Name: ההכנה וRespirometric הערכה של המיטוכונדריה מבודדת מרקמת שריר שלד מתקבלת על ידי Percutaneous מחט ביופסיה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: למדו להכין מיטוכונדריה מבודדות משריר שלד לבדיקת שליטה נשימתית באמצעות ביופסיית מחט עורית. שיטה זו דורשת רק 20 מ"ג רקמה ומתאימה למחקר קליני.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לד"ר מארק ליסה, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת בוסטון, דיונים מועילים; גב' קארין מרפי, גב' הת'ר גרגורי ומר ג'ון סטון, כולם מבית הספר לרפואה של ווייק פורסט, על הסיוע הטכני המועיל בפיתוח פרוטוקול זה.

הערה: הפרוטוקול המתואר אושר על ידי מועצת המנהלים מוסדי הסקירה של בית הספר ווייק פורסט לרפואה. הסכמה מדעת הושגה בכתב. כל המשתתפים היו מבוגרים בריאים מבוגרים (65-79 שנים) משני המינים, עם BMI שנע 23-35. 1. ביופסיה של שריר שלד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כפי שתואר לעיל, 9 לבצע את כל הביופסיות בשעתי הבוקר המוקדמות לאחר O / N מהיר. שאל את הנושאים להימנע מנטילת אספירין, מרשם ותרופות נוגדות דלקת שאינן סטרואידים מעבר לדלפק, או תרכובות אחרות שעשויים להשפיע על דימום, טסיות דם, או שטפי דם בשבוע שלפני הביופסיה. שאל את המשתתפים להימנע גם מכל פעילות מאומצת במשך לפחות 36 שעות לפני הביופסיה. הערה: שריר מתקבל מvastus lateralis באמצעות טכניקת ביופסית מחט percutaneous עם מחט מלעורית בהרדמה מקומית עם לידוקאין 1%. אין סיבוכים רפואיים או oיס דיווח על תופעות לוואי מהתהליך שהתרחשו ביחידת המחקר הקלינית שלנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה: הליך הביופסיה תאר מותאמת מזה של Bergstrom 10. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה, באופן מקומי לנהל בלטפל ידוקאין 1% לא לחדור לשריר. בצע את זה עם תקופת ההמתנה 10 דקות כדי לאפשר אלחוש מספיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את הביופסיות מהבטן של השריר (אזור אמצע השריר בין ההכנסה ומוצא) הימנעות אזורי subfascial וmyotendonous. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במחט מלעורית (מכשיר לשימוש חוזר יניקה סייעה בצד חיתוך חלון וגליל חיתוך פנימי) ומעקב &quot;פופ&quot; fascial או התנגדות של fascia כמדריך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאמוד את העומק עם מחט ההרדמה, ואז שוב מרגיש את זה עם להב סכין המנתחים הצר ולעשות חתך 4-5 מ&quot;מ דרך fascia. לקדם את המחט דרך החתך עד שמוכנס לתוך השריר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוףדגימות מרובות עם החלון פנו לכיוונים שונים. החל יניקה רציפה באמצעות מזרק 60 סמ&quot;ק תוך קידום ונסיגת דגימות שריר לתוך מחט percutaneous 03:58 פעמים בכיוונים שונים. להפסיק את השאיבה ולהסיר את המחט. הערה: כל מעבר (הכנסה והוצאה של מחט) לא צריכה לקחת פחות מדקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לך עוזר להפעיל לחץ משרד לנקב אתר במשך 5 דקות כדי להקים עצירת דימום. נתק מחט מצינור יניקה ולהסיר בזהירות דגימות שריר מהחלון והחבית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך לעבור שני אם יש צורך יותר שרירים על ידי חזרה על ההליך לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל קרישי דם גלויים ממדגם השרירים באמצעות מלקחיים, לשקול את המדגם, ואת המקום באופן מיידי בצינור המכיל DPBS קר כקרח. הערה: התשואה הממוצעת באמצעות מתודולוגיה זו היא 150 ± 20 מ&quot;ג. </li></ol></li></ol> 2. בידוד מיטוכונדריאלי &lt;ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרי להכין Chappel-פרי (CP) ומאגרי מיטוכונדריאלי Assay הפתרון (MAS) (טבלה 1) ביום של הניסוי, או aliquot ולאחסן אותם ב -20 ° C. הכן את התרכובות בsulfoxide דימתיל בריכוז של 2.5 מ&quot;מ וaliquot ולאחסן ב -20 ° C. השתמש בaliquots החיץ והמתחם המאוחסן ב -20 ° C בתוך 2 חודשים מיום ההכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר רקמת חיבור גלויה מהמדגם באמצעות מספריים ופינצטה חדים; במידת צורך שימוש במיקרוסקופ על הצעד הזה. ביסודיות לשטוף דגימות 3-4 פעמים עם חיץ DPBS קר כקרח כדי להסיר דם. שמור את הדגימות על DPBS קר כקרח ותהליך בהקדם האפשרי, נזהר שלא יעלו על יותר מ -45 דקות מביופסיה. לנקוט אמצעי זהירות כדי להסיר בזהירות כל גידים או רקמת שומן מן מדגם השריר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד קוצצים את רקמת השריר לחתיכות דקות באמצעות זוג סטרילי מספריים ולהשעות ב 500 μl ליחסי ציבור המכילים 1 מיליליטר מדד המחירים לצרכןoteinase (Nagarse) בריכוז של רקמה / g 0.2 מ&quot;ג. בצע את זה עם דגירה 5 דקות ב RT ולאחר מכן להעביר לקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize הרקמות טחונות שטופלו בNagarse באמצעות homogenizer אוטומטי. שמור את המדגם על קרח לאורך כל התהליך הזה. Homogenize כל דגימת רקמה ארבע פעמים, כל פעם לדופק של 2 שניות, באמצעות homogenizer האוטומטי בהגדרת מהירות של 10,000 סל&quot;ד. שטוף את הבדיקה עם אתנול 70% ואחריו מים מזוקקים בין רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הרקמה הומוגני עם נפח שווה של CP אני (500 μl עד 1 מיליליטר) ונפח 2x של CP השני (1 מיליליטר 2 מ&quot;ל), ולאסוף את התוכן בצינור צנטריפוגות ו צנטריפוגות ב 600 XG, 4 ° C ל 10 דקות. להעביר את supernatant דרך בד גבינה רטוב, לאסוף התסנין וזורקים את הכדור, ובכך להסיר את רוב השברים שאינן במיטוכונדריה. </li></ol> 3. כביסה המיטוכונדריה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה supernatant מהצעד מעל גיל 10,<html> 000 XG, 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. להשעות את גלולה ב 4 מיליליטר של חיץ CP II ו צנטריפוגות נוספת ב10,000 XG, 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הערה: במקרים נדירים, גלולה דקה של דם נוצר מתחת לגלולה של המיטוכונדריה. במקרה זה, להסיר את גלולה המיטוכונדריה על ידי שאיפה עדינה עם חיץ CPII. ניתן להימנע בשלב זה על ידי שטיפה יסודית דם בשלב 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות את גלולה שהתקבלה ב2ml שלי CP חיץ. בשלב זה להשתמש aliquot קטן מהשעיה זו להערכת חלבון. Resuspend המדגם שנותר בCP אני חיץ צנטריפוגות כאמור לעיל. להשעות את גלולה הסופית בסכום מינימאלי (200 μl) של מיטוכונדריאלי Assay פתרון (MAS). הערה: חלבון assayed בשלב זה כי אני CP חיץ אין BSA, ואילו MAS בי הדגימות תהיה מאוחר יותר הופסקה אין לי BSA בזה. </li></ol> 4. הערכת תוכן מיטוכונדריאלי על ידי מדידת ריכוז חלבון באמצעות ערכת assay חלבון BCA class = &quot;jove_content&quot;&gt; הערה: השתמש ריכוז זה כדי לחשב את כמות המיטוכונדריה המשמשת לטעינה על microplate 24 גם למדידות respirometric, או לניסויי כתם מערביים. קח בחשבון את הגורם לדילול (10) לחישוב ריכוז החלבון. 5. בצעו את מבחני XF כפי שתואר על ידי רוג&#39;רס, GW, et al. 12 הערה: דמיין את צריכת שיעור O 2 (OCR) בpmoles O 2 / min, או רמות מוחלטות של O 2 ו- pH בפלט נתונים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 1x MAS להכין תרכובות להיות מוזרק. הוסף ריכוז 10x של התרכובות לספירה היציאות לתת ריכוז סופי כדלקמן: נמל, ADP [&#39;אדנוזין 5 -diphosphate, 2 מ&quot;מ, 50 μl]; היציאה B, oligomycin (2 מיקרומטר, 55 μl); הנמל C, FCCP [4 phenylhydrazone קרבוניל ציאניד (trifluoromethoxy), 6 מיקרומטר, 60 μl]; והיציאה D, 2 מיקרומטר antimycin-A (65 μl). הכןנפח מספיק של תרכובות למספר הנדרש של בארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את הכמות האופטימלית של המיטוכונדריה על ידי טיטרציה. לדוגמא, עומס 1.0 מיקרוגרם, 2.5 מיקרוגרם, ו -5.0 מיקרוגרם של המיטוכונדריה בכל טוב ב-50 μl נפח של MAS 1x קר כקרח המכיל מצע. כדי למזער את השונות בין בארות, לדלל 10x המיטוכונדריה ראשון במצע 1x MAS + קר. בשלב הבא, לספק 50 μl של השעיה זו היטב כל אחד (מלבד בארות תיקון רקע). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצלחת XG ב 2000, 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, בעדינות להוסיף 450 μl של succinate 1x MAS + (10 מ&quot;מ) וrotenone (2 מיקרומטר) (תנאים ראשוניים; ראה להלן) זה טוב. הצג את המיטוכונדריה תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח עמידה הומוגני וללפני העברת הצלחת למנתח XF. הערה: תנאים הראשוניים המשמשים יהיה תלוי אם הנשימה היא מונעת על ידי שני המורכבים ETC או מורכב II. לנשימה מונחה השנייה מורכבת, להשתמש succinate (10 מ&quot;מ) וrotenone (2 מיקרומטר) כתנאים ראשוניים. בלוקים Rotenone אני וsuccinate המורכבים מספק דלק למורכב II (dehydrogenase succinate). ללמוד נשימה מונעת על ידי מורכב, השתמש באחת פירובט וmalate, כל בריכוז סופי של 5 מ&quot;מ או גלוטמט וmalate כל בריכוז סופי של 10 מ&quot;מ כתנאים ראשוניים. האחרון יכול לסייע בהבחנה בין תפקוד לקוי של מעגל חומצת tricarboxylic ותחבורה מצע. ללמוד נשימה מונעת על ידי גם אני וגם מורכב השני מורכבים, כולל פירובט וsuccinate ללא rotenone או malate כתנאים ראשוניים. השתמש קרניטין palmitoyl כמצע לβ-חמצון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצף למדוד את הנשימה המיטוכונדריאלי בזמן אמת באמצעות respirometer ידי תכנות כפי שתואר קודם לכן 12. השתמש בהגדרות לrespirometer ניתן בטבלה 2. הערה: הסבר קצר על מדינות נשימה המיטוכונדריאלי שונות הן כדלקמן: </li><li&gt; מדינה 2 = מדינה בשילוב עם הווה מצע; מדינה 3 = phosphorylating נשימה בנוכחות להרוות ADP; = שאינה phosphorylating נשימה המדינה o 4 הנגרמת על ידי oligomycin; 3U מדינה = נשימה כשהתיר מקסימאלי מגורה על ידי FCCP uncoupler; נשימה = נשימה שאינה המיטוכונדריה הנותרת לאחר מורכב עיכוב III על ידי antimycin-. כמו כן יש לציין כי, באורך של מדידת OCR בשילוב עם ריכוז המיטוכונדריה יכול להשפיע על נתונים על ידי המדלל את החמצן בתקופות המדידה. </li></ol> 6. מערבי כתם הערה: קבע את סמן המיטוכונדריה COX IV וGAPDH רקמה השלם על ידי מערבי סופג כדי להבטיח העשרה של המיטוכונדריה במדגם הסופי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את המיטוכונדריה מבודדת ותמצית רקמה שלמה על ידי ג&#39;לים polyacrylamide סולפט dodecyl נתרן 12%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את החלבונים על הממברנה פלואוריד polyvinylidene (PVDF).</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם נוגדן COX IV (1: 20,000), ואחריו peroxidase חזרת (HRP) -conjugated נוגדנים משני. לקביעת GAPDH, להפשיט את הכתם ובדיקה עם נוגדנים חד שבטי GAPDH (1: 2,000). הערה: אם הבדלים בזיהום ER הם בעלי העניין, כוללת סמני ER כגון ERp72, calnexin, או calreticulin בניתוח. </li></ol>

<ol><li>Fernandez-Vizarra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondria+for+biogenetical+studies%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update.</a> Mitochondrion. 10, 253-262 (2010).</li>
<li>Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+biogenetically+competent+mitochondria+from+mammalian+tissues+and+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells.</a> Methods. 26, 292-297 (2002).</li>
<li>Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+isolation+from+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial isolation from skeletal muscle.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. , (2011).</li>
<li>Iglesias-Gonzalez, J., Sanchez-Iglesias, S., Beiras-Iglesias, A., Soto-Otero, R., Mendez-Alvarez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+isolating+rat+brain+mitochondria+with+high+metabolic+activity%3A+effects+of+EDTA+and+EGTA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for isolating rat brain mitochondria with high metabolic activity: effects of EDTA and EGTA.</a> Journal of Neuroscience Methods. 213, 39-42 (2013).</li>
<li>Gross, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+functional+mitochondria+from+rat+kidney+and+skeletal+muscle+without+manual+homogenization%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization.</a> Analytical Biochemistry. 418, 213-223 (2011).</li>
<li>Franko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+isolation+of+pure+and+functional+mitochondria+from+mouse+tissues+using+automated+tissue+disruption+and+enrichment+with+anti-TOM22+magnetic+beads%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient isolation of pure and functional mitochondria from mouse tissues using automated tissue disruption and enrichment with anti-TOM22 magnetic beads.</a> PloS One. 8, e82392(2013).</li>
<li>Chappell, J. B., Perry, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+respiratory+and+adenosinetriphosphatase+activities+of+skeletal-muscle+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">The respiratory and adenosinetriphosphatase activities of skeletal-muscle mitochondria.</a> The Biochemical Journal. 55, 586-595 (1953).</li>
<li>Tyrrell, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respirometric+Profiling+of+Muscle+Mitochondria+and+Blood+Cells+Are+Associated+With+Differences+in+Gait+Speed+Among+Community-Dwelling+Older+Adults%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol+A+Biol+Sci+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Respirometric Profiling of Muscle Mitochondria and Blood Cells Are Associated With Differences in Gait Speed Among Community-Dwelling Older Adults.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. , (2014).</li>
<li>Nicklas, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+of+physical+function+to+vastus+lateralis+capillary+density+and+metabolic+enzyme+activity+in+elderly+men+and+women%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Clinical+and+Experimental+Research%22%5BJournal%5D)">Relationship of physical function to vastus lateralis capillary density and metabolic enzyme activity in elderly men and women.</a> Aging Clinical and Experimental Research. 20, 302-309 (2008).</li>
<li>Bergstrom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Percutaneous+needle+biopsy+of+skeletal+muscle+in+physiological+and+clinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+Journal+of+Clinical+and+Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Percutaneous needle biopsy of skeletal muscle in physiological and clinical research.</a> Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. 35, 609-616 (1975).</li>
<li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PloS One. 6, e21746(2011).</li>
<li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+structure+and+function+are+disrupted+by+standard+isolation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods.</a> PloS One. 6, e18317(2011).</li>
</ol>

המחבר, ג'ורג' רוג'רס, הוא עובד של Seahorse Bioscience המייצרת את המכשיר המשמש במאמר זה. דמי הגישה הפתוחה נתמכו על ידי Seahorse Biosciences.

מיטוכונדריה המבודדת לעתים קרובות מנוצלות במחקרים הבוחנים את תפקידה של פונקצית ETC, כמו גם פעילויות אחרות במיטוכונדריה, הכולל טיסת מצע ותפקוד מחזור TCA. מבחני Respirometric באמצעות אברונים מבודדים מאפשרים בדיקה ישירה של תהליכים בסיסיים של זרחון חמצוני ומאפיינים פנימיים של וכו &#39; פרופיל Respirometric של מיטוכונדריה המבודדת בהשוואה לתאים שלמים או סיבי שריר permeabilized יש את היתרונות של פרשנות נתונים קלה יחסית והעדר &quot;הפרעות&quot; מתהליכים או שינויים שאינן המיטוכונדריה במסה / biogenesis המיטוכונדריה. נורמליזציה של הנתונים מבוססת על תכולת חלבון במיטוכונדריה, ובכך לאפשר השוואה צולבת פשוטה של ​​המיטוכונדריה בין דגימות. פרופיל Respirometric של מיטוכונדריה המבודדת הוא גישה מועדפת כאשר מטרת המחקר היא לקבוע מנגנוני יסוד וזיהוי מטרות ספציפיות כגון רכיב ETCs / מתחמים, או מנגנוני תחבורה המיטוכונדריה. תאר הוא פרוטוקול לביופסיה של שריר ובידוד של המיטוכונדריה תפקודית מדגימות רקמה קטנות. שיטה זו מניבה תוצאות לשחזור בין המשתמשים עקב ניצול homogenizer אוטומטי לעומת יד מופעלת homogenizers dounce. בידוד של המיטוכונדריה יכול להתבצע עם קטן כמו 20 מ&quot;ג של רקמת שריר. כמות המיטוכונדריה מבודדת שניתן להשיג מגודל מדגם זה היא מספיק כדי לרוץ respirometry מבוסס צלחת סוסון הים תוך השארת המיטוכונדריה עודפת לניסויים אחרים ואחסון עבור ניתוחים מולקולריים נוספים. ניתן לציין כי שיטה זו יכולה להיות מתורגמת לXF 96, שבו כמויות קטנות עוד יותר של מיטוכונדריה יכולות לשמש (1-2 מיקרוגרם לכל טוב). כמה פרוטוקולים למיטוכונדריה בידוד להסתמך על homogenizers dounce לשיבוש רקמות ראשוני. חסרון של שיטה זו הוא הידיים על טבעה של הרקמה הראשוניתהומוגניזציה. הכוח והמהירות של העלי בhomogenizer יכולים להשתנות באופן משמעותי בין מפעילי 6. זה יכול לגרום לוריאצית ניסוי לניסוי, כמו גם וריאציה מעבדה למעבדה, ומוביל לקושי בהשוואת הנתונים בין ניסויים. זה מדאיג במיוחד במחקרי התערבות אנושיים כאשר נתונים ממשתתפים נאספו בנקודות זמן שונות, בדרך כלל לפני ואחרי הטיפול, ובאופן פוטנציאלי באתרים מרובים. אנו משתמשים בhomogenizer אוטומטי לגישה עקבית יותר שמניבה תוצאות לשחזור יותר עם וריאציה אדם לאדם מוגבלת. המהירות של הכנה גם עושה גישה זו מתאימה לטיפול בדגימות מרובות באותו הזמן. בדרך כלל, ניתן לבצע עד שלושה ניסויים ביום אחד. מגבלות אפשריות של הטכניקה המתוארת כאן נובעות מהשימוש באברונים מבודדים והשימוש בפורמט המבוסס על צלחת. לדוגמא, פיקארד et al. יש לי שדstrated שהמיטוכונדריה מבודדת בעלי מאפיינים פונקציונליים שונים במהותו מאלה של המיטוכונדריה שלמה בmyofibers permeabilized. הם הציעו כי טכניקות בידוד המיטוכונדריה לגרום לתפקוד bioenergetic שהשתנה, כגון RCR גדל באופן משמעותי בהשוואה לmyofibers permeabilized מלווה בייצור מיני חמצן תגובתי יותר 13. בהשוואה לסיבי שריר permeabilized, בידוד של המיטוכונדריה דורש זמן הכנה ארוך יותר. כמו כן, אובדן התוכן סלולארי מפחית את הרלוונטיות פיסיולוגיות, משהו שנשמר בתאים שלמים וסיבים אפילו permeabilized. השימוש בrespirometry מבוסס צלחת עם היתרי טכניקה המתוארים לשכפל ריצות לדגימה. עם זאת, המיטוכונדריה חייבת לדבוק בתחתית כל הטוב. תצורה זו היא שונה מסביבת הרגילה שלהם ועלולה להשפיע על מאפיינים פונקציונליים. בנוסף, יש לציין כי שימוש בפרוטוקול זה לבידוד המיטוכונדריה יס,דואר עדיין עשוי להיות זיהום מreticulum endoplasmic (ER) בהכנת המיטוכונדריה. הבדלים בזיהום ER עשויים להשפיע על קביעת תוצאות תשואה וההשפעה של המיטוכונדריה. לסיכום, מחקר זה מציג נתונים המאשרים מיטוכונדריה מבודדת מרקמות באמצעות הליך זה היא פונקציונלי פעילה וניתן להשתמש בם ללימודים / יישומים הדורשים מיטוכונדריה מבודדת באיכות גבוהה מסכום המינימלי של דגימות שרירי שלד. היתרון של שיטה זו הוא ש: i) אפשר לבודד המיטוכונדריה מכמויות מינימליות של שרירי שלד, ii) ההליך הוא מהיר, iii) עם טכנולוגית הצלחת מבוססת, אפשר להריץ דוגמאות רבות באותו הזמן, וiv) יש מספיק רקמה עודפת ומיטוכונדריה המבודדת לאחר assay bioenergetic לאחסון מדגם וחקירות ביולוגיות מולקולריות אחרות.

המיטוכונדריה הם אתרי ייצור האנרגיה העיקריים בתא ויש לי תפקידים חשובים בהזדקנות, כמו גם גיל הקשורות בהפרעות שונות כמו מחלות לב וכלי דם, מחלת אלצהיימר, סוכרת, סרטן, השמנת יתר ו. פרופיל Respirometric של מיטוכונדריה המבודדת מספק ניתוח ישיר של שרשרת הובלת אלקטרונים פונקציה (ETC) ותרם באופן משמעותי להבנת ביולוגיה של המיטוכונדריה שלנו ותפקידה בבריאות ובחוליים. מיטוכונדריה המבודדת משמשות ללמוד היבטים שונים של יו-אנרגיה כמו, תחבורת מצע, פעילות synthase ATP, דליפת פרוטון, וכו &#39;המתודולוגיה שתוארה בכתב היד הזה כבר מותאמת כדי לאפשר ניתוח respirometric של מיטוכונדריה מבודדת מביופסיות רקמות שריר שלד התקבלו מבני אדם. פרוטוקול הביופסיה שתואר בכתב היד הזה נוצל על ידי צוות שלנו במשך 12 השנים האחרונות. הקבוצה שלנו ביצעה מעל 700 נהלים במבוגרים בגילים שונים,עד 90 שנים ישנות, ועם תנאי מחלה כרוניים שונים ללא כל בעיות בטיחות שליליות. היבט מרכזי של פרוטוקול זה הוא שזה תוכנן במיוחד כדי לנצל את הכמויות מינימליות של רקמה, ובכך להקל על השימוש בה במחקרים קליניים. פרוטוקולים שונים פותחו לבידוד המיטוכונדריה. פרננדז-Vizarra et al. 1,2 תאר שיטה לבידוד המיטוכונדריה מרקמות עכברוש שונות, כמו גם תאים בתרבית. גרסיה-Cazarin et al. 3 דיווח שיטה לבידוד המיטוכונדריה משרירי שלד מחולדה ועכבר. שיטה לבידוד המיטוכונדריה ממוח חולדה כבר דווח על ידי איגלסיאס-גונזלס et al. 4 גרוס, et al. 5 דיווחו שיטה של בידוד המיטוכונדריה באמצעות barocycler ו / או מגרסת PCT. לאחרונה, פרנקו ואח &#39;. 6 דווח שיטה של בידוד המיטוכונדריה מועשר באמצעות אנטי-TOM22 חרוזים מגנטיים. בעוד הפרוטוקולים הללו להניב תוצאות מצוינות, דרישות גודל רקמה הן גבוהות בהשוואה לשיטה שתוארה בכתב היד הזה. לדוגמא, גרוס et al. 5 השתמש 1.5-1.8 גרם של שריר הגסטרוקנמיוס, וכ -2 גרם של רקמת הכליה. באופן דומה, פרנקו ואח &#39;. 6 משמש 500 רקמת כבד עכבר מ&quot;ג. מניסיוננו, תשואות אופייניות צפויות מביופסיה מחט percutaneous של שרירי שלד (lateralis vastus) נעות 100-200 מ&quot;ג. היכולת להעריך את התפקוד המיטוכונדריה 20-50 מ&quot;ג של רקמת שריר באמצעות הפרוטוקול המתואר כאן מאפשרת למשתמשים לבצע הערכות מרובות לביופסיה ודגימות חנות לשימוש עתידי בניסויי ביולוגיה מולקולריים אחרים. זוהי תכונה קריטית במחקר קליני ומחקרים אחרים הדורשים שימוש חרוץ של דגימות. יש לציין כי בעבר המיטוכונדריה קפוא לא טובה ללימוד נשימה בשילוב בשל outer נזק קרום המיטוכונדריה ואובדן פעילות ציטוכרום C. השיטה שלנו הותאמה ושונה מהשיטה שפורסמה על ידי צ&#39;פל ופרי 7. שימוש בשיטות שתוארו בכתב היד הזה, יש לנו לאחרונה דווח כי פרופיל respirometric של מיטוכונדריה מבודדת מvastus אדם lateralis מתואם ישירות עם יכולת פיזית, נמדדה כמהירות הליכה 8.

<table><tbody><tr><td>ציוד</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>הומוגנייזר ביו-ג'ן PRO200</td><td>BioExpress</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה אפנדורף 5804 R</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>דיפוול מאוחר רוטור&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 מ"מ בית החולים יוניברסיטי קולג' מחט</td><td>קצב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 סמ"ק מזרק</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 בארות קורא צלחות</td><td>Tecan (Genios-basic)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF 24-3 מנתח</td><td>Seahorse Biosciences, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מערכת ג'ל חלבון</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קודאק ג'ל לוג'יק 112</td><td>Carestream Health, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מכלול מצלמות קודאק</td><td>Carestream Health, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חומרים</td><td></td><td></td><td></td>מתכלים</tr><tr><td>XF24 V7 תרבית תאים Microplate ומחסנית חיישן XF24</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>100850-001</td><td></td></tr><tr><td>100867-100</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אשלגן הידרוקסיד (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית (HCl)Acros</td><td></td> <td>12421-0010</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Sa Salt &nbsp;</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P333</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP308</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP118</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום גופרתי (MgSO4)</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>ללא חומצות שומן BSA</td><td>Calbiochem</td><td>126575</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>פרוטאינאז חיידקי</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>P-8038</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>M9546</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>P284</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בדיקת חלבון BCA</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>PI23227</td><td></td></tr><tr><td>חומצה סוקסינית*</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>S3674</td><td></td></tr><tr><td>חומצה פירובית*</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>חומצה מאלית P5280</td><td></td></tr>*<tr><td></td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>2288</td><td></td></tr><tr><td>ADP (K+ מלח)*</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>A5285</td><td></td></tr><tr><td>XF ערכת בדיקת מאמץ של תא מיטו</td><td>Seahorse Biosciences</td><td>101706</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.&nbsp;</td><td>SC-29113</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 12% Bis-Tris Gel</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>NP0343BOX</td><td></td></tr><tr><td>ממברנות העברת אימובילין (0.45 אום)</td><td>Millipore</td><td>IPVH20200</td><td></td></tr><tr><td>MOPS SDS Running Buffer (20X)-500 מ"ל</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Buffer (20X)-1 ליטר</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>NP0006-1</td><td></td></tr><tr><td>נוגדנים ראשוניים (mAB ל-VDAC1/Porin)</td><td>Abcam</td><td>ab14734</td><td></td></tr><tr><td>נוגדנים ראשוניים (mAB ל-GAPDH)</td><td>Abcam</td><td>ab9484</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse IgG (עז),</td><td>PerkinElmer</td><td>NEF822E001EA</td><td></td></tr><tr><td>IgG נגד ארנב (עז), PerkinElmer עם תווית HRP</td><td>PerkinElmer</td><td>NEF812E001EA</td><td></td></tr><tr><td>*יש להתאים את ADP, חומצה סוקסינית, חומצה פירובית וחומצה מאלית ל-pH 7.4 עם KOH בלבד&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ההכנה וrespirometric הערכה של המיטוכונדריה מבודדת מרקמת שריר שלד מתקבלת על ידי percutaneous מחט ביופסיה

Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy

פרופיל Respirometric של מיטוכונדריה המבודדת משמש בדרך כלל כדי לחקור פונקצית שרשרת הובלת אלקטרונים. אנו מתארים שיטה לקבלת דגימות של lateralis vastus האנושי, בידוד המיטוכונדריה מכמויות מינימליות של רקמת שריר שלד, ופרופיל respirometric מבוסס צלחת באמצעות מנתח שטף תאי (XF). השוואה של פרופילי respirometric שהושגו באמצעות 1.0, 2.5 ו 5.0 מיקרוגרם של המיטוכונדריה עולה כי 1.0 מיקרוגרם מספיק כדי למדוד נשימה וכי 5.0 מיקרוגרם מספק תוצאות עקביות ביותר המבוסס על השוואה של סטיות התקן. ניתוח כתם המערבי של מיטוכונדריה המבודדת לסמן המיטוכונדריה COX IV וGAPDH סמן רקמה שאינה המיטוכונדריה מצביע על כך שיש זיהום שאינה מוגבל במיטוכונדריה שימוש בפרוטוקול זה. היכולת ללמוד respirometry המיטוכונדריה קטנה כמו 20 מ&quot;ג של רקמת שריר מאפשרת למשתמשים לנצל ביופסיות פרט לנקודתי קצה מחקר מרובים בקליניפרויקטי מחקר.

איור 1 מתאר תרשים זרימה מפורטת של כל הפרוטוקול. פרופילי כתם מערביים של COX IV / GAPDH (איור 2) מתארים את הביטוי של חלבון המיטוכונדריה, COX IV, והסמן שאינה המיטוכונדריה, GAPDH. ביטוי של שני COX IV וGAPDH ניכרים בכל lysate השריר. לאחר המיטוכונדריה מבודד באמצעות הטכניקה שתוארה בפרוטוקול זה, להקות COX IV עדיין ניכרו תוך GAPDH נעדר באותו החשיפה. חשיפות ארוכות יותר עשויות לחשוף להקת GAPDH קלושה. כתמים אלה מצביעים על כך שיש לי מיטוכונדריה המבודדת זיהום שאינה המיטוכונדריה מינימאלית. יתר על כן, ביטוי COX IV במיטוכונדריה המבודדת הוא עקבי בין דגימות. איור 3 מראה פרופילים אופייניים respirometric מונעים על ידי מורכב II (succinate וrotenone) באמצעות 1.0 מיקרוגרם, 2.5 מיקרוגרם, ו -5.0 מיקרוגרם של המיטוכונדריה. כצפוי, OCR הכולל הוא גדל wה- i כמויות גדולים יותר של מיטוכונדריה. היחס מחושב הנשימה השליטה (RCR) assay זה הוא 7.95, מצביע על כך שההכנה של המיטוכונדריה היא באיכות גבוהה. יתר על כן, 3U המדינה OCR הוא מעט גבוה יותר מזה של המדינה 3, המאשר את איכות של המיטוכונדריה. על מנת להשוות עקביות של תוצאות כאשר פרופיל כמויות שונות של מיטוכונדריה, ביצענו ניתוח שונה (ניתוח שונה) וחישבתי את הסכום של ריבועים (SS) כערכים בפועל של שונות באמצעות 1.0 מיקרוגרם, 2.5 מיקרוגרם, ו -5.0 מיקרוגרם של המיטוכונדריה נטען ל היטב (איור 4). SS מוצג למדינה 2, 3 מדינה, 3U המדינה, antimycin, וRCR. למדינת 2 ומדינת 3 מדידות, דרך אחד ANOVA היה מובהק סטטיסטי (p &lt;0.01 וp &lt;0.05, בהתאמה). באופן דומה, הדרך אחד ANOVA היה משמעותי מבחינה סטטיסטית לantimycin וRCR (p &lt;0.01 וp &lt;0.0001, בהתאמה. אין הבדל משמעותי ראה 3U המדינה בין קבוצות. Thתוצאות מצביעות על כך שESE 5.0 מיקרוגרם של מיטוכונדריה לכל גם נתן SS הנמוך ביותר בהשוואה לריכוז אחר והוא את הכמות האופטימלית לשימוש במערכת XF 24 עם האוכלוסייה של משתתפים שלנו. איור 5 משמש כמדריך כדי לציין כיצד ניתן לצפות מדי חלבון המיטוכונדריה מבוסס על גודל מדגם שריר הראשוני. כצפוי יש קשר חזק בין כמות השריר (מ&quot;ג) מעובד והתוכן הכולל של המיטוכונדריה החלבון (מ&quot;ג) של המדגם הסופי. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> מאגר Chappel-פרי אני (מדד המחירים לצרכן) </td></tr><tr><td> כימיה </td><td> ריכוז </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 100 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> מגבים </td><td> 50 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 1 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> 4 MgSO </td><td> 5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> ATP </td><td> 1 מ&quot;מ </td></tr&gt; <tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> מאגר Chappel-פרי II (CPII) </td></tr><tr><td> כימיה </td><td> ריכוז </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 100 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> מגבים </td><td> 50 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 1 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> 4 MgSO </td><td> 5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> ATP </td><td> 0.2 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> חומצות שומן חופשי BSA </td><td> 0.50% </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> מיטוכונדריאלי Assay פתרון (MAS) (2X) </td></tr><tr><td> כימיה </td><td> ריכוז </td></tr><tr><td> סוכרוז </td><td> 35 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> מניטול </td><td> 110 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 2.5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 2.5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 1.0 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 0.5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> חומצות שומן חופשי BSA </td><td> 0.10% </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> מיטוכונדריאלי Assay פתרון (MAS) עם II תנאים ראשוניים מורכבים </td></tr><tr><td> כימיה </td><td> ריכוז </td></tr><tr><td> 1X MAS </td><td></td></tr><tr><td> Succinate </td><td> 10 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> Rotenone </td><td> 2 מיקרומטר </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> מיטוכונדריאלי Assay פתרון (MAS) עם אני תנאים ראשוניים מורכבים </td></tr><tr><td> כימיה </td><td> ריכוז </td></tr><tr><td> 1X MAS </td><td></td></tr><tr><td> פירובט</td><td> 5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> Malate </td><td> 5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td colspan="2"> * כל המאגרים שיש לתת במים ללא יונים </td></tr></tbody></table> שולחן פתרון 1. ומתכונים חיץ. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> צעדים פרוטוקול </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> StartProtocol </td></tr><tr><td> פיקוד </td><td> זמן (דקות) </td><td> נמל </td></tr><tr><td> לכייל </td><td> 0.00 </td><td></td></tr><tr><td> חכה </td><td> 10.00 </td><td></td></tr><tr><td> מערבבים </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> חכה </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> מערבבים </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> חכה </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> מערבבים </td><td> 0.50 </td><td></td></tr><tr><td> מדד </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> מערבבים </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> מדד </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> מערבבים </td><td> 0.50 </td><td></td></tr><tr><td> הזרק </td><td></td><td> </td></tr><tr><td> מערבבים </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> מדד </td><td> 6.00 </td><td></td></tr><tr><td> מערבבים </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> הזרק </td><td></td><td> B </td></tr><tr><td> מערבבים </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> מדד </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> מערבבים </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> הזרק </td><td></td><td> C </td></tr><tr><td> מערבבים </td><td> 1.00 </td><td></td></tr<html> &gt; <tr><td> מדד </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> מערבבים </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> הזרק </td><td></td><td> D </td></tr><tr><td> מערבבים </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> מדד </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> EndProtocol </td></tr></tbody></table> טבלת 2. מערבבים, למדוד, ולערבב הגדרת מחזור לrespirometer. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52350/52350fig1highres.jpg" /> איור 1. תרשים זרימה של כל הפרוטוקול. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> /ftp_upload/52350/52350fig2highres.jpg &quot;/&gt; איור 2. כתם מערבי נציג לרקמת שריר שלד כולו, כמו גם מיטוכונדריה מבודדת. תמצית רקמה שלמה, כמו גם מיטוכונדריה מבודדת היו immunoblotted עם נוגדן COX IV כסמן המיטוכונדריה ונוגדן GAPDH לשליטה שאינה במיטוכונדריה. אין להקת GAPDH נצפתה במיטוכונדריה המבודדת המצביעה על זיהום קטן או לא ממקורות שאינן במיטוכונדריה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52350/52350fig3highres.jpg" /> איור 3. פרופיל respirometric נציג של מיטוכונדריה מבודדת מvastus אדם lateralis. שלושה ריכוזים של מיטוכונדריה המבודדת, 5.0 מיקרוגרם, 2.5 מיקרוגרם, ו1.0 מיקרוגרם<html> מחדש המשמש assay זה. ריכוזים סופיים של תרכובות לאחר זריקות נמל היו 2 מ&quot;מ ADP (יציאה); 2 oligomycin מיקרומטר (יציאה ב &#39;); 6 מיקרומטר FCCP (C נמל); ו -2 מיקרומטר antimycin (D נמל). RCR שחושב לטווח זה היה 7.95. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52350/52350fig4highres.jpg" /> איור 4. הסכום של ריבועים. הסכום של ריבועים למדינות השונות במיטוכונדריה הנשימה וRCR באמצעות 5.0 מיקרוגרם, 2.5 מיקרוגרם, ו1.0 מיקרוגרם מיטוכונדריה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> ig5highres.jpg &quot;/&gt; איור 5. זה יכול לשמש כמדריך להעריך את כמות חלבון המיטוכונדריה שניתן לצפות על סמך ניתוח רגרסיה שרירים מדגם משקל ההתחלתי:. מהסכום של שריר (מ&quot;ג) ותשואה הכוללת של המיטוכונדריה חלבון (מ&quot;ג). כצפוי, קיים קשר חיובי ישיר בין כמות השריר וחלבון המיטוכונדריה הכוללת שהושג.

שיטות לביופסיה של lateralis vastus, הכנת המיטוכונדריה מטוהרת, ופרופיל respirometric מתוארות. השימוש בשרירים קטן נפח עושה בטכניקה זו מתאימה ליישומי מחקר קליניים.

ההכנה וRespirometric הערכה של המיטוכונדריה מבודדת מרקמת שריר שלד מתקבלת על ידי Percutaneous מחט ביופסיה

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבחון את הבקרה הנשימתית במיטוכונדריה, שבודדו מרקמת שריר שלד שנלקחה בביופסיה. זאת מושגים תחילה על ידי השגת כמות קטנה של שריר באמצעות ביופסיית מחט תת-עורית. השלב השני הוא בידוד המיטוכונדריה מהשריר שנלקח בביופסיה באמצעות הומוגניזציה.בשלב הבא, שוטפים את המיטוכונדריה המבודדות ומפרידים אותן מהפראקציות שאינן מיטוכונדריאליות באמצעות סנטריפוגציה והעברת הדגימה דרך בד גזה מקופל. השלב הסופי הוא פריסה של המיטוכונדריה המבודדות על פלטה לביצוע ניתוח רספירומטרי באמצעות בדיקות זרימה חוץ-תאית (extracellular flux assays) להדמיית קצב צריכת החמצן. לבסוף, נעשה שימוש ב-seahorse extracellular flux analyzer לבחינת הבקרה הנשימתית במיטוכונדריה המבודדות.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא שהיא דורשת כמות מינימלית של רקמת שריר, עד כדי 20 milligrams, ומגבילה את השונות הבין-ניסויית. מאפיינים אלו הופכים את הטכניקה למתאימה ליישומים במחקר קליני. ההשלכות של טכניקה זו הן עבור אבחנה של תפקוד מיטוכונדריאלי לקוי בחולים.הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן ביופסיית השריר ובידוד המיטוכונדריה דורשים מניפולציות מדויקות שניתן להדגים בצורה הטובה ביותר באופן חזותי ולא רק באמצעות תיאור טקסטואלי. כדי לבצע את הביופסיה מקומית, הזרק 1% lidocaine, תוך הקפדה שלא להחדירו לתוך השריר. לאחר מכן, המתן 10 דקות.כדי לאפשר אלחוש מספיק, יש לדגום את הביופסיות מהאזור המרכזי של השריר שבין נקודת ההידבקות למקור, תוך הימנעות מאזורים סוב-פסציאליים ואזורי גיד-שריר. כדי להשיג זאת, השתמש תחילה במחט תת-עורית והנח למפגש עם הפסציה (תחושת "פיצוץ" או התנגדות של הפסציה) לשמש כמדריך. העריך את העומק באמצעות מחט ההרדמה, לאחר מכן הרגש את העומק באמצעות להב סקלפל צר ובצע חתך של ארבעה עד חמישה מילימטרים דרך הפסציה.החדירו את המחט דרך החתך עד להחדרתה אל השריר. אספו מספר דגימות כאשר החלון פונה לכיוונים שונים. הפעילו שאיבה רציפה באמצעות מזרק של 60 cubic centimeter תוך כדי הכנסה והוצאה של דגימות שריר אל תוך המחט התת-עורית שתיים עד ארבע פעמים בכיוונים שונים.הפסיקו את השאיבה והוציאו את המחט. בקשו מעוזר להפעיל לחץ חזק על נקודת הדקירה במשך חמש דקות. כדי להשיג המוסטזיס, נתקו את המחט מצינור השאיבה והוציאו בזהירות את דגימות השריר מהחלון ומהגליל.בצע מעבר שני אם נדרש שריר נוסף על ידי חזרה על הליך זה. הסר קרישי דם גלויים מדגימת השריר באמצעות פינצטה. לאחר מכן שקול את הדגימה והעבר אותה מיד לשפרויר המכיל קרח.קררו את ה-ECCOs בתוך תמיסת סליין עם בופר פוספט (PBS) או DPBS. הסירו רקמה חיבורית נראית מהדגימה באמצעות פינצטה ומספריים חדים. שטפו את הדגימות ביסודיות שלוש עד ארבע פעמים בבופר DPBS קר מאוד.כדי להסיר דם, שמרו את הדגימות על קרח ב-DPBS קר ועבדו אותן בהקדם האפשרי. תוך 45 דקות מהביופסיה, נקטו באמצעי זהירות כדי להסיר בזהירות גידים או רקמת שומן מדגימת השריר. הסירו חלק קטן מכל רקמה עודפת לאחסון בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס.ניתן להשתמש בכך עבור ניסויים אחרים כגון Western blots. קצצו מיד את רקמת השריר לחתיכות קטנות, באמצעות מספריים סטריליים, ולאחר מכן השעיו ב-500 µL עד 1 mL של מעכב פרוטאיז מהסוג Sistine, כגון nagars המומס בבופר CP one בריכוז של 0.2 mg לגרם רקמה.קצצו את הדגימה עד שהיא נראית תלויה היטב. לאחר מכן, בצעו אינקובציה של חמש דקות בטמפרטורת החדר לפני ההעברה לקרח, תוך כדי וידוא שההומוגנייזר נשטף ביסודיות מראש. בצעו הומוגניזציה לרקמה הקצוצה שטופלה ב-nagars.השתמשו בהומוגניзатор אוטומטי. שמרו את הדגימה על קרח לאורך כל התהליך. הומוגניזרו כל דגימת רקמה ארבע פעמים, בכל פעם בפולס של שתי שניות.באמצעות הומוגנייזר אוטומטי בהגדרת מהירות של 10,000 RPM, החזירו את הדגימה על קרח. שטפו את הפרובה ב-70% ethanol ולאחר מכן במים מזוקקים בין רקמה לרקמה. כעת, שטפו את הרקמה ההומוגנית בנפח שווה של בופר chapel Perry one או CP one.לאחר מכן, שטפו את הרקמה עם נפח כפול של חוצץ CP two. הוסיפו את ש ebenfalls השארית על ידי מילוי מים עד לאותו נפח בשפופרת קונית אחרת. אספו את התוכן לשפופרת צנטריפוגה וסבבו בצנטריפוגה ב-600 GS בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius למשך 10 דקות. הרטיבו מראש את בד הגז כדי לאפשר לכל החלקיקים לעבור דרכו ולא להיתפס בבד.סננו את העליון דרך בד גזה רטוב, אספו את התסנין והשליכו את המשקע, ובכך הסירו את מרבית הפракציות שאינן מיטוכונדריאליות. לאחר מכן, בצעו אולטרסנטריפוגה לעליון ב-10,000 GS בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius למשך 10 דקות. השעו את המשקע בארבעה מיליליטר של CP two buffer לפני ביצוע סנטריפוגה שנייה באותה צורה לאחר הסנטריפוגה.שפכו את הנוזל העליון ותלו את העיסה ב-two milliliters של CP one buffer. בשלב זה, העבירו מנה קטנה (aliquot) מתליה זו למבחנה נפרדת לצורך הערכת ריכוז החלבון. תלו את שאר הדגימה ב-CP one buffer וסובבו בצנטריפוגה.כמו קודם לכן, שימו לב שיש להכין את לוח החלבון עם התקנים במהלך שלבי הצנטריפוגה המוקדמים יותר. לבסוף, השעיקו מחדש את המשקע הסופי בכמות מינימלית של תמיסת בדיקת מיטוכונדריה או מסה. בצעו בדיקות XF כדי להמחיש את קצב צריכת החמצן או OCR בפיקו-מולים של חמצן לדקה או רמות מוחלטות של חמצן ו-pH.בפלט הנתונים. הוסף ריכוז של 10x של התרכובות במסה של X אחת לפורטים A עד D של הרספירומטר מבוסס הפלטה, כדי להגיע לריכוז סופי כפי שרשום בפרוטוקול הטקסט. הכן נפח מספיק של תרכובות עבור מספר הבארות הנדרש.השתמש בחישובי החלבון שנמדדו קודם לכן כדי לקבוע את ריכוזי המיטוכונדריה שיש להוסיף. קבע את הכמות האופטימלית של מיטוכונדריה על ידי טיטרציה של מיקרוגרם אחד, 2.5 מיקרוגרם וחמישה מיקרוגרם של מיטוכונדריה לבאר, בלוח של 24 בארות, כדי למזער את השונות בין הבארות.ראשית, יש לדלל מיטוכונדריה בריכוז 10x בתוך תמיסת mass plus substrate בריכוז 1x קרה. לאחר מכן, העבירו 50 µL מתליהית זו לכל באער. השאירו ארבעה באערים המכילים 50 µL של mass בלבד, שישמשו כמדידות רקע.הנח את פלטת הכיול ששורתה מראש יחד עם המחסנית העליונה משלב קודם לתוך הרספירומטר כדי לבצע את כיול המכשיר. כהכנה להרצת פלטת הבדיקה, סבב את הפלטה בצנטריפוגה ב-2000 GS למשך 20 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסבב בצנטריפוגה.הוסיפו בעדינות 450 µL של תמיסת one x mass, plus succinate ו-rotten לכל באר. בחנו את המיטוכונדריה תחת המיקרוסקופ כדי לוודא היצמדות הומוגנית לבאר לפני העברת הפלטה לאנלייזר ה-XF. מדדו את הנשימה המיטוכונדרית בזמן אמת באמצעות הרספירומטר, על ידי תכנותו לפי ההגדרות לרספירומטר המסופקות בפרוטוקול הכתוב; המוצגים כאן הם פרופילים רספירומטריים טיפוסיים המונעים על ידי קומפלקס 2, תוך שימוש ב-1 µg, 2.5 µg ו-5 µg של מיטוכונדריה כצפוי.באופן כללי, ה-OCR עולה עם כמויות גבוהות יותר של מיטוכונדריה. יחס הבקרה הנשימתית (RCR) שחושב עבור בדיקה זו הוא 7.95, מה שמעיד על כך שההכנה המיטוכונדריאלית היא באיכות גבוהה. כדי להשוות את עקביות התוצאות בעת אפיון של כמויות שונות של מיטוכונדריה, בוצע ניתוח שוני (ANOVA) וחושב סכום הריבועים. סכום הריבועים (SS) מוצג עבור מצב 2, מצב 3, מצב 3 לא מזווג, antimycin A ו-RCR עבור מדידות מצב 2 ומצב 3 בדרך אחת.Innova היה בעל מובהקות סטטיסטית, בדומה ל-ANTIMYCIN ו-RCR. לא נצפה הבדל מובהק במצב שלושה לא מצומד (state three uncoupled) בין הקבוצות. תוצאות אלו מעידות כי חמישה מיקרוגרם של מיטוכונדריה למבב הניבו את ה-SS הנמוך ביותר בהשוואה לריכוזים אחרים.תרשים זה משמש כמדריך המציין את כמות החלבון המיטוכונדריאלי הצפויה בהתבסס על גודל דגימת השריר הראשונית. כצפוי, קיימת מתאם חזק בין כמות השריר שעובדה לבין התוכן הכולל של חלבון מיטוכונדריאלי בדגימה הסופית. לאחר רכישת מיומנות, ניתן להשלים טכניקה זו בפחות משלוש שעות אם היא מבוצעת כהלכה.בעקבות הביופסיה מהשריר, חשוב לוודא שהמטופל לא ייטול אספירין, איבופרופן או תרופות נוגדות דלקת לא סטרואידיות אחרות ללא מרשם במהלך שלושת הימים הבאים, וזאת כדי להבטיח ריפוי תקין של הרקמות מהן נלקחה הביופסיה. הדבר הבא הוא שעלינו לוודא שהם לא יבצעו כל פעילות מאומצת גם במהלך היום וחצי הבאים, כך שכל פעילות הכוללת זעזועים אסורה. לדוגמה, כדורסל, טרמפולינה או רכיבה על סוסים, אך הם יכולים להמשיך בפעילויותיהם הרגילות.אנו מבקשים מהם בנוסף לשמור על האזור יבש למשך 24 שעות, אך להקפיד שהפעם הראשונה שבה האזור יירטב תהיה תחת מקלחת, כדי שסוגי חיידקים שייתכן שנמצאים על העור ולא נוקו לא יחדרו לתוך החתך. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה יותר לגבי אופן ביצוע ביופסיה של רקמת שריר שלטי של ה-S, בידוד מיטוכונדריה ומדידת בקרת נשימה.

preparation-respirometric-assessment-mitochondria-isolated-from

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

פרוטוקול זה מתאר הליך ללמוד את הנשמה של המיטוכונדריה מבודד שרירי השלד. שיטה זו הותאמה מ...

בידוד מיטוכונדריאלי של שריר השלד

שיטה לבידוד מהיר של המיטוכונדריה מביופסיות רקמות יונקים מתוארת. כבד חולדה או תכשירי שרירי שלד היה הומוגני עם Dissociator רקמה מסחרי ומיטוכונדריה היו מבודדת על ידי סינון ההפרש דרך מסנני רשת ניילון. זמן בידוד מיטוכונדריאלי הוא &lt;30 דקות בהשוואה ל60-100 דקות תוך שימוש בשיטות אלטרנטיביות.

בידוד מהיר וטיהור של מיטוכונדריה להשתלה על ידי דיסוציאציה רקמות ודיפרנציאל סינון

השיטות המוצגות מספקות הוראות שלב אחר שלב לביצוע אוסף של בדיקות ספירומטריות מבוססות מיקרו-צלחת באמצעות מיטוכונדריה מבודדת מכמויות מינימליות של שרירי שלד עכבר. מבחנים אלה מסוגלים למדוד שינויים/התאמות מכניסטיות בצריכת החמצן המיטוכונדריאלית במודל נפוץ של בעלי חיים.

באמצעות מבודד המיטוכונדריה מכמויות מינימליות של שרירי שלד עכבר למדידות נשימה microplate תפוקה הגבוה

כאן, אנו מציגים שינוי של שיטה שדווחה בעבר המאפשרת בידוד של מיטוכונדריה איכותית ומטוהרת מכמויות קטנות יותר של שרירי שלד עכבר. הליך זה מביא למיטוכונדריה בצימוד גבוה שנושמים בתפקוד גבוה במהלך מבחני רספירומטירק מבוססי מיקרופלייט.

בידוד של המיטוכונדריה מכמויות מינימליות של שרירי שלד עכבר למדידות תפוקה גבוהה microplate נשימה

כאן, דגימת שריר ארבע ראשי נלקחת מחזיר מורדם והמיטוכונדריה מבודדת על ידי צנטריפוגה דיפרנציאלית. לאחר מכן, קצב הנשימה של מתחמי שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית I, II ו-IV נקבעים באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה.

בידוד של המיטוכונדריה ללא פגע מן שרירי השלד על ידי דיפרנציאל צנטריפוגה מדידות Respirometry ברזולוציה גבוהה

תכננו ובנינו מעבדה ניידת למדידת קצב הנשימה במיטוכונדריה מבודדת של חיות בר שנלכדו בשדות. כאן, אנו מתארים את העיצוב וההתאמה של מעבדה מיטוכונדריאלית ניידת ואת פרוטוקולי המעבדה הקשורים.

פיתוח מעבדה ניידת לפיזיולוגיה מיטוכונדריאלית למדידת אנרגיה מיטוכונדריאלית בתחום

המיטוכונדריה הם אברונים מטבוליים מרכזיים המציגים רמה גבוהה של פלסטיות פנוטיפית בשריר השלד. ייבוא חלבונים מן הציטוסול הוא מסלול קריטי עבור biogenesis אברון, חיוני להרחבת הרשתית ותחזוקה של תפקוד מיטוכונדריאלי.  לכן, יבוא חלבון משמש ברומטר של בריאות התא.

מדידה של קיבולת ייבוא חלבון של המיטוכונדריה שריר השלד

כאן, אנו מתארים שיטה מפורטת לבידוד המיטוכונדריה משריר השלד של העכבר ואת הניתוח הבא של נשימה על ידי שיעור צריכת חמצן (OCR) באמצעות בדיקות respirometric מבוססות מיקרופלט. צינור זה יכול להיות מיושם כדי לחקור את ההשפעות של התערבויות סביבתיות או גנטיות מרובות על חילוף החומרים המיטוכונדריאלי.

בידוד המיטוכונדריה משריר שלד העכבר לבדיקות ספירומטריות

לסוסים יש יכולת פעילות אירובית יוצאת דופן, מה שהופך את שרירי השלד של הסוסים לרקמה חשובה הן לחקר הפיזיולוגיה של פעילות גופנית של סוסים והן לפיזיולוגיה של המיטוכונדריה של יונקים. מאמר זה מתאר טכניקות להערכה מקיפה של תפקוד המיטוכונדריה בשרירי השלד של סוסים.

פלואורו-רספירומטריה ברזולוציה גבוהה של שרירי השלד של סוסים

במאמר זה אנו מתארים שיטה מקיפה למדידת זרחן חמצוני מיטוכונדריאלי בסיבי שריר שלד טריים משריר אדם או עכבר. שיטה זו מאפשרת כימות בזמן אמת של נשימה מיטוכונדריאלית והערכת העדפת דלק וגמישות מטבולית תוך שמירה על רשתות מיטוכונדריאליות קיימות ושלמות הממברנה.

מדידת נשימה מיטוכונדריאלית בסיבי שרירי שלד של בני אדם ועכבר על ידי ספירומטריה ברזולוציה גבוהה

למדו להכין מיטוכונדריה מבודדות משריר שלד לבדיקת שליטה נשימתית באמצעות ביופסיית מחט עורית. שיטה זו דורשת רק 20 מ"ג רקמה ומתאימה למחקר קליני.

ההכנה וRespirometric הערכה של המיטוכונדריה מבודדת מרקמת שריר שלד מתקבלת על ידי Percutaneous מחט ביופסיה

גלה סרטונים נוספים