בידוד של תאים הראשוניים Murine מוח כלי הדם האנדותל

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשיג מורין ראשוני, תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח או MBX. זה מושג תחילה על ידי בידוד ולאחר מכן הומוגניזציה של המוח הקדמי החופשי מקרומי המוח של עכברים בוגרים. בשלב השני, הרקמה הומוגנטית מעובדת עוד יותר על ידי עיכול אנזימטי.

ואז בשלב האחרון, תאי האנדותל מופרדים על ידי צפיפות, שיפוע, צנטריפוגה ומצופים לתרבית תאים. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בצביעה אימונו-פלואורסצנטית של התאים המבודדים לביטוי CD 31 כדי לאשר את הטוהר של תרבית המכניקה MB. היתרון העיקרי של טכניקה זו של שיטות קיימות, כמו שימוש במוח אימורטליזציה, קווי תאי אנדותל, הוא שהתוצאות המתקבלות עם תאים ראשוניים מספקות העברה טובה יותר למצב in vivo.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום חיפוש מחסום הדם-מוח, למשל, אילו מסלולים מעורבים בחשיבה של תאי חיסון. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות לקראת טיפול במחלות נוירו-וסקולריות, זיהומיות, דלקתיות או ניווניות של מערכת העצבים המרכזית. מכיוון שתפקוד לקוי של מחסום הדם-מוח מעורב באופן קריטי בפתוגן של מחלות כאלה.

הליך זה יודגם על ידי ליסה איפינג (Lisa Eeping), סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלנו. לאחר בידוד המוחות מעשרה, שמונה עד 12 שבועות, C 57 BL, שישה עכברים מאחסנים את הרקמות בחמישה מיליליטר של PBS סטרילי. לאחר מכן, השתמש במלקחיים כדי להסיר את גבעולי המוח, המוח הקטן והתלמי, ולאחר מכן גלגל בזהירות כל מוח על נייר סופג

כדי להסיר את קרומי המוח יש לאסוף את המוחות בצינור בז של 50 מיליליטר ולהוסיף 13.5 מיליליטר של DM em, ואז לטחון את הרקמה תחילה עם פיפטה של 25 מיליליטר, ולאחר מכן עם פיפטה של 10 מיליליטר עד שהמדיה הופכת לחלבית. עכל את הרקמה בקולגנאז וב-DNA ב-37 מעלות צלזיוס על שייקר אורביטלי ב-180 סל"ד. לאחר שעה, הוסף 10 מיליליטר של DM em לתרחיף הרקמה וצנטריפוגה של התאים למשך 10 דקות ב-1000 גרם וארבע מעלות צלזיוס.

השליכו את הסופרנטנט תוך הקפדה לא להפריע לכדור הרופף, ולאחר מכן השתמשו בפיפטה של 25 מיליליטר כדי לשלש את הגלולה כ-25 פעמים ב-25 מיליליטר של B-S-A-D-M-E-M. לאחר סיבוב התאים שוב, השתמשו בפיפטת זכוכית שבורה בקוטר גדול כדי להסיר את שכבת המיאלין העליונה החלבית. לאחר מכן הסר את שכבת ה- BSA בעזרת PEs או פיפטה רגילים.

השעו מחדש את הגלולה בתשעה מיליליטר של DM em, ולאחר מכן הוסיפו מיליליטר אחד של שטח דיסק קולגנאז ו-0.1 מיליליטר של DNA לתאים. עכל את התמיסה ב-37 מעלות צלזיוס על שייקר המסלול ב-180 סל"ד. במהלך העיכול הגדר שיפוע צפיפות פרקה באולטרה-צנטריפוגה.

לאחר שעה, הוסף 10 מיליליטר של DM E em לתרחיף התאים המעוכל כדי לעצור את התגובה ולאחר מכן סובב את התאים והשהה מחדש את הגלולה בשני מיליליטר של DM E em, הוסף את תרחיף התא בזהירות על גבי שיפוע לכל קריאה, ולאחר מכן הפרד את התאים על ידי צנטריפוגה. לאחר ההפרדה, התאים עשויים להיות גלויים כממשק מעונן. טובלים בזהירות לאורך מחט סטרילית לממשק בזווית של 30 מעלות ואוספים כ-12 מיליליטר מהתמיסה.

הממשק לרוב אינו נראה כדי להשיג כמה שיותר תאים עם כמה שפחות זיהום. יש לשאוב כמות קטנה של הממשק. בנוסף לכך, יש להעביר את קצה המחט הסטרילית בזהירות וברציפות לכל חלק בממשק, להעביר את התאים לבז חדש של 50 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר של DM em, ולאחר מכן לאחר סיבוב התאים שוב, להשעות את החך ב-0.2 מיליליטר של מדיום תאי אנדותל לכל משטח של סנטימטר מרובע אחד של צלחת תרבית תאים.

לאחר מכן, הסר את תמיסת הציפוי מצלחות תרבית תאים מצופות ושטוף כל באר עם PBS סטרילי בשני שלבי כביסה רצופים. לבסוף, שמור על תרביות התאים במדיום תאי אנדותל ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני באינקובטור סטרילי. החלפת המדיום כל יומיים-שלושה מיד לאחר הבידוד.

BM e של עכברים ותאים מזהמים יוצרים קונגלומרטים שניתן לצפות בהם צפים בתרבית התאים. טיפול בינוני במיצין מוביל לבחירה של BMAX עכברי מכיוון שתאים מזהמים רגישים הרבה יותר לציטוטוקסיות בתיווך מיצין ו-BM E הלא מושפע מתחיל להיצמד לקולגן ארבע לוחות תרבית תאים מצופים פיברונקטין עד היום החמישי, ה-BME מתרבה לצפיפות של כ-80 עד 90% ויוצר שכבה חד-שכבתית של ארוז היטב, תאים מעוכבי מגע מיושרים לאורך ולא חופפים המאופיינים במראה האופייני שלהם בצורת ציר על ידי בחירת פורם מיצין, טוהר גבוה של עד 99% BMAX עכברי מושג כפי שאושר על ידי סמן תאי האנדותל CD 31. ה-BM E יוצרים חד-שכבות אטומות היטב המחוברות זו לזו על ידי חלבוני צומת הדוקים.

לאחר שבעה עד שמונה ימים של תרבית, שכבות תאים אלו בונות ערכים יציבים להתנגדות חשמלית בין 20 ל -30 אוהם בסנטימטר רבוע וקיבול לבבי בשלב זה, ניתן לבצע בדיקות פונקציונליות כגון ניסויי נדידת תאים או בדיקות חדירות עם כחול אוונס או דקסטרן לאחר שליטה. ניתן לבצע טכניקה זו תוך ארבע עד חמש שעות לאחר הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מבחני הגירה, ניסויי חדירות או מדידות אלקטרופיזיולוגיות כדי לענות על שאלות חזון אלה, למשל, כיצד משתנה סחר בתאי חיסון בתנאי ניסוי מסוימים?

או כיצד תעלות ברזל מעורבות בוויסות מחסום הדם-מוח? לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד שתן, תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח על ידי הומוגניזציה מכנית, אנזימטית, עיכול וצנטריפוגה של שיפוע צפיפות.