Name: בהדמיה 2 + Ca Situ של מערכת העצבים המעיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: למד דימוי סידן חי של נוירונים ותאי גליה במערכת העצבים המעיים באמצעות צבעי סימון פלואורסצנטיים. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לחקור פעילות תאית בזמן אמת ולהבין את פיזיולוגיית המעי ופתופיזיולוגייתו.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מקרן איגוד המחקר ויצרני התרופות של אמריקה (PhRMA) (ל-B. Gulbransen), מענק המכונים הלאומיים לבריאות (בניית קריירות מחקר בין-תחומיות בבריאות האישה) K12 HD065879 (B. Gulbransen) וקרנות סטארט-אפ מאוניברסיטת מישיגן סטייט (B. Gulbransen).

הערה: ההליכים הבאים הכרוכים ברקמה מחיות מעבדה עולים בקנה אחד עם הנחיות AVMA להמתת החסד של בעלי חיים 2013 ואושרו מראש על ידי IACUC אוניברסיטת מדינת מישיגן. 1. רקמות הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים בעלי חיים מחקר בתא המכיל isoflurane 2.5% בחמצן או על ידי הצבת 3-5 מיליליטר של נוזל על isoflurane חומר סופג על הרצפה של החדר, על מנת להבטיח כי מכשול פיזי מונע מבעלי חיים מגע ישיר עם isoflurane. מבחן לעומק הרדמה על ידי צובט את השודד. הערה: עומק ההרדמה נחשב מתאים כאשר אין רפלקס נסיגה של הגפיים האחורי. ברגע שהרדים כראוי, להרדים את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החיה במצב שכיבה ולנקות את עור בטן עם אתנול 70%. שימוש במלקחיים לצבוט עור בטן בקו האמצע ולהשתמש במספריים כירורגית כדי להפוך את תקשורת 6 סנטימטרחתך l לאורך alba linea לחשוף איברי עיכול פנימיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים בוטים לאתר ולחשוף את המעי בתוך הצפק. חותך את לפדר ileal / מעי גס עם מספריים ולהתחיל לפרום את המעי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שאורכו של המעי נפרם כראוי, לחתוך את דיסטלי המעי אל הקיבה והפרוקסימלי לcecum להכנת מעי. להכנת מעי גסה, לחתוך את דיסטלי המעי הגס לcecum והפרוקסימלי לפי הטבעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר במהירות את קטע המעי ולמקם אותו בכוס עם תקשורת DMEM / F12 בתוספת hydrochloride nicardipine 3 מיקרומטר ו1 מיקרומטר hydrochloride scopolamine (המכונה &quot;תקשורת&quot; להלן) על קרח. התוספת של מעכבים אלו, מסייעת microdissection והדמיה לאחר מכן על ידי משתק את שריר החלק במעי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קטע Cut של עניין (למשל, מעי ריק, מעי, מעי גס דיסטלי או הפרוקסימלי) המבוסס על סמנים אנטומיים הוקמו. בדרך כלל utilizרקמת דואר מהמעי הדיסטלי או המעי הגס דיסטלי. עם זאת, להשתמש באותו ההליך בסיסי לבודד, הנוירונים myenteric עומס ותמונה וגליה בכל האזורים במעי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר קטע קטן (4-6 סנטימטר) של קטע מעי רצוי ומניחים בצלחת פטרי מצופה Sylgard מלאה תקשורת מצוננת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Secure הפרוקסימלי וקצוות מרוחקים של קטע המעי עם סיכות חרקים ולפתוח את צינור המעיים על ידי ביצוע ישר, חתך לאורכו לאורך גבול mesenteric. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמת פין שטוחה תחת מתח אור עם צד רירית וזהירות לנתח משם שכבה רירית באמצעות מלקחיים עדינים (מס &#39;5 ו# 5/45 עבודה הטובה ביותר) ומספריים באביב יפים מאוד. הערה: הסרת הרירית יכולה להיות די טראומטית עבור ENS אם לא נעשה כראוי. להכנות איכות, דואגים להגביל ההסרה פתאומית של הרירית על ידי קילוף או גירוד. התרגול הטוב ביותר הוא להסיר את הרירית ולחתוך עם מספריים מתחת קנס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את הרקמה לתוך הכנה קטנהs (כ 0.5 סנטימטר 2) וסיכה לתוך מנות הדמיה (4 פינות עם שכבת שריר מעגלית כלפי מעלה) הניחה על קרח עם תקשורת טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לנתח את שריר מעגלי על ידי מתגרה בנפרד עם פינצטה בסדר לחשוף את מקלעת myenteric. הימנע ממתיחה מוגזמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת הדמיה חזרה על פתרון קרח ושינוי עם תקשורת טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין 2 מיליליטר של תערובת אנזים לכל צלחת [Dispase 1 U / ml (4.48 מ&quot;ג / 8 מיליליטר), Collagenase סוג II 150 U / ml (5.45 מ&quot;ג / 8 מיליליטר) בתקשורת]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מנות מהקרח ולהוסיף את תערובת האנזים מהצעד 1.13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה מנות ב RT למשך 15 דקות עם 5% CO 2/95% אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנות רקמות לשטוף עם תקשורת 3 פעמים ובפינות מחדש פינים. </li></ol> 2. טוען Fluo-4 Dye הערה: הימנע photobleaching ידי עבודה עם אור מוגבל בזמן טיפול צבעי ניאון ורקמה עמוס צבעי מחוון. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 4 פתרון טעינת Fluo-4 מיקרומטר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1.5 מיליליטר תקשורת ו -1.2 μl של מניית probenecid 250 מ&quot;מ לaliquot 1.5 μl של 4 מ&quot;מ מניית Fluo-4. 4 מ&quot;מ מניית Fluo-4 הוא הוכן על ידי הוספת 11.4 μl של F-127 pluronic (20% בDMSO; בתוספת 0.25% cremaphor-EL) 50 מיקרוגרם של Fluo-4, בבוקר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה preps בפתרון טעינת Fluo-4 במשך 45 דקות בחממה כהה על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מן החממה ולשטוף הכנות עם תקשורת 3 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת תמורת מדיה המכילה 200 מיקרומטר probenecid דגירה 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס לפני ההדמיה. הערה: probenecid הוא תרופה מעכבת מובילי התנגדות multidrug בתאי עצב. תוספת של תרופה זו מעכבת את היכולת של תאי עצב כדי למתוח צבעים ומשפרת תיוג עצבי. תפזורת-טעינה של Ca 2 + צבעי מחוון בהעדר probenecid מייצרת טעינת תא בעיקר גליה. התוספת של probenecid מאפשרת הדמיה של תגובות עצביות וגליה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן השתנה Kreמאגר BS. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך חיץ קרבס שונה כך שהריכוזים הסופיים (מ&quot;מ) של הרכיבים הם אחריו כמו: 121 NaCl, 5.9 KCl, 2.5 CaCl 2, 1.2 MgCl 2, 1.2 לאא 2 PO 4, 10 HEPES, 21.2 NaHCO 3, pyruvic 1 חומצה ו -8 גלוקוז (pH מותאם ל7.4 עם NaOH). הוסף 3 nicardipine מיקרומטר וscopolamine 1 מיקרומטר לעכב התכווצויות שרירים במהלך Ca 2 + הדמיה וכל הר והניתוחים. </li></ol></li></ol> 3. הדמיה וניתוח הערה: השתמש לפחות מתקן הדמיה בסיסי עם מקור אור ניאון, מיקרוסקופ, מצלמת CCD באיכות ותוכנת רכישה מתאימה. להשתנות בתוספת רכיבים אחרים בהתאם למקור האור ויישום ספציפי. גלגל לסנן ותריס יש להשתמש במקור אור קשת קסנון מסורתי. עם זאת, מקורות אור LED ומערכות תאורה לא דורשים רכיבים אלה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את recOrding תא מתחת למיקרוסקופ ובאמצעות מערכת הזרימה זלוף הכבידה עם מאגרי מזרק מחוממים מרובים להקים שיעור זלוף רציף של 2-3 מיליליטר / דקה 37 ° C חיץ קרבס. ודא כדי למנוע היווצרות בועת אוויר בשתי שורת הקלט והיניקה מחוברת למלכודת ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביא את המקלעת הרצויה אל מוקד תחת תאורה בשדה בהירה. הימנע overexposing רקמה, דבר שעלול להוביל להלבנת תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את טעינת Fluo-4 בתוך הגרעינים ובחר הגרעינים בריאים הדמיה. הגרעינים לא בריאים / פגומים יפגינו מורפולוגיה autofluorescence או punctate ולא אמור לשמש להדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שגנגליון נבחר, להסיט את נתיב אור למצלמה ולקבל תמונת חיה עם תוכנת רכישת תמונה. ודא גנגליון שהוא בזמני מיקוד וקצב רכישת תמונה מוגדר וחשיפה. הערה: שיעורי רכישת תמונה וזמנים משתנים בהתאם לאירועי חוקרים רוצים להקליט. עבור רוב הניסויים, תמונותנרכשים באופן מסורתי ב0.5-1 הרץ לתאי גלייה ועד 2-10 הרץ לנוירונים כי Ca 2 + תגובות גליה אינן מהירות כמו Ca 2 + ארעיים בתאי עצב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל בניסוי ולהקים פעילות בסיסית למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל תרופות מחוממות מראש של עניין, כגון אגוניסטים לקולטן ואת יריבים באמצעות מערכת זלוף זרימת כוח הכבידה בשיעור של 2-3 מיליליטר / דקה. עקוב יישום של אגוניסטים / יריבים על ידי חזרה לזלוף של חיץ רגיל ולאפשר תקופת לשטוף / התאוששות של לפחות 10 דקות. הערה: זמני יישום התרופה ישתנו בהתאם למתחם הפרט ותכנון ניסויים. באופן כללי, יישום 20-30 שניות של אגוניסט מספיק להפעלת הקולטנים בשילוב G-חלבון בתאי עצב ותאי גליה. עם זאת, תעלות יונים מגודרת ליגנד (כגון קולטני אצטילכולין ניקוטינית) דורשות פעמים יישום של לא יותר מ 5-10 שניות. חשיפות משך נוספות תגרום תעלות יונים יגנד מגודרות למהירות את אלהnsitize. יריבים צריכים להיות מיושמים על כ 3-15 דקות כדי להבטיח מצור של מסלולי קולט מלא. עם זאת, מדובר בהכללה גסה וחוקרים תמיד צריכים לייעל את כל תרופה ניסיונית בפרדיגמה המסוימת שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפסיק סרט הזמן לשגות הקלטה ותצוגה של הניסוי. אזורים נבחרים בקפידה של עניין (של ROI) באמצעות תוכנת ניתוח תמונה המתאימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש בתוכנה כדי לנרמל ולהשוות עוצמת ניאון ROI נגד ערך ניאון בסיס הראשוני שלה. שינויים בקרינה מנורמלת הם ביחס ישר לשינויים ב[ Ca 2 +]. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בשינוי של שיטה שתואר קודם לכן 26 באמצעות ΔF / F = ((F 1 - F 0) / F 0) ROI - ((F 1 - F 0) / F 0) רקע, שבו F1 הוא הקרינה בכל רגע נתון נקודה וF0 הוא הקרינה תחילת המחקר, כדי לשפר את דיוק ההערכה. עזרי שינוי זהבהפחתת רעש משינויי הקרינה בהכנות רקמה שמפגינים תנועה של שכבת שריר בסיס מקלעת myenteric. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Types+of+neurons+in+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Autonomic+Nervous+System%22%5BJournal%5D)">Types of neurons in the enteric nervous system.</a> Journal of the Autonomic Nervous System. 81 (1-3), 87-96 (2000).</li>
<li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organization+of+the+autonomic+nervous+system%3A+peripheral+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The organization of the autonomic nervous system: peripheral connections.</a> Neuroscience. 130 (1-2), 1-5 (2006).</li>
<li>Pham, T. D., Gershon, M. D., Rothman, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+of+origin+of+neurons+in+the+murine+enteric+nervous+system%3A+sequence+in+relation+to+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Time of origin of neurons in the murine enteric nervous system: sequence in relation to phenotype.</a> Journal of Comparative Neurology. 314 (4), 789-798 (1991).</li>
<li>Nasser, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+enteric+glia+in+intestinal+physiology%3A+effects+of+the+gliotoxin+fluorocitrate+on+motor+and+secretory+function%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Role of enteric glia in intestinal physiology: effects of the gliotoxin fluorocitrate on motor and secretory function.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 291, G912-927 (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cells+in+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterology+%26+Motility%22%5BJournal%5D)">Glial cells in the gut.</a> Neurogastroenterology & Motility. 17 (6), 777-790 (2005).</li>
<li>Broadhead, M. J., Bayguinov, P. O., Okamoto, T., Heredia, D. J., Smith, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+transients+in+myenteric+glial+cells+during+the+colonic+migrating+motor+complex+in+the+isolated+murine+large+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ca2+ transients in myenteric glial cells during the colonic migrating motor complex in the isolated murine large intestine.</a> J. Physiol. 590, 335-350 (2012).</li>
<li>Gulbransen, B. D., Bains, J. S., Sharkey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+glia+are+targets+of+the+sympathetic+innervation+of+the+myenteric+plexus+in+the+guinea+pig+distal+colon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Enteric glia are targets of the sympathetic innervation of the myenteric plexus in the guinea pig distal colon.</a> J. Neurosci. 30, 6801-6809 (2010).</li>
<li>McClain, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+Responses+in+Enteric+Glia+Are+Mediated+by+Connexin-43+Hemichannels+and+Modulate+Colonic+Transit+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Ca2+ Responses in Enteric Glia Are Mediated by Connexin-43 Hemichannels and Modulate Colonic Transit in Mice.</a> Gastroenterology. 146 (2), 497-507 (2014).</li>
<li>Chandrasekharan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonic+motor+dysfunction+in+human+diabetes+is+associated+with+enteric+neuronal+loss+and+increased+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterology+%26+Motility%22%5BJournal%5D)">Colonic motor dysfunction in human diabetes is associated with enteric neuronal loss and increased oxidative stress.</a> Neurogastroenterology & Motility. 23 (2), e131-e126 (2011).</li>
<li>Abdo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+glial+cells+protect+neurons+from+oxidative+stress+in+part+via+reduced+glutathione%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Enteric glial cells protect neurons from oxidative stress in part via reduced glutathione.</a> FASEB J. 24, 1082-1092 (2010).</li>
<li>Aube, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+enteric+neurone+phenotype+and+intestinal+functions+in+a+transgenic+mouse+model+of+enteric+glia+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Changes in enteric neurone phenotype and intestinal functions in a transgenic mouse model of enteric glia disruption.</a> Gut. 55, 630-637 (2006).</li>
<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nature Reviews Molecular cell biology. 1 (1), 11-21 (2000).</li>
<li>Gulbransen, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+neuronal+P2X7+receptor-pannexin-1+mediates+death+of+enteric+neurons+during+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Activation of neuronal P2X7 receptor-pannexin-1 mediates death of enteric neurons during colitis.</a> Nat Med. 18, 600-604 (2012).</li>
<li>Bayguinov, P. O., Hennig, G. W., Smith, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+activity+in+different+classes+of+myenteric+neurons+underlying+the+migrating+motor+complex+in+the+murine+colon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium activity in different classes of myenteric neurons underlying the migrating motor complex in the murine colon.</a> J Physiol. 588, 399-421 (2010).</li>
<li>Okamoto, T., Bayguinov, P. O., Broadhead, M. J., Smith, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%282%2B%29+transients+in+submucous+neurons+during+the+colonic+migrating+motor+complex+in+the+isolated+murine+large+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol+Motil%22%5BJournal%5D)">Ca(2+) transients in submucous neurons during the colonic migrating motor complex in the isolated murine large intestine.</a> Neurogastroenterol Motil. 24 (8), 769-778 (2012).</li>
<li>Kunze, W. A., Clerc, N., Furness, J. B., Gola, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+soma+and+neurites+of+primary+afferent+neurons+in+the+guinea-pig+intestine+respond+differentially+to+deformation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The soma and neurites of primary afferent neurons in the guinea-pig intestine respond differentially to deformation.</a> J Physiol. 526, 375-385 (2000).</li>
<li>Schemann, M., Michel, K., Peters, S., Bischoff, S. C., Neunlist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+the+gastrointestinal+tract%3A+mapping+the+human+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Imaging and the gastrointestinal tract: mapping the human enteric nervous system.</a> Am J Physiol. 282, G919-G925 (2002).</li>
<li>Hennig, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+spread+of+pacemaker+activity+in+through+ICC+in+guinea-pig+antrum%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastro+Motil%22%5BJournal%5D)">Visualization of spread of pacemaker activity in through ICC in guinea-pig antrum.</a> Neurogastro Motil. 14, 575(2001).</li>
<li>Stevens, R. J., Publicover, N. G., Smith, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+organization+of+Ca2%2B+waves+by+enteric+neural+reflexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction and organization of Ca2+ waves by enteric neural reflexes.</a> Nature. 399, 62-66 (1999).</li>
<li>Stevens, R. J., Publicover, N. G., Smith, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+and+neural+regulation+of+calcium+waves+in+longitudinal+and+circular+muscle+layers+of+guinea-pig+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Propagation and neural regulation of calcium waves in longitudinal and circular muscle layers of guinea-pig small intestine.</a> Gastroenterology. 118, 982-984 (2000).</li>
<li>Jessen, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-like+glia+in+the+peripheral+nervous+system%3A+an+immunohistochemical+study+of+enteric+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-like glia in the peripheral nervous system: an immunohistochemical study of enteric glia.</a> Journal of Neuroscience. 3 (11), 2206-2218 (1983).</li>
<li>Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+functional+roles+for+enteric+glia+in+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9, 625-632 (2012).</li>
<li>Gomes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP-dependent+paracrine+communication+between+enteric+neurons+and+glia+in+a+primary+cell+culture+derived+from+embryonic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterology+%26+Motility%22%5BJournal%5D)">ATP-dependent paracrine communication between enteric neurons and glia in a primary cell culture derived from embryonic mice.</a> Neurogastroenterology & Motility. 21 (8), e870-e862 (2009).</li>
<li>Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+neuron-to-glia+signaling+in+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Purinergic neuron-to-glia signaling in the enteric nervous system.</a> Gastroenterology. 136, 1349-1358 (2009).</li>
<li>Ren, J., Bertrand, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+receptors+and+synaptic+transmission+in+enteric+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Purinergic+Signal%22%5BJournal%5D)">Purinergic receptors and synaptic transmission in enteric neurons.</a> Purinergic Signal. 4, 255-266 (2008).</li>
<li>Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+intracellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Measurement of intracellular calcium.</a> Physiol Rev. 79, 1089-1125 (1999).</li>
<li>Dongcheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+regionalisation+for+enteric+nervous+system+formation%3A+implications+for+Hirschsprung%27s+disease+and+stem+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Neural crest regionalisation for enteric nervous system formation: implications for Hirschsprung's disease and stem cell therapy.</a> Developmental Biology. 339 (2), 280-294 (2010).</li>
<li>Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behind+an+enteric+neuron+there+may+lie+a+glial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Behind an enteric neuron there may lie a glial cell.</a> J Clin Invest. 121, 3386-3389 (2011).</li>
<li>Boesmans, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuron-glia+interactions+in+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Imaging neuron-glia interactions in the enteric nervous system.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, (2013).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

המתודולוגיות המתוארות בכתב יד זה מספקות גישה עקבית למחקר יעיל של נוירונים וגליה אנטרית ב-ENS. למרות שהדמיית נוירונים וגליה אנטרית בתרבית הניבה שפע של תובנות לגבי תפקודם של תאים בודדים, חקר תאים אלה בסביבתם הטבעית והרב-תאית הוא חיוני להבנת הפיזיולוגיה והפתופיזיולוגיה שלהם. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית היא טכניקה חיונית להערכת אינטראקציות רב-כיווניות של תאים ב-ENS. העמסת תאים של ה-ENS עם סמנים פלואורסצנטיים סלקטיביים ורכישת תמונה במיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה מאפשרת תצפיות כמותיות על הפעילות התאית ב-ENS. הדמיית דגימות רקמה חיות של ה-ENS מתבצעת במהירות יחסית ומייצרת כמויות גדולות של נתונים פונקציונליים ומרחביים מעמיקים. תכשירי מקלעת מיאנטרית ותת-רירית של עכברים המשמשים בניסויים אלה מאפשרים גישות מניפולציה מולקולרית וגנטית. הדמיית Ca2+ בתכשירים להרכבה שלמה מספקת כלי שימושי להערכת אינטראקציות נוירונים-גליה.
בפרדיגמות ניסוי מתקדמות, ניתן לשלב מספר בדיקות כדי לקבל מידע על אירועים שונים בתוך התאים. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית יכולה להקליט תמונות עם ניגודיות משופרת של מולקולות ספציפיות, אם משתמשים בתווית פלואורסצנטית מתאימה. Fluo-4 נבחר מכיוון שיש לו טווח דינמי גדול. זמן דגירה מספיק הוא חיוני בעת שימוש בצבעי AM ב-ENS. ייתכן שיהיה צורך להתאים את ריכוז הצבע ושיטת הטעינה כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר. יש להעמיס תכשירים אידיאליים בצבע מספיק כדי לדמיין שינויים בקרינה, אך לא עד כדי כך שהצבע יגרום ליוני המטרה ויפריע לאיתות התוך תאי. יש להגביל את החשיפה לאור פלואורסצנטי כדי למנוע פוטוטוקסיות בתאים והלבנת פוטו של צבעים. 
על החוקרים להיות זהירים במספר שלבים של ניסוי זה, במיוחד הכנת תמיסה ורקמות. יש לנקוט בזהירות מיוחדת במהלך עיבוד ודיסקציה של רקמת ENS על מנת לשמור על תפקודי התאים. מערכת העיכול מכילה מספר שכבות וסוגי רקמות, המהווים אתגרים לאיכות החיתוך וההדמיה בתכשירים אלה 27. יתר על כן, דרכי הסיבים המחברים של ה-MP רחבים יותר והגנגליונים גדולים יותר מאלה של ה-SMP 2. הצפיפות העצבית של מקלעת המיאנטרית גבוהה יותר בהשוואה לזו של מקלעת התת-רירית 28. לנתיחות איטיות ולא מדויקות יהיו השפעות מזיקות על איכות תכשירי המקלעת ובכך על ההצלחה הכוללת של הניסויים. לכן, כלים נקיים/לא פגומים, תרגול ומיומנות ידנית הם קריטיים להליך זה. 
בתכשירי רקמות שלמות, יש לשקול היטב בעת ציור אזורי העניין (ROI) כדי להעריך נכון את הקינטיקה ואת מידת השינוי הנצפה בעוצמת הקרינה של סוג התא הרצוי. מכיוון שהגנגליונים ממוקמים על שכבת שריר מתכווצת, חפצי תנועה הנגרמים על ידי תנועתיות המעיים הם הדאגה העיקרית במהלך הדמיה באתר . לפיכך, דיכוי הפרעות התנועה הללו באמצעות הצמדה מחדש של תכשירי רקמה לאחר הדגירה עם אנזימים והוספת עיכוב פרמקולוגי (ניקרדיפין/סקופולמין) למאגרים מאפשר רכישת תמונה ברורה ואמינה. מלבד פרמקולוגיה וגישות מכניות למניעת תנועת רקמות, מחקרים אחרונים ממחישים את היישום של מתודולוגיות תוכנה מתקדמות ומאפייני תגובה של סוג התא כדי לתקן תנועת רקמה שיורית בהקלטות ולשפר את דיוק הניתוח 29. למעט המכשולים הטכניים הללו, שיטה זו מספקת תנאים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית להערכת מאפיינים מורפולוגיים וכמותיים של נוירונים וגליה אנטרית ב-ENS.

מערכת העצבים enteric (ENS) מאורגנת בשני plexuses ganglionated המוטבע בקיר של מערכת עיכול 1. מעגלים עצביים לשריר אלה, מקלעת myenteric (MP) ומקלעת submucosal (SMP), מורכבים מתאי עצב וגליה enteric (איור 1) 2. MP וSMP להסדיר עיכול פונקציות (GI) כגון תנועתיות מעיים וספיגת אפיתל והפרשה, בהתאמה 3. גליה מעיים נמצאות בסמיכות לתאי עצב בתוך הגרעינים אבל אוכלוסיות של גליה enteric גם קיימות בתוך מקשר קטעי סיבים וחלקים נוספים-ganglionic של קיר בטן 3,4. גליה מעיים האמינו במקור כדי לספק תמיכה תזונתית רק לתאי עצב. עם זאת, מחקרים שנערכו לאחרונה מצביעים על כך שנוירון, גליה אינטראקציות חיוניות לENS מתפקד 5,6. לדוגמא, הנתונים מראים כי גליה enteric &quot;להקשיב&quot; לפעילות עצבית 7ולווסת את המעגלים עצביים 6,8, להגן על תאי עצב enteric מלחץ חמצוני 9 והם מסוגלים לייצר תאי עצב חדשים enteric בתגובה לפציעה 10,11. הפרוטוקול המובא בסקירה טכנית זו מספק שיטה פשוטה וחזקה כדי לבחון את יחסי הגומלין המורכבים בין תאי עצב וגליה enteric באמצעות הדמיה Ca 2 + תאית אתרו. Ca 2 + הוא מולקולת איתות בכל מקום בתאים להתרגש וממלא תפקיד חיוני באירועי איתות הסינפטי במערכת העצבים 12. עירור של תאי עצב או גליה enteric מעורר העלאה בריכוז Ca 2 + cytoplasmic או על ידי זרם דרך Ca 2 + ערוצי -permeable או Ca 2 + שחרור מחנויות סידן תוך תאי. ההדמיה Ca 2 + ארעיים בתאי עצב וגליה עם צבעי ניאון הוא הוקם וטכניקה בשימוש נרחבת כדי ללמוד את הארגון ואת הדינמיקה של תפקודיים13-17 ENS. ההדמיה Ca 2 + הוכח להיות כלי חשוב בלימוד קטעי רקמה במערכת העיכול ללא פגע על מנת להבהיר את ההתפשטות של רגישות באמצעות רשתות ICC קוצב לב 18 ושריר חלק במעי 19,20. זה מאפשר לחוקרים לחקור מגוון רחב של פרמטרים פיסיולוגיים ומספק מידע על שתי הפריסה המרחבית שלהם ודינמיקה זמנית. תאים יכולים להיות מוכתמים ביעילות באופן פולשנית ידי שימוש באינדיקטורים ניאון קרום חדיר ופרוטוקולים מכתים מותאמים 21. זה מציע הזדמנות לעקוב אחר מספר גדול של תאי עצב וגליה enteric בהכנות השתמרו תפקודי 14-16,22, כמו גם in vivo 23. הכנות רקמת הר-שלמות הן בתפזורת עמוסה Ca 2 + צבע מחוון גבוהה זיקה כגון Fluo-4, המגבירה הקרינה שלה כאשר חייב Ca 2 +. שינויים בקרינה נרשמים על ידי מצלמת CCD וanaדיגיטלי 6 lyzed. כניסתו של Ca 2 + סיפקה את ההזדמנות כדי לפקח על אינטראקציות תא עצב ותאי גליה, היענות לגירויים שונים, ומעורבותם של סוגי התאים בתהליכי עיכול בזמן אמת. באתר ההדמיה Ca 2 + הניבה תובנה גדולה לתוך מנגנוני האיתות של תאי עצב וגליה enteric ובעל כמה יתרונות ברורים על פני דגמי תרבית תאים 6,24. ראשית, באתר הכנות לשמור על סביבת מטריצת יליד נוירונים וגליה ולהשאיר את חלק הארי של הקשרים שלהם כדי למקד את הרקמה שלמה. שנית, הגנטיקה והמורפולוגיה של גליה enteric בתרבית באופן משמעותי בהשוואה לשינו in vivo 6,24. שלישית, אינטראקציות רבות heterotypic הולכים לאיבוד בתרבית תאים ראשוני וזה מגביל הערכת אינטראקציות תא-תא. למרות שתאים בתרבית מתאימים גם לחקירה של תכונות בסיסיות, usefulness לחקר אינטראקציות מורכבות בין גליה ונוירונים enteric מוגבל. גומלין נוירון, גליה חוקר באמצעות באתר גישה הוא יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית כמסלולים הסינפטי נותרו על כנן 25. בהשוואה לגישות תרבית תאים, בגישה באתר מציע תנאים משופרים לשיטתיים הבנת האינטראקציות המורכבות בין תאי עצב וגליה enteric. יתר על כן, הארגון מישוריים של מקלעת ganglionated בהכנות כל הר הוא אידיאלי עבור הדמיה ניאון של Ca 2 + ארעיים תאיים וטכניקה זו מספקת גישה פשוטה להערכת פעילות נוירון, גליה בENS.

<table><tbody><tr><td>מחמם מזרק BubbleStop&nbsp;</td><td>AutoMate Scientific</td><td>10-4-35-G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז, סוג II, אבקה</td><td>Gibco</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42613-33-2</td><td></td></tr><tr><td>כלי דיסקציה</td><td>Roboz&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ שלב קבוע</td><td>אולימפוס&nbsp;</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM צבע</td><td>Invitrogen</td><td>F-14201</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>סיגמא</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>סיכות חרקים</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>סיכות Minutien Pins</td><td></td></tr><tr><td>iQ תוכנת הדמיית תאים חיים</td><td>Andor</td><td>Andor iQ3</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>מצלמת Neo sCMOS</td><td>Andor</td><td>Neo 5.5 sCMOS</td><td></td></tr><tr><td>Nicardipine</td><td>Sigma</td><td>N7510</td><td></td></tr><tr><td>תא</td> <td>זלוףמשאבה</td> פריסטלטית מותאמת אישית <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>מכשיר הרווארד</td><td>דגם 720</td><td></td></tr><tr><td>פלורוניק F-127&nbsp;</td>בדיקות מולקולריות <td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Probenecid</td><td></td><td>P36400</td><td></td></tr><tr><td>Scopolamine</td><td>Sigma</td><td>S1013&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>סאטר למבדה DG-4</td><td>סאטר</td><td>DG-4</td><td></td></tr><tr><td>סילגארד&nbsp;</td>בקר טמפרטורה <td>Dow Corning</td><td>184</td><td></td></tr><tr><td>וורנר</td><td>אינסטרומנטס</td><td>TC-344C</td><td></td></tr></tbody></table>

בהדמיה 2 + ca situ של מערכת העצבים המעיים

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

התנהגויות רפלקס של המעי נשלטות על ידי מערכת העצבים המעי (ENS). ה-ENS היא רשת אינטגרטיבית של נוירונים וגליה בשני מקלעות גנגליון השוכנות בדופן המעי. נוירונים אנטרי וגליה אנטרית הם סוגי התאים היחידים בתוך גרעיני המעי. פעילותם של נוירונים מעיים וגליה אחראית על תיאום תפקודי המעיים. פרוטוקול זה מתאר שיטות להתבוננות בפעילות של נוירונים וגליה בתוך ה-ENS השלם על ידי הדמיית מעברי סידן תוך תאיים (Ca2+) עם צבעי אינדיקטור פלואורסצנטיים. הדיון הטכני שלנו מתמקד בשיטות להדמיית Ca2+ בתכשירים שלמים של מקלעת המיאנטרית ממעי המכרסם. טעינה בתפזורת של תושבות שלמות ENS עם מחוון Ca2+ בעל זיקה גבוהה כגון Fluo-4 מאפשרת מדידות של תגובות Ca2+ בנוירונים בודדים או בתאי גליה. ניתן לעורר תגובות אלה שוב ושוב ובאופן אמין, מה שמאפשר מחקרים כמותיים באמצעות כלים פרמקולוגיים. תגובות Ca2+ בתאים של ה-ENS נרשמות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במצלמת התקן מצמד מטען מקורר (CCD). מדידות פלואורסצנטיות המתקבלות באמצעות הדמיית Ca2+ בתכשירים שלמים מציעות אמצעי פשוט לאפיון המנגנונים וההשלכות התפקודיות הפוטנציאליות של תגובות Ca2+ בנוירונים מעיים ותאי גליה.

שימוש נכון בטכניקה זו מאפשרת לחוקרים למדוד במדויק Ca 2 + i תאית ארעיים [Ca 2 +] בנוירונים enteric וגליה בכל הר הכנות רקמות. דוגמא מייצגת של 2 + תגובות Ca העורר אגוניסט בגליה בתוך הגנגליון myenteric מהמעי גס העכבר מוצגת בוידאו 1. התוצאות הבאות נועדו כדי להמחיש כמה תוצאות נציג השגנו בשיטה זו. ראשית, איור 2 מדגים את התוצאות של ניסוי מדידת גליה enteric [Ca 2 +] i שינויים בתגובה לגירוי על ידי ATP בהכנות שפן ניסיונות הגס מקלעת שריר myenteric אורכית (LMMP). באופן ספציפי, נתון זה מראה את השיטה לניתוח נכון של פרוטוקול הניסוי המפורט לעיל כולל את קווי המתאר של גנגליון myenteric ניתח וכוכביות מציין את המיקום של נוירונים enteric. תוצאות אלו גם illustrate המינון האופטימלי של ה- ATP מאה מייקרו על הגיוס של חזיר ים אני בגליה myenteric [Ca 2 +]. תגובה זו יכולה לשמש כדי לכייל את גירוי גליה enteric ולנרמל את התגובות לגירויים לבדוק. בשלב הבא, איור 3 מבהיר כיצד לבחור כראוי אזורים של העניין (ROIs) המקיף את תאי גליה, מוצג עם סובבי עיגולים צהובים. תוצאות אלו מראות גם הרצויות שינויי הקרינה בתנאים בסיסיים ובתגובה לגירויים תרופתיים. לבסוף, איור 4 מדגים את השיקולים מרחביים לבחירת גליה ונוירונים enteric לi תגובות [2 + Ca] בהכנות כל הר. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig1highres.jpg" /> איור 1. ארגון של ENS. ENS מכיל שני plexuses ganglionated גדול. מקלעת myenteric ממוקמת בין lשכבות שרירים ongitudinal ומעגליות. מקלעת submucosal ממוקמת בין הרירית ושכבת השריר המעגלית. ENS מורכב אך ורק של תאי עצב וגליה enteric. שטחי סיבי עצב להתחבר הגרעינים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig2highres.jpg" /> איור 2. גליה מעיים במגיבים מקלעת myenteric המעי הגס שפן הניסיונות לATP באתר. Fluo-4 הקרינה בגנגליון myenteric (א) (שתואר על ידי קו מקווקו) בתנאים בסיסיים. חיצים מצביעים על קטעי סיבי interganglionic עבים. (ב) על הגירוי עם ATP / L 100 μmol, תאי גלייה, אבל לא תאי עצב, להגדיל במהירות Fluo-4 הקרינה המצביעה על עלייה ב[ Ca 2 +] <sUB&gt; i. שים לב שתאים מגיבים הם קטנים ומקיפים את הנוירונים גדולים בהרבה (חללים אפלים שסומנו על ידי כוכביות). גליה מעיים (C) להגיב לATP באופן תלוי-מינון עם mmol 1 / L לעורר תגובות מקסימליים 24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig3highres.jpg" /> איור 3. Murine S-100-GFP תאים + במגיב מקלעת myenteric המעי הגס לATP באתר. () S-100-GFP + תאי גליה (ירוקה) בגנגליון myenteric מעי הגס עכבר (שתואר על ידי קו מקווקו). שישה אזורים של עניין (ROIs) המקיף את תאי גליה בתוך הגרעינים מוצגים כעיגולים צהובים. חצים מצביעים על קטעי סיבים עבים המובילים לגנגליון. ד כוכביותמיקום enote של 2 נוירונים enteric. אותו גנגליון מראה Rhod-2 הקרינה בתנאים בסיסיים (B). (ג) בעקבות גירוי עם ATP / L 100 μmol, תאי גלייה להגיב בגדלו [Ca 2 +] i, כפי שמוצגת על ידי Rhod- המוגבר 2 הקרינה. (ד) עקבות המתאימות לכל אחד את ההחזר על ההשקעה שמוצגת ב- C. (E) בממוצע תגובה (ממוצע ± SEM) של ROIs 6 הראתה ב -24 D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig4highres.jpg" /> איור 4. בהדמיה באתרו של תקשורת נוירון לגליה enteric. (א) נציג תמונות (pseudocolored) מניסוי הדמיה Ca 2 + שבו כל הרהכנת מקלעת myenteric אותגרה עם אגוניסט העצבי קולט P2X7 BzATP (100 מיקרומטר, 30 שניות). שים לב שאגוניסט העצבי גורם לעלייה בקרינת Fluo4 בנוירון (א &#39;) לפני התאים המקיפים את מעי גליה (&quot;). (ב) ניתוח השינוי בקרינה לאורך זמן בגליה (הכחול) ותאי עצב (אדום ) לאחר יישום של אגוניסט העצבי, BzATP. (C) העצבית ותגובות גליה לBzATP במאגר רגיל (קווים מוצקים) ובמאגר המכיל Ca 2 + הנמוך וMg 2 + (קווים מקווקווים) להגברת קולטנים עצביים P2X7 13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> וידאו 1. תגובת Ca 2 + עורר אגוניסט בגליה enteric באתרם. סרט זה מראה גנגליון myenteric מהמעי גס דיסטלי העכבר עמוס צבע המחוון 2 + Ca, Fluo-4. אגוניסט תא גליה, ADP, מתווסף לאמבטיה כאשר הצביעו. ADP מעורר עלייה בCa 2 + תאיים בגליה enteric כפי שנצפה על ידי ההעלאה החולפת בFluo-4 הקרינה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/JOVE.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.</a>

מערכת העצבים המעי (ENS) היא רשת של נוירונים וגליה הממוקמת בדופן המעי ושולטת ברפלקסים של המעי. פרוטוקול זה מתאר שיטות לרישום הפעילות של נוירונים מעיים וגליה בתכשירים חיים של ENS באמצעות הדמיית Ca2+.

בהדמיה 2 + Ca Situ של מערכת העצבים המעיים

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לדמות את הפעילות של נוירונים וגליה אנטריים בדגימות של מעי שלם (whole mount) בחיים, באמצעות צבעי אינדיקטור פלואורסצנטיים לסידן. דבר זה מושג תחילה על ידי כריתת חלק מהמעי מהחיה והנחתו במצע מחומם מראש. השלב השני הוא פתיחת המעי לאורך הגבול המזנטרי וקיבועו בצורה שטוחה תחת מתיחה קלה, כאשר פני השטח של הרירית פונים כלפי מעלה.הכנות של דגימות שלמות (Whole mount) של המקלעת המיאנטרית מופקות באמצעות מיקרו-דיסקציה ומונחות בצלחות דימוי. לאחר מכן, הדגימות השלמות נטענות בצבע אינדיקטור פלואורסצנטי flu oh four בתוך אינקובטור. בשלבים הסופיים, הדגימות הנטענות מדומיינות באמצעות מיקרוסקופ דימוי פלואורסצנטי המצויד במצלמה ברזולוציה גבוהה, הנשלטת על ידי תוכנה לרכישה וניתוח תמונות, כדי להקליט את הפעילות הבסיסית.לאחר מכן מוסיפים את התרופות הנבדקות ומתעדים את תנודות הסידן (calcium transients) בנוירונים ובתאי גליה. בסופו של דבר, דימוי סידן in situ של מערכת העצבים האנטרית משמש לחקר האופן שבו פעילות תאית בנוירונים ובתאי גליה תורמת לוויסות תפקודים פיזיולוגיים של המעי ולשיבושים של מערכת העצבים האנטרית בפתופיזיולוגיה של המעי.השלכותיה של טכניקה זו פשוטה וחזקה לבחינת האינטראקציה המורכבת בין נוירונים לתאי גליה אנטריים באמצעות דימוי סידן ב-NC two, פותחות פתח לביסוס הבנה של הפיזיולוגיה והפתופיזיולוגיה של הפרעות תפקודיות במעי ומחלות מעי דלקתיות; הליך זה יוצג למדענים מהמעבדה שלי. הפרוצדורות הבאות, הכוללות רקמות מבעלי חיים במעבדה, תואמות את הנחיות A VMA להדרה של בעלי חיים משנת 2013, ואושרו מראש על ידי ה-I-A-C-U-C של אוניברסיטת מישיגן סטייט. לאחר הדרה של בעל החיים בהתאם לפרוצדורות המאושרות, הנח את בעל החיים בתנוחה גבנית ונקה את העור מעל הבטן באמצעות 70% ethanol. השתמש בפינצטה כדי לתפוס את עור הבטן בקו האמצע, ולאחר מכן השתמש במספריים כירורגיים כדי לבצע חתך מדיאלי של שישה סנטימטרים לאורך הקו המרכזי כדי לחשוף את איברי העיכול הפנימיים.בשלב הבא, השתמשו בפינצטה קהה כדי לאתר ולחשוף את המעי הגס בתוך הצפק. גזרו את גרסום המעיים (mesentery) של המעי העקום והמעי הגס בעזרת מספריים והתחילו לפרוס את המעי. ברגע שאורך המעי נפרס באופן מספק, גזרו את המעי הגס מדיסטלית למעי העיוור (cecum) ומפרוקסימלית לרקטום לצורך הכנת מעי גס, כפי שיוצג בסרטון זה.לאחר מכן, הוצא במהירות את מקטע המעי והנח אותו בכלי כימי המכיל מצע DM EMF 12 מועשר ב-three micromolar nicardipine hydrochloride וב-one micromolar S scopolamine hydrochloride על קרח. הוספת מעכבים אלו מקלה על המיקרו-דיסקציה והדימוג העוקב על ידי שיתוק השריר החלק של המעי. הסר מקטע קטן של ארבעה עד שישה סנטימטרים ממקטע המעי הרצוי והנח אותו בצלחת פטרי מצופה ב-syl guard ומלאה במצע מועשר ומקורר.לאחר מכן, קבע את הקצוות הפרוקסימליים והדיסטליים של מקטע המעי באמצעות סיכות חרקים, ופתח את צינור המעי על ידי ביצוע חתך אורכי ישר לאורך גבול המזנטריום. כעת, קבע את הרקמה בצורה שטוחה תחת מתיחה קלה כאשר צד הרירית פונה כלפי מעלה, והסר בזהירות את שכבת הרירית על ידי הרמת הרירית באמצעות פינצטה עדינה מספר 5 וחתירה תחתיה עם מספרי קפיץ עדינים מאוד. חתוך את הרקמה לדגימות קטנות יותר של כ-0.5 סנטימטר רבוע, והנח כל פיסה לכלי דימות מלא במצע מועשר והנח על קרח.הקבעו כל דגימה בארבעה פינות כאשר שכבת השריר המעגלית פונה כלפי מעלה. הסִירו בזהירות את השריר המעגלי על ידי הפרדתו בעזרת פינצטה עדינה. כדי לחשוף את המקלעת המיאנטרית (myenteric plexus), הימנעו ממתיחה מרובה, החזירו את צלחות ההדמיה לקרח והחליפו את התמיסה בכל צלחת במדיום מועשר טרי.בשלב הבא, הוצא את הצלחות מהקרח, הוסף שתי מיליליטר של תערובת אנזימים לכל צלחת והדגר בטמפרטורת החדר עם 5%carbon dioxide ו-95%air למשך 15 דקות. לבסוף, שטוף את דגימות הרקמה עם מדיום שלוש פעמים והשלם את הפינות בעודך עובד בתנאי תאורה מוגבלים כדי למנוע פוטובליצ'ינג (photobleaching), עם 1.5 מיליליטר של מדיום מועשר ו-1.2 מיקרוליטר של מלאי probit בריכוז 250 מילימולר, ל-1.5 מיקרוליטר Eloqua של מלאי Fluro four בריכוז ארבעה מילימולר, ובסביב 1.5 מיליליטר של תמיסת טעינה flu oh four לצלחות הדימוג, והדגר באינקובטור חשוך ב-37 degrees Celsius למשך 45 דקות. לאחר הוצאת הצלחות מהאינקובטור, שטוף את הדגימות שלוש פעמים עם מדיום.לאחר מכן, הוסיפו מצע טרי המכיל 200 micromolar prop acid כדי להגביר את הסימון העצבי והדגירו כפי שנעשה קודם לכן למשך 15 דקות. במהלך הדגירה, הכינו באפר Krebs מעובד בהתאם להוראות בחלק הכתוב של הפרוטוקול, והוסיפו three micromolar nicardipine ו-one micromolar scopolamine כדי לעכב התכווצויות שרירים. במהלך דימוי calcium two plus וניתוחי whole mount, מקמו את תא ההקלטה תחת המיקרוסקופ הפלואורסצנטי והשתמשו במערכת פרפוזיה של זרימה בכבידה עם מספר מאגרי מזרקים מחוממים.הגדירו קצב פרפוזיה רציף של 2-3 מיליליטר לדקה של בופר Krebs בטמפרטורה של 37 °C. ודאו כי נמנעת היווצרות בועות אוויר הן בקו הכניסה והן בקו השאיבה המחובר למלכודת ואקום. התאימו את המיקוד למשבצת העצבים (plexus) הרצויה תחת תאורת שדה בהיר (bright field).הימנעו מחשיפת יתר של הרקמה, שעלולה להוביל לפוטובליצ'ינג (הבהרה פוטוכימית). בחנו את טעינת ה-flu oh four בתוך הגנגליונים ובחרו גנגליונים בריאים לצורך הדמיה. גנגליונים פגומים או לא בריאים יראו פלואורסצנציה עצמית או מורפולוגיה נקודתית, ואין להשתמש בהם להדמיה.לאחר בחירת גנגליון, הפנו את נתיב האור למצלמה והשיגו תמונה חיה. באמצעות תוכנת רכישת תמונות, ודאו שהגנגליון נמצא במיקוד והגדירו את קצב רכישת התמונות וזמני החשיפה. קצבי וזמני רכישת התמונות ישתנו בהתאם לאירועים שהחוקרים מעוניינים להקליט. עבור רוב הניסויים, תמונות נרכשות באופן מסורתי בקצב של 0.5 עד 1 hertz עבור תאי גליה, ועד 2 עד 10 hertz.עבור נוירונים, מכיוון שטרנסיאנטים של סידן בתאי גליה אינם מהירים כמו טרנסיאנטים של סידן בנוירונים, התחל את ההקלטה וקבע את הפעילות הפיזיולוגית הבסיסית של הגנגליון הנבחר בהיעדר גירויים ניסיוניים למשך 30 שניות. לאחר מכן, הגש תכשירים מחוממים מראש כגון אגוניסטים ואנטגוניסטים של רצפטורים באמצעות מערכת פרפוזיה בzרימה כבידה בקצב של שני עד שלושה milliliters per minute, בהתאם לפרוטוקול מותאם עבור התכשיר שלך. הפסק את ההקלטה וצפה בסרט ה-time lapse של הניסוי.בחרו בקפידה את אזורי העניין (ROIs) באמצעות תוכנה מתאימה לניתוח תמונות. לבסוף, השתמשו בתוכנת דימוי מתאימה כדי לנרמל ולהשוות את עוצמת הפלואורסצנציה של אזורי העניין ביחס לערך הבסיס הראשוני שלהם. שינויים בפלואורסצנציה המנורמלת הם פרופורציונליים ישירות לשינויים בריכוז הסידן. שלוש התמונות הבאות מדגימות כי גליאאא אנטרית בחזיר גינאה מגיבה ל-TP in situ.בתנאי בסיס, נראית פלואורסצנציית fluoro four ברמה נמוכה כפי שסומן בקו המקווקו. החיצים מצביעים על תלי תסיביים בינ-גנגליוניים עבים בעת גירוי עם 100 µM ATP; תאי גליה, אך לא נוירונים, מגבירים במהירות את פלואורסצנציית ה-fluoro four, מה שמעיד על עלייה בסידן. שימו לב שהתאים המגיבים הם קטנים ומקיפים את הנוירונים הגדולים בהרבה, המסומנים על ידי החללים הכהים עם הכוכבית.היסטוגרמה זו מראה כי גליות אנטריות מגיבות ל-TP באופן תלוי מינון, כאשר 1 mM מעורר תגובות מקסימליות. סרטון זה מציג גנגליון מיאנטרי מהמעי הגס הדיסטלי של עכבר, שנטען בצבע אינדיקטור לסידום (calcium two plus) מסוג flu oh four. האגוניסט לתאי הגליה, a DP, מתווסף לאמבט כאשר מצוין.DP גורם לעלייה בריכוז calcium two plus התוך-תאי בגליה אנטרית, כפי שנצפה בעלייה חולפת בفلואורסצנציה של flu oh four. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבחון במדויק את האינטראקציה המורכבת בין נוירונים לתאי גליה באמצעות דימות סידן. אפיון המנגנונים וההשלכות התפקודיות הפוטנציאליות של תגובות סידן בדגימות whole mount דורש דיסקציות מדויקות כדי להשיג איכות דימוי אידיאלית.השימוש בסימון פלואורסצנטי ובגירויים פרמקולוגיים במסגרת טכניקה זו המבוססת על מיקרוסקופיה, מאפשר הערכה משופרת של תאים אלו בסביבתם הרב-תאית הטבעית.

in-situ-ca2-imaging-of-the-enteric-nervous-system

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

פרוטוקול זה מדגים כיצד מתח רגיש צבעים לאפשר הקלטה אופטית של הפעילות החשמלית של רשתות עצביות שלמים כגון plexuses של מערכת חזירי הים העצבים enteric, עם רזולוציה מתכווננת אשר נע בין חד תאים למעגל רב ganglionic.

הקלטה אופטית של הפעילות החשמלית גינאה חזיר רשתות enteric באמצעות מתח רגיש צבעים

סרטון זה מדגים שיטה לבידוד תאי גליה אנטריים מהתת-רירית והלמינה פרופריה של מעי העכבר. הוא מתאר את השלבים הכרוכים בחילוץ רקמה תת-רירית ולמינה פרופריה, בידוד תאי הגליה האנטרית מהם, וטיפוח התאים על צלחת באר מצופה כדי להקים תרבית תאי גליה אנטריים.

בידוד תאי גליה אנטריים מהתת-רירית והלמינה פרופריה של עכבר

סרטון זה מדגים את ההכתמה החיסונית של מערכת העיכול העוברית של מורין כדי לדמיין ולנתח את התפלגות האוכלוסייה העצבית באמצעות immunofluorescence ומיקרוסקופ קונפוקלי.

צביעה אימונופלואורסצנטית של אוכלוסיות נוירונים במערכת העיכול העוברית

מקור: Fried, D. E., Gulbransen, B. D. באתרו ca2+{{}} הדמיה של מערכת העצבים המעי. J. Vis. exp.,  (2015){סרטון זה מדגים סידן הדמיה כדי להמחיש ולנתח את הפעילות של נוירונים מעיים וגליה בתכשירי מקלעת מיאנטרית של המעי הגס בעכבר.

הדמיית סידן של פעילות נוירונים מעיים וגליה במקלעת מיאנטרית של עכבר

מקור: Doser, R., et al. הדמיה תת-תאית של טיפול בסידן עצבי in vivo. J. Vis. Exp. (2023)סרטון זה מדגים הדמיה in vivo של שטף סידן תת-תאי בנוירונים של חוט העצב הגחוני של זני Caenorhabditis elegans טרנסגניים. נעשה שימוש בשני מדדי סידן נפרדים: אינדיקטור ציטופלזמי בזן אחד ואינדיקטור מיטוכונדריאלי באחר. נוירונים נצפים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לנטר שינויים בזמן אמת בעוצמת הקרינה בתוך הציטופלזמה העצבית והמיטוכונדריה, המשקפים שטף סידן במהלך פעילות עצבית ספונטנית.

הדמיית דינמיקת סידן תת-תאית בתאי עצב של Caenorhabditis elegans

אנו מדגימים פרוטוקול תרבית תאים למחקר הישיר של רכיבים עצביים וגליה של מערכת העצבים enteric. נוירון / תרבות מעורבת גליה על coverslips מוכן ממקלעת myenteric של עכבר בוגר מתן היכולת לבחון נוירון בודד ופונקציה על ידי גליה electrophysiology,...

<em&gt; חוץ גופייה</em&gt; הכנה של נוירונים enteric המבודדים וגליה ממקלעת Myenteric של העכבר הבוגר

מערכת העצבים המעי נוצרת על ידי תאי פסגה עצבית שמתרבים, נודדים ומתיישבים במעיים. תאי פסגה עצבית מתמיינים לנוירונים עם סמנים ספציפיים לפנוטיפ המוליך העצבי שלהם. פרוטוקול זה מתאר טכניקה לניתוח, קיבוע וצביעה חיסונית של מערכת העיכול העוברית של העכברים כדי להמחיש ביטוי נוירוטרנסמיטר של מערכת העצבים המעי.

Immunostaining לדמיין פיתוח מערכת עצבים Murine מעיים

מאמר זה מתאר טכניקת הדמיית וידאו ומיפוי מרחבי-זמני ברזולוציה גבוהה לזיהוי שינויים בוויסות העצבי של תנועתיות המעי הגס בעכברים בוגרים. ניתן לזהות השפעות עדינות על תפקוד מערכת העיכול באמצעות גישה זו בתכשירי רקמות מבודדים כדי לקדם את ההבנה שלנו לגבי מחלות מערכת העיכול.

הדמיה וידאו ומפות Spatiotemporal לנתח תנועתיות מערכת העיכול של עכברים

עצבים אפרנטיים מזנטרי מעבירים מידע ממערכת העיכול לכיוון המוח לגבי הומאוסטזיס תקין כמו גם פתופיזיולוגיה. ניתן להעריך את פעילות העצב האפרנטי במערכת העיכול על ידי הרכבת מקטעי מעיים מבודדים עם עצבים אפרנטיים מחוברים לאמבט איברים, בידוד העצב והערכת פעילות בסיסית כמו גם מגורה.

במבחנת ההקלטה של פעילות עצבית Mesenteric מביא עכבר Jejunal ופלחים גסים

מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה (SRS) מאפשרת הדמיה ללא תוויות של ביומולקולות המבוססות על הרטט הפנימי שלהם של קשרים כימיים ספציפיים. בפרוטוקול זה, ההתקנה האינסטרומנטלית של מיקרוסקופ פלואורסצנטי משולב של SRS ושני פוטונים מתוארת כדי לדמיין מבנים תאיים בחוט השדרה של עכברים חיים.

In vivo הדמיה של רקמות ביולוגיות עם פלואורסצנטיות דו-פוטונית משולבת ומיקרוסקופיה פיזור ראמאן מגורה

פרוטוקול זה מתאר את החשיפה הכירורגית של גנגליון השורש הגבי (DRG) ואחריו GCaMP3 (אינדיקטור Ca2+ מקודד גנטית; חלבון פלואורסצנטי ירוק-קלמודולין-M13 חלבון 3) Ca2+ הדמיה של הרכבים עצביים באמצעות עכברי Pirt-GCaMP3 תוך הפעלת מגוון גירויים על הכף האחורית ipsilateral.

ב Vivo הדמיית סידן של הרכבים עצביים ברשתות של נוירונים חושיים ראשוניים בגרעיני שורש גבי שלמים

למד דימוי סידן חי של נוירונים ותאי גליה במערכת העצבים המעיים באמצעות צבעי סימון פלואורסצנטיים. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לחקור פעילות תאית בזמן אמת ולהבין את פיזיולוגיית המעי ופתופיזיולוגייתו.

בהדמיה ^{2 +} Ca Situ של מערכת העצבים המעיים

גלה סרטונים נוספים