Name: תרבות ושיתוף התרבות של עכבר שחלות וזקיקים בשחלות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: למדו שיטת תרבית רקמות שחלה וזקיקים בודדים בעכברים לחקר ביולוגיה רבייתית. טכניקה זו מאפשרת לחקור אינטראקציות בין זקיקים ולהעריך השפעות של חומרים חיצוניים על פוריות נקבה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה מומנה על ידי מענק MRC G1002118.

<ol><li>Brien, M. J., Pendola, F. L., Eppig, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revised+protocol+for+in+vitro+development+of+mouse+oocytes+from+primordial+follicles+dramatically+improves+their+developmental+competence%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">A revised protocol for in vitro development of mouse oocytes from primordial follicles dramatically improves their developmental competence.</a> Biol. Reprod. 68 (5), 1682-1686 (2003).</li>
<li>Fortune, J. E., Yang, M. Y., Muruvi, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+earliest+stages+of+follicle+development%3A+follicle+formation+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Soc.+Reprod.+Fertil.+Suppl%22%5BJournal%5D)">The earliest stages of follicle development: follicle formation and activation.</a> Soc. Reprod. Fertil. Suppl. 67, 203-216 (2010).</li>
<li>McLaughlin, M., Kinnell, H. L., Anderson, R. A., Telfer, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+phosphatase+and+tensin+homologue+%28PTEN%29+in+human+ovary+in+vitro+results+in+increased+activation+of+primordial+follicles+but+compromises+development+of+growing+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Inhibition of phosphatase and tensin homologue (PTEN) in human ovary in vitro results in increased activation of primordial follicles but compromises development of growing follicles.</a> Mol. Hum. Reprod. 20 (8), 736-744 (2014).</li>
<li>Morgan, S., Lopes, F., Gourley, C., Anderson, R. A., Spears, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisplatin+and+doxorubicin+induce+distinct+mechanisms+of+ovarian+follicle+loss%3B+imatinib+provides+selective+protection+only+against+cisplatin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cisplatin and doxorubicin induce distinct mechanisms of ovarian follicle loss; imatinib provides selective protection only against cisplatin.</a> PLoS One. 8 (7), e70117(2013).</li>
<li>Murray, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+growth+and+oocyte+competence+in+the+in+vitro+cultured+mouse+follicle%3A+effects+of+gonadotrophins+and+steroids%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Follicular growth and oocyte competence in the in vitro cultured mouse follicle: effects of gonadotrophins and steroids.</a> Mol Hum Reprod. 14 (2), 75-83 (2008).</li>
<li>Baker, S. J., Srsen, V., Lapping, R., Spears, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+effect+of+follicle-follicle+interactions+and+declining+follicle-stimulating+hormone+on+murine+follicle+health+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Combined effect of follicle-follicle interactions and declining follicle-stimulating hormone on murine follicle health in vitro.</a> Biol. Reprod. 65 (4), 1304-1310 (2001).</li>
<li>Campbell, L., Trendell, J., Spears, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+cells+migrating+from+the+thecal+layer+of+ovarian+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of cells migrating from the thecal layer of ovarian follicles.</a> Cell Tissue Res. 353 (1), 189-194 (2013).</li>
<li>Pratt, T., Sharp, L., Nichols, J., Price, D. J., Mason, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+and+transgenic+mice+ubiquitously+expressing+a+tau-tagged+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells and transgenic mice ubiquitously expressing a tau-tagged green fluorescent protein.</a> Dev. Biol. 228 (1), 19-28 (2000).</li>
<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li>
<li>Maiani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reply+to%3A+cisplatin-induced+primordial+follicle+oocyte+killing+and+loss+of+fertility+are+not+prevented+by+imatinib%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Reply to: cisplatin-induced primordial follicle oocyte killing and loss of fertility are not prevented by imatinib.</a> Nat. Med. 18 (8), 1172-1174 (2012).</li>
<li>Spears, N., Bruin, dr, Gosden, J. P., G, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+establishment+of+follicular+dominance+in+co-cultured+mouse+ovarian+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Fertil%22%5BJournal%5D)">The establishment of follicular dominance in co-cultured mouse ovarian follicles.</a> J. Reprod. Fertil. 106 (1), 1-6 (1996).</li>
<li>Desmeules, P., Devine, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+ovotoxicity+of+cyclophosphamide+metabolites+on+cultured+mouse+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sc%22%5BJournal%5D)">Characterizing the ovotoxicity of cyclophosphamide metabolites on cultured mouse ovaries.</a> Toxicol. Sc. 90 (2), 500-509 (2006).</li>
<li>Tagler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoting+extracellular+matrix+remodelling+via+ascorbic+acid+enhances+the+survival+of+primary+ovarian+follicles+encapsulated+in+alginate+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Promoting extracellular matrix remodelling via ascorbic acid enhances the survival of primary ovarian follicles encapsulated in alginate hydrogels.</a> Biotechnol. Bioeng. 111 (7), 1417-1429 (2014).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

אנו מתארים כאן מערכות תרבות שונות שיכול להיות מנוצלת כדי לתמוך בפיתוח של זקיקים בשחלות עכבר במבחנה, באמצעות השחלות יילודים כל המכילות רק את השלבים הראשונים זקיק, זקיקים בשחלות preantral פרט וגם שיתוף תרבויות של שתי רקמות. תרבות של השחלות עכבר בילוד תומכת בפיתוח שחלות בשלב מוקדם, ייזום צמיחה במיוחד זקיק עד שלב הזקיק המשני. טווח גילים של עכברים בילוד יכול לשמש לתרבויות אלה, בהתאם לשלבי ההתפתחות של עניין. אם השחלות מתקבלות מעכברים שזה עתה נולד, היווצרות זקיק תהיה בעיצומו, אך עדיין לא שלם: התרבות לפחות באופן חלקי תתמוך היווצרות זקיק המשך אחרי צמיחת זקיק. לחלופין, שימוש בשחלות מעכברים סביב ימים ארבעה עד חמש של גיל (שבו היווצרות זקיק הזמן היא מלאים כבר) תוצאות בתרבות של מספר רב יותר של Folli הקדמוני וגדלcles 12. היבטים חיוביים של הטכניקה הספציפית המתוארת כאן כוללים שימוש בממברנות פוליקרבונט צפים, המאפשרות חמצון גדול יותר של הרקמה, ותרבות במדיום מאוד בסיסי ובו רק αMEM וBSA, הימנעות משימוש בתוספים לא מוגדרים כגון סרום. תרבות של כל השחלות לא נראית לתמוך בהתפתחות מעבר לשלב הזקיק המשני, עם התפתחות מאוחרת יותר הדורשת שינוי בטכניקה, כגון הנתיחה של מתחמי תא הזקיק-granulosa מהשחלה בילוד התרבותית 1. בשלבים מאוחר יותר של התפתחות זקיק ניתן לפתח במבחנה על ידי לנתח את פרט, זקיקים מראש Antral מאוחר שלמים, שניתן לגדל בשלב preovulatory בתרבות, תוך שמירה על המבנה התל-ממדי שלהם. השימוש בזקיקים שלמים לטכניקת תרבות זו שומר על מערכת היחסים בין המרכיבים השונים זקיקים כפי שמתרחש בגוף חי. תימערכת התרבות שלהם ניתן להשתמש כדי להשיג ביציות שיכולות לתמוך הפריה והתפתחות עובר שלאחר מכן. ניתן גם להשיג ביציות Fertilizable משחלות בילוד עכבר באמצעות פרוטוקול ראשוני תרבות הרבה כפי שתואר כאן, ואחריו שלב שני שבמהלכו מתחמי תא הביצית-granulosa גדלים במבחנה 1. מערכות אחרות המשמשות לעתים קרובות למדי היום כוללות תרבות של זקיקים או רקמה שחלה שכבר הגלום בחומר כגון הידרוג&#39;ל אלגינט, כדי לספק תמיכה (ראה, למשל, Tagler et al. 13). חלק גדול מהמוקד של פיתוח שיטה עכשיו הוא לשפר טכניקות תרבות לשחלות וזקיקים של יונקים גדולים, במטרה לטווח הארוך של קבלת ביציות fertilisable מזקיקים ראשוניים מתוך מגוון רחב של מינים, כולל בני אדם. בכל זמן נתון, השחלות יונקים מכילות זקיקים בטווח של שלבי התפתחות, עם interactions בין זקיקים המשפיעים על הוויסות שלהם. היבט זה של תפקוד השחלות הוא הבין היטב וקשה לבחון in vivo. השיטה הסופית המתוארת כאן משתמשת במערכות שיתוף תרבות לתמיכה בפיתוח של שלבים שונים של זקיקים במבחנה. במידת הצורך, ניתן מראש טופלו רקמות אחד או שניהם in vivo או במבחנה לתרבות המשותפת לפני. מערכות שיתוף התרבות כגון זו מספקות דרך אידיאלית שבי לבחון אינטראקציות זקיק זקיק, למשל איך גדל, זקיקי Antral להשפיע על בריכת הזקיק הקדמונית, היבטים של ביולוגיה השחלות שהוכיחו קשה לבחון עד עכשיו. טכניקות תרבות השחלה כולם פשוטות למדי, אם כי נדרשת נתיחה זהירה, כדי למנוע נזק לרקמות מקריות. Dissection של זקיקים בודדים הוא טכניקה מיוחדת, הדורשת תרגול חוזר ונשנה לפני יכולים להיות גזורים מזקיקים בשלב הנכון משחלת שלמות וללא ניזק. זה קריטילנתח את זקיקים בודדים בזהירות, או נזק שנגרם במהלך פרוטוקול הנתיחה יכול לגרום למות זקיק בתקופת התרבות שלאחר מכן. איפה זקיקים ממוקמים ישירות לתוך הבאר של צלחות microtiter, חשוב להשתמש פלסטיק התרבות הלא-רקמה שטופל רק, כדי למזער את ציפוי של תאי thecal על הפלסטיק: אם נעשה שימוש בplasticware טופל בתרבית רקמה, הזקיקים יצרפו ל בסיס של הבאר וקרע ככל שהם גדלים. לכל עבודת שיתוף התרבות, רקמות חייבות להיות ממוקמות ישירות בקשר אחד עם השני. הבינוני שפורט לעיל לשימוש בטכניקת תרבות הזקיק כולל תוספת של סרום עכבר. אפשר להחליף את סרום העכבר עם סרום שור עוברי, אבל רק מדי פעם קבוצות של סרה כזה יתמכו באופן מלא התפתחות זקיק לבמה preovulatory, עם סדרת בדיקות הנדרשות לזהות מקורות מתאימים. אצווה-בדיקה של FSH כן, מומלצת, כUni הבינלאומיts שבו FSH מוערך לתאם רק בגסות לצמיחת זקיק במבחנה. אם קרע הזקיק מתרחש באופן שגרתי במהלך תקופת התרבות, תשקול להחליף את חומצה אסקורבית מניות עם קבוצה חדשה. הטכניקות אינן דורשות ציוד מיוחד במיוחד אחר מאשר מיקרוסקופים לנתח וחממות תרבית רקמה, למרות ששימוש בזרימה למינרית וטכניקה סטרילית טובה לאפשר לזקיקים בשחלות ללהיות מתורבת בהיעדר האנטיביוטיקה, כמו בשיטות שתוארו כאן. זה יכול להיות מועיל, כדי למנוע כל השפעה מזיקה פוטנציאל של אנטיביוטיקה בביציות, במיוחד אם הם להפריה הבאה תרבות. שבו לא ניתן לעבוד בסביבת סטרילית, רצוי להוסיף אנטיביוטיקה לתקשורת לנתיחה והתרבות.

השחלה היונקים מורכבת מהאספקה ​​של נקבת חיים של ביציות, כל כלול בתוך זקיק בשחלה. הזקיקים נוצרים לפני הלידה במנוחה, שלב ראשוני: פעם אחת בריכת הזקיק הוקמה, יש תנועה מתמדת והדרגתית של זקיקים מהקדמוניים לתוך בריכת הזקיק גדלה. כאשר זקיקים מתחילים לגדול, הם מפתחים בשלבים הראשוניים, שניוניים, preantral ולאחר מכן Antral, עד שהם מגיעים preovulatory, או Graafian, שלב. יש רק ביציות מזקיקי preovulatory יכולת התפתחותית מלאה, מסוגל לתמוך בהתפתחות עוברית לטווח, אם מופרה. השחלה כבר זמן רב ידוע לפתח באופן פיסיולוגי מאוד במבחנה. זה עשוי להיות בגלל כל זקיק בשחלה המכיל בתוכו את התאים דרושים כדי לתמוך בביצית מהבמה בשלה (ובשלב זה הוא לא הצליח להשלים את חלוקת meiotic) ועד לtהוא שלב בחינה התפתחותית מוסמך (ובשלב זה יכול לתמוך בהשלמת מיוזה, הפריה וההתפתחות של עובר וכתוצאה מכך לטווח מלא). הטבע הפיזיולוגי של התפתחות השחלה במבחנה הוביל לשימוש הנרחב בטכניקות תרבות השחלה. כתוצאה מכך, במבחנה השיטות נעשו שימוש כדי לחקור הרגולציה של פיתוח השחלה, פתולוגיה השחלות (למשל זה של תסמונת שחלות פוליציסטיות, PCOS), בדיקה של כמה השחלות / ביציות מושפעות מחשיפה לכימיקלים, וגם במטרה המעשית של קבלת ביציות fertilizable מזקיקים בשחלות בראשיתי. עד כה, האחרון הושג רק באמצעות רקמת השחלה עכבר 1, למרות שטכניקות תרבות באמצעות זקיקים מיונקים גדולים, כולל בני אדם, השתפרו מאוד בשנים האחרונות 2,3. אנו מתארים כאן כמה שיטות תרבות באמצעות רקמת השחלה עכבר. Metho הראשוןד משתמש השחלות עכבר בילוד כל, ותומך בהיווצרות וההתפתחות המוקדמת של זקיקים בראשיתי 4. מערכת השנייה תומכת בצמיחה של זקיקים בודדים, ללא פגע משחלות preantral מאוחר לבמה preovulatory; שימוש בטכניקה זו, יכול להיות מתורבת זקיקים בנפרד, או בזוגות 5,6. לבסוף, אנו מתארים מערכת שיתוף תרבות, המשלבים את שתי הטכניקות הראשונות בשיטה המאפשרת חקירה של האינטראקציות בין גובר וזקיקים בשחלות קדמוניים 7. תרבות של זקיקים בשחלות בשלמות פרט מאפשרת צמיחת זקיק שתיקבע ממדידות זקיק יומיות בתקופת התרבות, תוך ניתוח בינוני מאפשר חקירה של זקיק / ייצור הורמון השחלה. ניתן להשיג ניתוחי רקמות נוספים על ידי אוסף של זקיקים או רקמת השחלה בסוף התרבות, לניתוחי immunohistological / היסטולוגית או לעיבוד שלאחר מכן למשל להשיגmRNA או חלבונים.

<table><tbody><tr><td>Leibowitz L15</td><td>Invitrogen</td><td>11415049</td><td></td></tr><tr><td>&; MEM</td><td>Invitrogen</td><td>22571020</td><td>מסופק כנתרן ביקרבונט חוצץ (2,200 מ"ג/ליטר)</td></tr> <tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A9418</td><td>לדיסקציה בינונית</td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A3311</td><td>לתרבית בינונית</td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A2153</td><td>לציפוי פיפטות זכוכית</td></tr><tr><td>סרום עכבר</td> <td>-</td><td>-</td><td>נאסף מניקוב לב</td></tr><tr><td>FSH</td><td>Merck Serono</td><td>Gonal F</td><td>בדיקת אצווה נחוצה לעתים קרובות. פתרון מלאי איפור של 1IU/10&micro; l ב & אלפא; MEM ואחסן ב-20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>חומצה אסקורבית</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4034</td><td>איפור מלאי של 5 מ"ג/מ"ל ב &אלפא; MEM ואחסן ב-20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>שמן סיליקון</td><td>VWR</td><td>630064V</td><td>Dow Corning נוזל סיליקון 200/50cS</td></tr><tr><td>מסנני מזרק (25 מ"מ, 0.2 ומיקרו; m)</td> <td>מסנן אצטט תאית Greiner</td><td>16532K</td><td>לסינון גדול יותר (> 5 מ"ל) נפחים של בינוני.</td></tr><tr><td>מסנני מזרק (13 מ"מ, 0.2 ומיקרו; m)</td> <td>Iwaki</td><td>3032-013</td><td>מסנן אצטט תאית לסינון קטן יותר (< 5 מ"ל) נפחים של</td></tr><tr><td>מסנני מזרק בינוניים (25 מ"מ, 0.45 ומיקרו; מ)</td> <td>Iwaki</td><td>2053-025</td><td>מסנן אצטט תאית לסינון שמן.</td></tr><tr><td>צינורות סטריליים</td><td>גריינר</td><td>187261</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 24 בארות</td><td>גריינר</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תחתונה עגולה 96 בארות</td><td>איוואקי</td><td>3875-096</td><td>השתמש רק בצלחות שאינן מטופלות בתרבית רקמות</td></tr><tr><td>96 באר עם תחתית שטוחה</td><td>איוואקי</td><td>3860-096</td><td>השתמש רק בצלחות שאינן מטופלות בתרבית רקמות</td></tr><tr><td>ממברנות נוקלאופור Whatman</td><td>Camlab</td><td>WN / 110414</td><td>השתמש במשטח מבריק למעלה, פוליקרבונט, קוטר 13 מ"מ, 8.0 ומיקרו; m גודל נקבוביות</td></tr><tr><td>מחטי אינסולין</td><td>BD ציוד רפואי</td><td>037-7606</td><td>0.33 מ"מ (29 גרם) + 1 מ"ל</td></tr><tr><td>כלי עובר מזכוכית</td><td>VWR</td><td>720-0579</td><td>לעקר, ואז לחמם לפני השימוש.</td></tr><tr><td>פיפטות זכוכית</td><td>של Fisher Scientific</td><td>10209381</td><td>מצופות BSA לפני השימוש.</td></tr><tr><td>קצות ג'ל</td><td>AlphaLabs</td><td>LW1103</td><td></td></tr><tr><td>מחטי דיקור סיני</td><td>Acumedic LTD</td><td>30 מ"מ x 0.25 סוג C</td><td></td></tr><tr><td>Bouin' s תמיסת</td> פורמלין מקבע <td>Sigma Aldrich</td><td>HT10132-1L</td><td></td></tr><tr><td>, חוצץ ניטרלי, 10%</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>HT5014-120 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינורות פוליפרופילן</td><td>Greiner BioOne</td><td>616201</td><td></td></tr></tbody></table>

תרבות ושיתוף התרבות של עכבר שחלות וזקיקים בשחלות

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

השחלה היונקים מורכבת של זקיקים בשחלות, כל זקיק המורכב מביצית אחת מוקפת בתאים סומטיים granulosa, מצורף יחד בתוך קרום במרתף. בריכה סופית של זקיקים הוא הניחה במהלך התפתחות עוברית, כאשר ביציות במעצר meiotic ליצור קשר קרוב עם תאי granulosa שטוחים, ויצרו זקיקים בראשיתי. על ידי או זמן קצר לאחר לידה, השחלות יונקים מכילות אספקה ​​של חייהם של זקיקים בראשיתי, שממנו נקודה זו ואילך יש שחרור קבוע של זקיקים לתוך בריכת הזקיקים גדלה. השחלה היא נוחה במיוחד להתפתחות במבחנה, עם זקיקים גדלו באופן פיסיולוגי מאוד בתרבות. עבודה זו מתארת ​​את התרבות של השחלות בילוד כל המכילות זקיקים בראשיתי, והתרבות של זקיקים בשחלות בודדים, שיטה שיכול לתמוך בפיתוח של זקיקים מבוגרים ועד לpreovuשלב latory, לאחר שהביציות שלהם מסוגל לעבור הפריה חוץ גופית. העבודה המתוארת כאן משתמשת במערכות תרבות כדי לקבוע כיצד השחלה מושפעת מחשיפה לתרכובות חיצוניות. גם אנו מתארים מערכת שיתוף תרבות, המאפשרת חקירה של האינטראקציות המתרחשות בין זקיקים גדלו והבריכה שאינו הצומחת של זקיקים בראשיתי.

איור 1 מציג תמונות של השחלות וזקיקים בתחילת, ובמהלך, נהלי התרבות. איור 2 מציג תוצאות נציג של השחלות בילוד (כאן, השחלות מגורים שנולדו) נחשפו לרעלי רבייה במהלך התרבות. השחלות בילוד היו בתרבית במשך 6 ימים, ונחשפו לתרופה כימותרפית, או ציספלטין או דוקסורוביצין, ביום 2 של התרבות. בסופו של התרבות, השחלות היו קבועות, מעובד להיסטולוגיה, ושחלות אז בדקו כדי לקבוע את מספר זקיקים בשחלות בריאים ולא בריאים 4. לחלופין, ניתן לקבל הערכה מהירה יותר של זקיקים גדלו מוקדם מהתרבות של שברי השחלות, באמצעות השחלות מעכבר להביע סמן פלואורסצנטי ביצית ספציפית 10. במהלך התרבות של זקיקים בודדים, צמיחת זקיק ניתן ללמוד בקלות על ידי מדידות יומיות ברחוב ללא מוצאture תקופה. איור 3 מציג תוצאות נציג של הצמיחה של זקיקים בתרבית בנוכחות או עדר של הורמוני gonadotrophin הורמון מגרים זקיק (FSH) והורמון luteinizing (LH) 5. זקיק זקיק או זקיק בשחלה-שיתוף תרבות יכול לשמש כדי לחקור אינטראקציות בין זקיקים. בהתאם לרקמות והעיבוד, ניתן לקבל תמונות באמצעות בהיר שדה, הקרינה או מיקרוסקופים confocal. איור 4 מציג תוצאות נציג של תמונות משיתוף תרבויות כגון, בוחנים סוגים שונים של תאים מעורבים בתקשורת זקיק זקיק, כוללים אנדותל ותאים עצביים 7. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52458/52458fig1highres.jpg" width="650" /> איור 1: (א) Photomicrograph של השחלה יילודים המתקבלת מעכבר ביום הלידה, הניח<html> על קרום פוליקרבונט. (ב) Photomicrograph של טרי גזור זקיק בשחלה בריא, עם רוב של הרקמות המקיפות את סטרומה גזור משם. (C) Photomicrographs של התרבות המשותפת של שני זקיקים בשחלות בשלושה הימים הראשונים של תרבות, המראה את הקשר ההדוק שנוצר בין שני הזקיקים כתמורת התרבות (Ci: היום הראשון של תרבות; כת&quot;ש: יום שני של תרבות; Ciii : יום שלישי של תרבות). לשכפל מאל ספירס et. 11 (ד) Photomicrograph של זקיק preantral שיתוף תרבותי ושחלה בילוד לאחר יומיים של התרבות. תמונה מראה את הזקיק הופך כמוס על ידי השחלה. חץ מראה זקיק preantral. תמונה מתוך ד&quot;ר פדריקה לופס. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52458/52458fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> &quot;Src =&quot; תרשים 2 &quot;/&gt; / קבצים / ftp_upload / 52,458 / 52458fig2.jpg איור 2: השפעה של התרופות כימותרפיות ציספלטין ודוקסורוביצין על השחלות בתרבית בילוד ציספלטין ודוקסורוביצין שני להוביל לאובדן של בריאות זקיק וירידה במספרי זקיק.. ציספלטין (); (ב) דוקסורוביצין: (i) אחוז מהזקיקים בריאים (ברור); וכן (ii) מספר כולל של זקיקים (מוצל) בכל השחלה. ברים לציין מתכוונים + SEM; n = 5 עבור כל הקבוצות, כוכבים לציין הבדלים משמעותיים ביחס לשליטה (* p &lt;0.05, ** p &lt;0.01, *** p &lt;0.001). לשכפל מאל מורגן et. 4 <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52458/52458fig3.jpg" width="400" /> איור 3:. צמיחת שיעורים של זקיקים נחשפו לסביבות שונות gonadotrophin ערכים הם ממוצעים ± SEM (n ≥16 לכל קבוצה). חץ מציין את תחילתו של antraהיווצרות l בכל קבוצות gonadotrophin. לשכפל מאל Murray et. 5 <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52458/52458fig4highres.jpg" width="650" /> איור 4: תמונות משיתוף תרבויות זקיק זקיק ושחלת זקיק, המציגות אינטראקציות זקיק זקיק מיקרוסקופ Confocal של חלבון פלואורסצנטי ירוק זקיק (GFP) וwild-type (WT) זקיק לאחר שיתוף התרבות ((). ביטוי של GFP מוצג כאן בלבן), עם תהליכים מזקיק GFP מוצג משתרע על פני זקיק WT. חתך דרך GFP / מורכב זקיק WT הבא שיתוף תרבות (B), שהראה כי תהליכי GFP (ירוק) משקר הזקיק הסמוך הסמוך לlamina הבסיס של זקיק WT. השחלה (C) הילודים WT הבא תרבות עם מראש Antral זקיק, שהראה כי תאי GFP ותהליכים תאיים (ירוק) להביע GFP היגרודרך interstitum השחלות של השחלה בילוד. GFP / מורכב זקיק (D) WT המכיל תאי אנדותל, שמוצגים על ידי ביטוי של CD31 אנדותל סמן תא (אדום). GFP (E) / מורכב זקיק WT המכיל תאים עצביים, שמוצגים על ידי ביטוי של טובולין בטא סמן העצבי III (ראה כאן כאדום, או צהוב אם עם GFP-פעמיים שכותרתו, ירוקות). מורכב (F) YFP / WT זקיק, שבו YFP מתייחס לזקיק מעכבר Thy1-YFP שיש ביטוי מזדמן של חלבון פלואורסצנטי הצהוב (YFP: צהוב) בתת-קבוצה של תאים עצביים 9, שהראה כי תאי עצב להאריך מזקיק YFP. ברים 50 מיקרומטר (A, B, D), 100 מיקרומטר (C, E, F), 100 מיקרומטר (הבלעה ב), 10 מיקרומטר (הבלעה בC), 15 מיקרומטר (הבלעה בD). לשכפל מאל Campbell et. 7 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52458/52458fig4highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של fi זה</a>תרשים.

פרוטוקול זה מתאר את התרבות העיקרית / שיתוף התרבות של רקמת השחלה עכבר, באמצעות השחלות מעכברים בילוד וזקיקים בשחלות בודדות מעכברים לפני גיל בגרות מיניים. טכניקות התרבות לתמוך בפיתוח באופן פיסיולוגי מאוד, המאפשר חקירה של ההשפעה של סוכנים חיצוניים בשחלה, ושל יחסי גומלין בין זקיקים בשחלות.

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לגדל שחלאות של רכים להולדה ו/או זקיקי שחלה בודדים במעבדה (in vitro). דבר זה מושג תחילה על ידי הפקה של שחלאות מנקבות צעירות בגיל המתאים. השלב השני הוא הכנת הרקמה, הכוללת דיסקציה עדינה של זקיקי שחלה בודדים באמצעות מחטי דיקור.לאחר מכן, השחלות של היילודים או זקיקים פרה-אנטרליים בודדים גודלים בתרבית עם הזנה סדירה, והשלב הסופי הוא קיבוע או הקפאה של הרקמה לצורך אנליזה היסטולוגית או מולקולרית. בסופו של דבר, מערכת התרבית תומכת בהתפתחות באופן פיזיולוגי מאוד וניתן להשתמש בה כדי לבחון את הוויסות של התפתחות זקיקי השחלה ולחקור אינטראקציות בין זקיקים פרימורדיאליים לזקיקים גדלים בשחלה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שזקיקי שחלה שלמים נתמכים לאורך התפתחות הזקיק, תוך שמירה על המבנה התלת-ממדי שלהם ללא צורך במטריצות תומכות.שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה של השחלה, וכן בבחינת ההשפעות של תרכובות רעילות, כגון כימותרפיה ותרופות שונות, על השחלה ועל הפוריות הנשית. הרעיון לביצוע תרבית משותפת (co-culture) של זקיקי שחלה בגילאים ובשלבים שונים עלה לראשונה במהלך דיון על דרכים לבדיקת השפעתם של זקיקים בצמיחה על מאגר הזקיקים הראשוניים (primordial follicles) הנמצאים במצב מנוחה. לצד סטף מורגן וליסה קמבל, ידגימו את הטכניקה ויוויאן אליסון, טכנאית מהמעבדה, ואליסון מורי, שהייתה חוקרת פוסט-דוקטורט במעבדה במשך שנים רבות. שתיהן סייעו בפיתוח היבטים מרכזיים של הטכניקה להכנת הפ pipette-ים עבור פרוטוקול זה.חממו וכופפו פיפטות זכוכית מעל להבה ובצעו חיתוך נקי באמצעות חותך זכוכית. לאחר מכן, עקרו את הזכוכית המעוקלת בטמפרטורה של 160 °C למשך כ-45 דקות. השגת הקימור הנכון בפיפטה עבור הטכניקה שלכם דורשת תרגול.חתכו תמיד את הפפיטה באמצעות חותך זכוכית כדי למנוע שברים חדים של זכוכית. יש לוודא גם כי לקצה הפפיטה יש את הקוטר המתאים לרקמה שלכם. סטריליזציה של תווך הדיסקציה, העשוי מתווך Lebowitz L 15 עם BSA, תתבצע באמצעות פילטר של 0.2 מיקרון. הפילטר הוא בקוטר 25 מילימטרים ומשמש לסטריליזציה של תרבית שחלה נבוןאטלית.סננו את המצע דרך מסנן נוסף של 0.2 micron בקוטר של 25 millimeters בלבד ואספו אותו לשפופרת סטרילית. לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של מצע לנאונטלים (neonatal medium) לכל באער של פלטה בעלת 24 באערים והעבירו ממברנה אל פני המצע בכל באער.גם את מצע התרבית לזקיקים יש לעקר באמצעות סינון, בדומה למצע התרבית לשחלה. לאחר מכן, יש לעקר באמצעות סינון גם את שמן הסיליקון. בשלב הבא, יש להכין פלטות תרבית בעלות 96 בארות על ידי הנחת טיפות של 30 µL ממצע התרבית לזקיקים לאורך השורה העליונה.כסו בזהירות את הבארים הללו ב-70 µL של שמן סיליקון. לחלופין, תרבית משותפת של זקיקים (follicle follicle co-culture) דורשת 100 µL של מצע עם שכבת כיסוי של 100 µL של שמן סיליקון. לאחר מכן, הכינו פלטות לתרבית משותפת של זקיקים ושחלה (follicle ovary co-culture) עם 1 mL של מצע לכל באר וממברנת nuclear po שעברה סטריליזציה ב-UV והונחה בזהירות רבה.התחילו בהעברת מיליליטר אחד של תמיסת ניתוח לכל צלחת זכוכית סטרילית לעוברים. לאחר צביעת הגורים בבני 0 עד 5 ימים לאחר הלידה, אחזו בעור המכסה את דופן הבטן בעזרת פינצטה עדינה ובצעו חתך בעור ובדופן הגוף. פתחו את החתך הגדול כדי לחשוף את הבטן.שלפוחית השתן בדרך כלל מלאה בשלב זה וניתן לנקבה כדי להקל על הניתוח. בעזרת פינצטה עדינה (של שעוניהים), הסיטו הצידה את המעיים. לאחר מכן, בשני הצדדים, עקבו אחר קרני הרחם מהשלפוחית ועד לכליה.השחלה היא מבנה דמוי ענן הממוקם ממש מתחת לכליה, בחלקו העליון של הרחם. אחזו בשחלה בעדינות ובאמצעות מספריים, גזרו אותה מהרחם.לאחר הוצאת שתי השחלות, העבר אותן לצלוחיות מלאות בתווך דיסקציה חמים. השתמש במיקרוסקופ דיסקציה עם במה מחוממת ל-37 °C כדי לבצע את הדיסקציה של השחלות באמצעות מחטי אינסולין. הסר את השק הבזאלי וכל חומר עודף, כולל את חלבון הביץ (fallopian tube), עד שתישאר השחלה בלבד.לאחר מכן, העבירו כל שחלה לבאר בלוחית מוכנה באמצעות פיפט מעוקל. הניחו שחלה אחת על כל תרבית ממברנה; במהלך גידול הרקמה, החליפו מחצית מהתווך מדי יומיים למשך עד שישה ימים. בעת החלפת התווך, מקמו את קצה הפיפט בשולי באר התווך כדי למנוע הפרעה לממברנה. לאחר התרבית, ניתן לשמור את השחלות בהקפאה, או לקבע אותן לצורך היסטולוגיה או אימונוכימיה.לאחר איסוף השחלות מעכברים מבוגרים לתוך צלחת עם תמיסת דיסקציה חמה, הסירו את ה-Basa השחלאית. השתמשו במחטי אינסולין כדי לגזום את השק הבזאלי וכל חומר עודף, כולל את חצוצרת הביצה, עד שנותרה השחלה בלבד. לאחר מכן, חתכו את השחלות לחצי באמצעות המחטים והעבירו בזהירות כל חצי לזכוכית שעון נפרדת המכילה 1 mL של תמיסת דיסקציה.כסו את זכוכיות השעון באמצעות פלטה של זכוכית ואחסנו אותן בתנור למשך עד שעה בהקדם האפשרי. בעבודה תחת מיקרוסקופ בעל במה מחוממת בתוך מנשף זרימה למינרית, פרקו את השחלות לחתיכות גדולות באמצעות מחטי אינסולין כדי לזהות זקיקים פרה-אנטרליים מאוחרים. הזקיקים הפרה-אנטרליים מכילים שתי עד שלוש שכבות של תאי גרנולוזה וקוטרם הוא כ-180 עד 200 micrometers.הוציאו כל אחד מהם באמצעות מחט דקה ומחט דיקור המוחזקת על ידי תופסן מחטים, תוך הימנעות מפגיעה ב-basal lamina, אך הקפידו להסיר את ה-S stroma שסביבם. פעולה זו דורשת תרגול. הזקיק זקוק לכמות מסוימת של רקמה צואתית, אך לא ליותר מדי.כמו כן, אם תהליך הניתוח גס מדי, הזקיקים עלולים להינזק, להתבקע או למות. לצורך התרבית, המשתמש הכין וסת (perpe) כדי להעביר בזהירות את הזקיקים אל פטריית שגג מלאה במצע חדש. יש להניח את הזקיקים על החלק הדק של הוסת תוך שימוש בעדשה עם סקאלה המותקנת על מיקרוסקופ דיסקציה.מדדו את הזקיקים. אם הם בטווח של 10 micrometers מקוטר של 190 micrometer, ניתן להשתמש בהם לתרבית; השליכו את שאר הזקיקים מתוך הזקיקים שנבחרו.יש לבחור רק את הזקיקים הבריאים ביותר לתרבית. עליהם להיות שקופים, ללא אזורי רשת כהים, בעלי למינה בסיסלית תקינה ועם מעט רקמת תקה (thecal tissue) צמודה. תנובה טובה היא 10 עד 15 זקיקים לכל שחלה.כעת, באמצעות פיפט מעוקל מוכן, העבירו את הזקיקים הללו לצלחת תרבית של 96 בארות שהוכנה מראש. מקמו זקיק אחד בכל בארה מתחת לשכבת השמן והבאיעו. יש לתחזק את הזקיקים למשך עד שישה ימים, מדי יום.הכינו שורה חדשה עם מצע גידול. לאחר שעה או יותר, העבירו את הזקיקים לשורה הבאה של מצע מאוזן טרי, או במקרה של תרביות קו-קלטורה של זקיקים, תרבתו שני זקיקים זה לצד זה בבאר אחת. במקום להעביר אותם, השתמשו בטיפ ג'ל עדין כדי להחליף מחצית מהמצע מדי יומיים.עבור תרביות משותפות של זקיק ושחלה, העבירו זקיק לשחלה נאו-נטלית המונחת על ממברנה בתוך פלטת תרבית, הניחו בזהירות את הזקיק לצד אחד מהקטבים של השחלה הנאו-נטלית כך שניתן יהיה להביאם למגע זו עם זו. תחזקו תרבית זו למשך עד חמישה ימים, תוך החלפה של 500 microliters מהמצע מדי יומיים.זקיקים טרום-אנתרליים הופכים לעיתים קרובות למעטופים על ידי השחלות הניאונטליות. במהלך תרבית זו, שחלות ניאונטליות של רכיםנולודים גודלו במשך שישה ימים ונחשפו לרעלים רבייתיים. ביום השני של התרבית, הרקמות עובדו כדי לקבוע את מספרם ואת בריאותם של זקיקים בשלבים שונים.אחד החומרים הרעילים שנבחנו היה cisplatin. החומר הרעיל השני שנבחן היה doxorubicin. ניסוי אחר בחן את השפעת הורמון מעורר זקיקים (FSH) והורמון לוטאינאיזציה (LH) על צמיחתם של זקיקים בודדים.אך בניתוח זה נמדד גודל הזקיקים באופן מחזורי כדי למפות את גדילתם. נבדל תרבית משותפת של זקיקים באמצעות זקיק המבטא GFP וזקיק מסוג בר (wild type), כאשר תהליכים התפשטו מאחד לשני. עיבוד אימונוהיסטוכימי של תרבית משותפת זו חשף כי תהליכי ה-GFP שכנו בתוך אלו של הטיפוס הבר.שכבת הת'קה, שחלאים של רכים נולדים מסוג בר (wild type), תורבתו יחד עם זקיקים המבטאים GFP. בתרחיש זה, תאי ה-GFP נדדו דרך הסטרומה השחלאית. תרבית של שחלה של רכים נולדים היא שיטה פשוטה למדי, אך יש לצפות להשקעת זמן עד לשליטה בטכניקת הדיסקציה של זקיקים טרום-אנטרליים שלמים וללא פגע.דבר זה חיוני להתפתחותם התקינה. לאחר תרבית הזקיקים, ניתן להפריות את הביציות באמצעות הפריה חוץ-גופית (in vitro fertilization), ולאחר מכן ניתן להעביר את העוברים לנקבות בהיריון דמה ולהשיג צאצאים חיים.

culture-and-co-culture-of-mouse-ovaries-and-ovarian-follicles

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

בסרטון זה אנו מתארים הליך כירורגי לבידוד שחלות מעכבר יילוד.

בידוד שחלות עכבר יילודים: הליך כירורגי לקצירת זוג שחלות ממודל עכבר יילודים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לכמת זקיקי השחלה בתרבית של עכברים צעירים ללא חלוקתה טורי. שימוש immunofluorescence כל איבר ורקמה ניקוי, חלוקתה הפיזי מוחלף עם חלוקתה אופטי. שיטה זו של הכנת הדוגמא והדמיה שומר על תקינות האיברים ואסטמה ומקילה על כימות אוטומטיות של תאים ספציפיים.

Immunofluorescence הר שלמה, זקיק כימות של השחלות תרבותי. העכבר

בתרביות רקמה השחלות יכול לשמש דגמים של זקיק פיתוח, הביוץ זקיק בהכנת ולציין את מנגנוני הרגולציה של תהליכים דינאמיים השחלות.

תרביות רקמה השחלות כדי לחזות תופעות העכבר השחלה

תרבות מבינטית של קליפת המוח השחלות שור ואת ההשפעה של דיאטה תזונתית מדרגות צעד על microenvironment השחלות מוצג. חתיכות קליפת המוח השחלתית היו מתורבתים במשך שבעה ימים, סטרואידים, ציטוקינים, ושלבי זקיק הוערכו. טיפול דיאטה מדרגות-צעד היה סטרואידוגנזה מוגברת וכתוצאה מכך התקדמות זקיק בתרבות.

תרבית רקמת קליפת המוח השחלות

אנו מתארים שיטות לתרבית זקיקי שחלות בתבנית אגרוז חדשה ללא פיגומים המשלימים את הגמטוגנזה במבחנה .

ייצור ושימוש בתבניות אגרוז הניתנות להתאמה אישית לתרבית זקיקי שחלות עכבר ללא פיגומים

אנו מתארים שיטות לבידוד תאי סומטיקה של שחלות העכבר מחלק מועשר בסטרומה של השחלה וליצירת אורגנואידים סומטיים של שחלות העכבר בגישה ללא פיגומים.

חקירת מיקרו-סביבת השחלות: שיטות לבידוד, תרבית דו-ממדית ותרבות אורגנואידית של תאי סומטיקה בשחלות בעכברים

פרוטוקול זה מתאר הליכים לבשלות חוץ-גופית של ביציות עכברים, הפריה חוץ-גופית , ותרבות עוברים לשלב הבלסטוציסט.

ביציות עכברים בבגרות במבחנה, הפריה ותרבות עוברים לפני ההשתלה

מתואר פרוטוקול ליצירת מערכת תרבית משותפת המורכבת מתאי עצב שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs), נוירונים ראשוניים בקליפת המוח ואסטרוציטים. מערכת קו-תרבית זו מאפשרת לזהות היווצרות של מגעים ומעגלים סינפטיים בין נוירונים חדשים שמקורם ב-iPSC לבין נוירונים קיימים בקליפת המוח המבטאים channelrhodopsin-2.

גישת optogenetic להערכת יצירת קשרים עצביים במערכת Co-תרבות

חקר תאי אפיתל תימיים מדולריים במבחנה לא הצליח ברובו, מכיוון שמערכות התרבית הדו-ממדיות הנוכחיות אינן מחקות את תרחיש in vivo. מערכת התרבית התלת-ממדית המתוארת כאן - מודל תרבית אורגנוטיפית של עור שונה - הוכיחה את עצמה כעדיפה בסיכום התפשטות mTEC, התמיינות ותחזוקה של ביטוי גנים מופקר.

דגם 3D Organotypic משותף תרבות תמיכה למניעת הפצת נשק מדולרי הרתי אפיתל תאים, התמיינות וביטוי גנים מופקר

טכניקה מאוד מבטיח לייצר רקמות בונה בלי באמצעות מטריצת התרבות תאים במצב microgravity מדומה. באמצעות מערכת תרבות סיבוביים, בדקנו זקיק השחלות הצמיחה וההתבגרות oocyte במונחים של זקיק הישרדות, מורפולוגיה, צמיחה, הפונקציה oocyte תחת התנאי microgravity מדומה.

במבחנה צמיחה של העכבר זקיקים Preantral תחת Microgravity מדומה

למדו שיטת תרבית רקמות שחלה וזקיקים בודדים בעכברים לחקר ביולוגיה רבייתית. טכניקה זו מאפשרת לחקור אינטראקציות בין זקיקים ולהעריך השפעות של חומרים חיצוניים על פוריות נקבה.

תרבות ושיתוף התרבות של עכבר שחלות וזקיקים בשחלות

גלה סרטונים נוספים