדם-מוח, למשל, אילו מסלולים מעורבים בחשיבה של תאי חיסון. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות לקראת טיפול במחלות נוירו-וסקולריות, זיהומיות, דלקתיות או ניווניות של מערכת העצבים המרכזית. מכיוון שתפקוד לקוי של מחסום הדם-מוח מעורב באופן קריטי בפתוגן של מחלות כאלה.הליך זה יודגם על ידי ליסה איפינג (Lisa Eeping), סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלנו. לאחר בידוד המוחות מעשרה, שמונה עד 12 שבועות, C 57 BL, שישה עכברים מאחסנים את הרקמות בחמישה מיליליטר של PBS סטרילי. לאחר מכן, השתמש במלקחיים כדי להסיר את גבעולי המוח, המוח הקטן והתלמי, ולאחר מכן גלגל בזהירות כל מוח על נייר סופג.כדי להסיר את קרומי המוח יש לאסוף את המוחות בצינור בז של 50 מיליליטר ולהוסיף 13.5 מיליליטר של DM em, ואז לטחון את הרקמה תחילה עם פיפטה של 25 מיליליטר, ולאחר מכן עם פיפטה של 10 מיליליטר עד שהמדיה הופכת לחלבית. עכל את הרקמה בקולגנאז וב-DNA ב-37 מעלות צלזיוס על שייקר אורביטלי ב-180 סל"ד. לאחר שעה, הוסף 10 מיליליטר של DM em לתרחיף הרקמה וצנטריפוגה של התאים למשך 10 דקות ב-1000 גרם וארבע מעלות צלזיוס.השליכו את הסופרנטנט תוך הקפדה לא להפריע לכדור הרופף, ולאחר מכן השתמשו בפיפטה של 25 מיליליטר כדי לשלש את הגלולה כ-25 פעמים ב-25 מיליליטר של B-S-A-D-M-E-M. לאחר סיבוב התאים שוב, השתמשו בפיפטת זכוכית שבורה בקוטר גדול כדי להסיר את שכבת המיאלין העליונה החלבית. לאחר מכן הסר את שכבת ה- BSA בעזרת PEs או פיפטה רגילים.השעו מחדש את הגלולה בתשעה מיליליטר של DM em, ולאחר מכן הוסיפו מיליליטר אחד של שטח דיסק קולגנאז ו-0.1 מיליליטר של DNA לתאים. עכל את התמיסה ב-37 מעלות צלזיוס על שייקר המסלול ב-180 סל"ד. במהלך העיכול הגדר שיפוע צפיפות פרקה באולטרה-צנטריפוגה.לאחר שעה, הוסף 10 מיליליטר של DM E em לתרחיף התאים המעוכל כדי לעצור את התגובה ולאחר מכן סובב את התאים והשהה מחדש את הגלולה בשני מיליליטר של DM E em, הוסף את תרחיף התא בזהירות על גבי שיפוע לכל קריאה, ולאחר מכן הפרד את התאים על ידי צנטריפוגה. לאחר ההפרדה, התאים עשויים להיות גלויים כממשק מעונן. טובלים בזהירות לאורך מחט סטרילית לממשק בזווית של 30 מעלות ואוספים כ-12 מיליליטר מהתמיסה.הממשק לרוב אינו נראה כדי להשיג כמה שיותר תאים עם כמה שפחות זיהום. יש לשאוב כמות קטנה של הממשק. בנוסף לכך, יש להעביר את קצה המחט הסטרילית בזהירות וברציפות לכל חלק בממשק, להעביר את התאים לבז חדש של 50 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר של DM em, ולאחר מכן לאחר סיבוב התאים שוב, להשעות את החך ב-0.2 מיליליטר של מדיום תאי אנדותל לכל משטח של סנטימטר מרובע אחד של צלחת תרבית תאים.לאחר מכן, הסר את תמיסת הציפוי מצלחות תרבית תאים מצופות ושטוף כל באר עם PBS סטרילי בשני שלבי כביסה רצופים. לבסוף, שמור על תרביות התאים במדיום תאי אנדותל ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני באינקובטור סטרילי. החלפת המדיום כל יומיים-שלושה מיד לאחר הבידוד.BM e של עכברים ותאים מזהמים יוצרים קונגלומרטים שניתן לצפות בהם צפים בתרבית התאים. טיפול בינוני במיצין מוביל לבחירה של BMAX עכברי מכיוון שתאים מזהמים רגישים הרבה יותר לציטוטוקסיות בתיווך מיצין ו-BM E הלא מושפע מתחיל להיצמד לקולגן ארבע לוחות תרבית תאים מצופים פיברונקטין עד היום החמישי, ה-BME מתרבה לצפיפות של כ-80 עד 90% ויוצר שכבה חד-שכבתית של ארוז היטב, תאים מעוכבי מגע מיושרים לאורך ולא חופפים המאופיינים במראה האופייני שלהם בצורת ציר על ידי בחירת פורם מיצין, טוהר גבוה של עד 99% BMAX עכברי מושג כפי שאושר על ידי סמן תאי האנדותל CD 31. ה-BM E יוצרים חד-שכבות אטומות היטב המחוברות זו לזו על ידי חלבוני צומת הדוקים.לאחר שבעה עד שמונה ימים של תרבית, שכבות תאים אלו בונות ערכים יציבים להתנגדות חשמלית בין 20 ל -30 אוהם בסנטימטר רבוע וקיבול לבבי בשלב זה, ניתן לבצע בדיקות פונקציונליות כגון ניסויי נדידת תאים או בדיקות חדירות עם כחול אוונס או דקסטרן לאחר שליטה. ניתן לבצע טכניקה זו תוך ארבע עד חמש שעות לאחר הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מבחני הגירה, ניסויי חדירות או מדידות אלקטרופיזיולוגיות כדי לענות על שאלות חזון אלה, למשל, כיצד משתנה סחר בתאי חיסון בתנאי ניסוי מסוימים?או כיצד תעלות ברזל מעורבות בוויסות מחסום הדם-מוח? לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד שתן, תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח על ידי הומוגניזציה מכנית, אנזימטית, עיכול וצנטריפוגה של שיפוע צפיפות.

isolation-of-primary-murine-brain-microvascular-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

שיטה זו מתארת ​​כיצד לבודד ולהנציח תאי אנדותל כלי דם ממוח עכבר. אנו מתארים פרוטוקול צעד אחר צעד החל מהומוגניזציה של רקמת מוח, שלבי עיכול, זריעה והנצחה של התאים. בדרך כלל, זה לוקח בערך חמישה שבועות כדי להשיג קו אחיד, שהונצח כלי דם האנדותל תא.

דור של קו הונצח Murine מוח כלי דם האנדותל סלולרי כ<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם מחסום דם מוח

בסרטון זה אנו מדגימים את ההליך לבידוד ותרבית פריציטים מנימי מוח בקר ללא זיהום תאי אנדותל.

בידוד ותרבית של פריציטים ראשוניים במוח: הליך לבידוד ותרבית פריציטים מנימי מוח בקר ללא זיהום בתאי אנדותל

סרטון זה מדגים בידוד של כלי דם שלמים ממוחו של עכבר המהווים את מחסום הדם-מוח (BBB) יחד עם תאי עצב ותאי גלייה. כלי הדם המבודדים יכולים לשמש כמודל במבחנה כדי לחקור את תפקידם בשמירה על הומאוסטזיס מוחי.

בידוד כלי דם במוח של עכבר: פרוטוקול לבידוד כלי דם שלמים מדגימת מוח מורין

וידאו זה מדגים אסטרטגיה קלה ואמינה להכנת תרבויות טהורות של תאי האנדותל מהמוח הקדמי העוברי בתוך 10-12 ימים ויהיה שימושי עבור מחקר התמקד בהיבטים רבים של אנגיוגנזה מוחין.

בידוד והתרבות של תאי האנדותל מהמוח הקדמי עוברי

תאי האנדותל של כלי הדם ממלאים תפקיד משמעותי בהפרעות לב וכלי דם חשובות רבות. מאמר זה מתאר שיטה פשוטה לבידוד והרחבה של תאי אנדותל מאבי העורקים של העכבר ללא שימוש בציוד מיוחד. הפרוטוקול שלנו מספק אמצעי יעיל לזיהוי מנגנונים בפיזיופתולוגיה של תאי אנדותל.

בידוד והתרבות ראשית של לתאי אנדותל עכבר אב העורקים

אנו מתארים פרוטוקול המאפשר טיהור של תא כלי הדם של מוח העכבר. כלי מוח מבודדים כוללים תאי אנדותל המקושרים בצמתים הדוקים ומוקפים בלמינה בסיסית רציפה, פריציטים, תאי שריר חלק בכלי הדם, כמו גם ממברנות אסטרוגליאליות סביב כלי הדם.

טיהור של כלי מוח עכבר

גזע אבות היווצרות הדם תאים (HSPC) נובעים מתאי אנדותל מיוחדים (hemogenic) במהלך הפיתוח, עדיין מעט מאוד ידוע על התהליך שבו כמה תאי אנדותל לציין להפוך להרכיב דם. אנו מדגימים שיטה המבוססת זרימת cytometry המאפשרת בידוד סימולטני של תאי hemogenic האנדותל HSPC מרקמות עובריות בעכברים.

בידוד של Murine העוברי Hemogenic לתאי אנדותל

שמירה על כיסוי מחסום דם מוחי היא המפתח להומיאוסטזיס של מערכת העצבים המרכזית. פרוטוקול זה מתאר טכניקות חוץ גופית כדי לתמצת את התהליכים הבסיסיים הפתולוגיים כי לווסת דם מוח המכשול הכיסוי.

ב מבחני מבחנה כדי להעריך דם מוח מחסום כמו רשת כלי שיטפון ושיבוש

Microvascular תאי אנדותל של שרירי השלד (MMEC) לעצב את הדופן הפנימית של שריר נימים ולווסת את שניהם, חילופי נוזלים/מולקולות והעברה של תאים (חיסוניים) בין רקמת שריר, דם. בידוד של MMEC מאתר ראשי, כפי שמתואר כאן, מאפשר מקיף חקירות במבחנה של יחידת"myovascular".

בידוד של תאי אנדותל Microvascular ראשי שריר השלד מאתר

במאמר זה, תאי אנדותל ריאתיים ראשוניים בודדו וגודלו בתרבית מעכברים ילודים.

בידוד תאי אנדותל ריאה ראשוניים של עכבר

למדו לבודד תאים אנדותליים מיקרו-ווסקולריים מוחיים ראשוניים מעכברים לחקר מחסום הדם-מוח. השיטה משלבת הומוגניזציה מכנית, עיכול אנזימטי וצנטריפוגה בגרדיאנט צפיפות לקבלת תרביות טהורות לניסויים תפקודיים.

בידוד של תאים הראשוניים Murine מוח כלי הדם האנדותל

גלה סרטונים נוספים