ההכנה וRespirometric הערכה של המיטוכונדריה מבודדת מרקמת שריר שלד מתקבלת על ידי Percutaneous מחט ביופסיה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבחון בקרת נשימה במיטוכונדריה, המבודדת מרקמת שריר השלד שנלקחה בביופסיה. זה מושג על ידי השגת כמות קטנה של שריר על ידי ביופסיית מחט מלעורית. השלב השני הוא לבודד את המיטוכונדריה מהשריר הביופסיה על ידי הומוגניזציה.

לאחר מכן, המיטוכונדריה המבודדת נשטפת ומופרדת מהשברים הלא מיטוכונדריאלים באמצעות צנטריפוגה והעברת הדגימה דרך בד גבינה נשוי. השלב האחרון הוא צלחת מיטוכונדריה מבודדת לביצוע ניתוח מטרי רספירו באמצעות מבחני שטף חוץ-תאיים כדי לדמיין את קצב צריכת החמצן. בסופו של דבר, מנתח השטף החוץ-תאי של סוסון הים משמש לבחינת בקרת נשימה במיטוכונדריה מבודדת.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות הוא שהיא דורשת כמות מינימלית של רקמת שריר נמוכה עד 20 מיליגרם ומגבילה את השונות בין הניסוי. תכונות אלו הופכות טכניקה זו למתאימה ליישומי מחקר קליני. ההשלכות של טכניקה זו הן לאבחון תפקוד לקוי של המיטוכונדריה בחולים.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שביופסיית השריר ובידוד המיטוכונדריה דורשים מניפולציות מדויקות המודגמות בצורה הטובה ביותר באופן ויזואלי ולא רק בטקסט. כדי לבצע את הביופסיה באופן מקומי, יש לתת 1% לידוקאין, תוך הקפדה לא לחדור לשריר. לאחר מכן יש תקופת המתנה של 10 דקות.

כדי לאפשר הרדמה מספקת, קח את הביופסיות מהאזור האמצעי של השריר בין ההחדרה למקור, הימנע מאזורים תת-פאסיאליים וגידים מיו. כדי להשיג זאת תחילה, השתמש במחט מלעורית ועקוב אחר פופ פאסיאלי או התנגדות של הפאשיה כמדריך. העריכו את העומק בעזרת מחט ההרדמה, ואז הרגישו אותו עם להב האזמל הצר ובצעו חתך של ארבעה עד חמישה מילימטרים דרך הפאשיה.

מקדמים את המחט דרך החתך עד להחדרתה לשריר. אסוף מספר דגימות כשהחלון מופנה לכיוונים שונים. הפעל יניקה רציפה באמצעות מזרק של 60 סנטימטר מעוקב תוך התקדמות ומשיכת דגימות שריר לתוך המחט המלעורית פעמיים עד ארבע פעמים בכיוונים שונים.

הפסק את היניקה והסר את המחט. בקש מהעוזר להפעיל לחץ חזק על מקום הניקוב למשך חמש דקות. כדי ליצור המוסטזיס, נתק את המחט מצינורות היניקה והסר בזהירות את דגימות השריר מהחלון והחבית.

בצע מעבר שני אם יש צורך בשריר נוסף על ידי חזרה על הליך זה. הסר קרישי דם גלויים מדגימת השריר באמצעות מלקחיים. לאחר מכן שקלו את הדגימה והניחו מיד בצינור המכיל קרח.

ECCOs קרים פוספט חוצץ מלח או DPBS. הסר רקמת חיבור גלויה מהדגימה באמצעות מספריים ופינצטה חדים. ביסודיות. שטפו דגימות שלוש עד ארבע פעמים עם מאגר DPBS קר כקרח.

כדי להסיר דם, שמור את הדגימות על DPBS קר כקרח ועבד בהקדם האפשרי. תוך 45 דקות מהביופסיה, נקוט באמצעי זהירות כדי להסיר בזהירות גידים או רקמת שומן מדגימת השריר. הסר חלק קטן מכל רקמה נוספת לאחסון בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס.

זה עשוי לשמש לניסויים אחרים כגון כתמים מערביים. קוצצים מיד את רקמת השריר לחתיכות עדינות. בעזרת מספריים סטריליים, ואז השעו 500 מיקרוליטר למיליליטר אחד של מעכב ACE חלבון סיסטיני, כגון נגרים המומסים ב-CP מאגר אחד בריכוז של 0.2 מיליגרם לגרם רקמה.

טוחנים את הדגימה עד שהיא נראית תלויה היטב. עקוב אחר זה עם דגירה של חמש דקות בטמפרטורת החדר לפני ההעברה לקרח, וודא שההומוגנייזר נשטף היטב. מראש. הומוגניזציה של הרקמה הטחונה שטופלה בנגר.

שימוש בהומוגנייזר אוטומטי. שמור את הדגימה על קרח לאורך כל התהליך הזה. הומוגניזציה של כל דגימת רקמה ארבע פעמים בכל פעם למשך פעימה של שתי שניות.

בעזרת ההומוגנייזר האוטומטי במהירות של 10,000 סל"ד, הנח את הדגימה בחזרה על הקרח. שטפו את הגשושית עם 70% אתנול ואחריו מים מזוקקים בין הרקמות. כעת, שטפו את הרקמה ההומוגנית בנפח שווה של קפלה פרי אחד או CP מאגר אחד.

לאחר מכן שטפו את הטישו בנפח כפול של CP שני מאגר. הוסף את צינור האיזון על ידי הבאת מים לאותו נפח בצינור חרוטי אחר. אסוף את התוכן בצינור צנטריפוגה וצנטריפוגה ב-600 GS ארבע מעלות צלזיוס או 10 דקות הרטיבו מראש את בד הגבינה כדי לאפשר לכל החלקיקים לעבור ולא להיתפס על הבד.

העבירו את הסופרנטנט דרך בד גבינה נשוי, אספו את התסנין והשליכו את הגלולה, ובכך הסירו את רוב השברים שאינם מיטוכונדריה. לאחר מכן אולטרה-צנטריפוגה של הסופרנטנט ב-10,000 GS ארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. השעו את הגלולה בארבעה מיליליטר של מאגר CP שני לפני הצנטריפוגה בפעם השנייה באותו אופן לאחר צנטריפוגה.

השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הפטה בשני מיליליטר של CP מאגר אחד. בשלב זה, הנח מנה קטנה מהתרחיף הזה במבחנה נפרדת שתשמש להערכת חלבון. Resus, השעו את הדגימה הנותרת במאגר CP אחד ובצנטריפוגה.

כמו קודם, שימו לב כי יש להגדיר את לוחית החלבון עם הסטנדרטים במהלך שלבי צנטריפוגה מוקדמים יותר. לבסוף, השעו מחדש את הגלולה הסופית בכמות מינימלית של תמיסת בדיקה מיטוכונדריאלית או מסה. בצע מבחני XF כדי לדמיין את קצב צריכת החמצן או OCR בשומות פיקו של חמצן לדקה או רמות מוחלטות של חמצן ו-pH.

בפלט הנתונים. הוסף ריכוז של פי 10 של התרכובות במסת X אחת ליציאות A עד D של מד הנשימה מבוסס הצלחת כדי לתת ריכוז סופי כמפורט בפרוטוקול הטקסט. הכן נפח מספיק של תרכובות למספר הבארות הנדרש.

השתמש בחישובי החלבון שנמדדו קודם לכן כדי לקבוע את ריכוזי המיטוכונדריה שיש להוסיף. קבעו את הכמות האופטימלית של מיטוכונדריה על ידי טיטרציה של מיקרוגרם אחד, 2.5 מיקרוגרם וחמישה מיקרוגרם של מיטוכונדריה לבאר. מתוך צלחת 24 הבארות כדי למזער את השונות בין בארות.

תחילה יש לדלל 10 x מיטוכונדריה בקור, מסה אחת בתוספת מצע. לאחר מכן, ספק 50 מיקרוליטר של מתלה זה לכל באר. השארת ארבע בארות המכילות רק 50 מיקרוליטר מסה שישמשו כקריאות רקע.

הנח את לוחית הכיול הספוגה מראש יחד עם המחסנית העליונה מקודם לכן לתוך מד הנשימה כדי לבצע את כיול המכשיר. הכנה לצלחת הבדיקה הפעל צנטריפוגה את הצלחת ב -2000 GS למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה.

הוסף בעדינות 450 מיקרוליטר של מסה x אחת, בתוספת סוקסינט ורקוב הידוע לכל אחד. צפה היטב במיטוכונדריה מתחת למיקרוסקופ כדי להבטיח היצמדות הומוגנית לבאר לפני העברת הצלחת למנתח ה-XF. ברצף. מדוד את הנשימה המיטוכונדריאלית בזמן אמת באמצעות מד הנשימה על ידי תכנות באמצעות ההגדרות עבור מד הנשימה המסופק בפרוטוקול הטקסט המוצג כאן הם פרופילים מטריים טיפוסיים של Respiro המונעים על ידי קומפלקס שניים באמצעות מיקרוגרם אחד, 2.5 מיקרוגרם וחמישה מיקרוגרם של מיטוכונדריה כצפוי.

בסך הכל, OCR מוגבר עם כמויות גבוהות יותר של מיטוכונדריה. יחס הבקרה הנשימתית המחושב או RCR עבור בדיקה זו הוא 7.95, מה שמצביע על כך שההכנה המיטוכונדריאלית היא באיכות גבוהה על מנת להשוות את עקביות התוצאות בעת ביצוע פרופיל כמויות שונות של ניתוח מיטוכונדריה של וריאנטים או Inova וחושב סכום הריבועים. סכום הריבועים או SS מוצג עבור מצב שתיים, מצב שלוש, מצב שלוש, אנטימיצין A לא מצומד ו-RCR עבור מדידות מצב שתיים ומצב שלוש בכיוון אחד.

Innova הייתה מובהקת סטטיסטית כמו גם עבור ANTIMYCIN ו-RCR. לא נראה הבדל משמעותי עבור מדינה שלישית ללא צימוד בין הקבוצות. תוצאות אלה מצביעות על כך שחמישה מיקרוגרם של מיטוכונדריה לבאר נתנו את ה-SS הנמוך ביותר בהשוואה לריכוזים אחרים.

תרשים זה משמש כמדריך המציין כמה חלבון מיטוכונדריאלי ניתן לצפות על סמך גודל דגימת השריר הראשוני. כצפוי, קיים מתאם חזק בין כמות השריר המעובד לבין תכולת החלבון המיטוכונדריאלי הכוללת של הדגימה הסופית. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך פחות משלוש שעות אם היא מבוצעת כראוי.

לאחר ביופסיית השריר, חשוב לוודא שהמטופל אינו נוטל אספירין או איבופרופן או תרופות אחרות ללא מרשם שאינן סטרואידים במשך שלושת הימים הקרובים על מנת להבטיח ריפוי טוב של הרקמות שביצענו ביופסיה. הדבר הבא הוא שאנחנו רוצים לוודא שהם לא עושים שום פעילות מאומצת גם ביום וחצי הבאים, אז אין כמו צורם. זה יהיה טרמפולינה של כדורסל, אבל הם יכולים לעשות את הפעילויות הרגילות שלהם.

אנו מבקשים גם לשמור על האזור יבש למשך 24 שעות, אך בפעם הראשונה שהוא נרטב להיות במקלחת כדי שכל סוג של חיידקים שעלולים להיות על העור שלא ניקינו לא ייכנסו לחתך. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין טוב יותר כיצד לבצע ביופסיה של רקמת שריר השלד הרוחבית S, לבודד מיטוכונדריה ולמדוד שליטה נשימתית.