בהדמיה 2 + Ca Situ של מערכת העצבים המעיים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמות את הפעילות של נוירונים מעיים וגליה בתכשירים חיים של מעי באמצעות צבעי אינדיקטור סידן פלואורסצנטיים. זה מושג על ידי כריתת חלק מהמעי מהחיה והנחתו במצע חם מראש. השלב השני הוא לפתוח את המעי לאורך הגבול המזנטרי ולהצמיד אותו שטוח במתח קל כשמשטח הרירי פונה כלפי מעלה.

תכשירים שלמים של מקלעת המיאנטרית מוכנים על ידי מיקרודיסקציה ומונחים בכלי הדמיה. לאחר מכן, כל תכשירי ההרכבה נטענים באינקובטור פלואורסצנטי צבע שפעת הו ארבע בחממה. בשלבים האחרונים, התכשירים הטעונים מצולמים באמצעות מיקרוסקופ הדמיה פלואורסצנטי המצויד במצלמה ברזולוציה גבוהה הנשלטת על ידי תוכנת איסוף וניתוח תמונות כדי לתעד את הפעילות הבסיסית.

לאחר מכן מתווספות התרופות הנחקרות ומתועדות מעברי סידן בתאי עצב ובגליה. בסופו של דבר באתר. הדמיית סידן של מערכת העצבים המעי משמשת לחקר האופן שבו פעילות תאית בתאי עצב וגליה תורמת לוויסות תפקודי המעיים הפיזיולוגיים ולתפקוד לקוי של מערכת העצבים המעי בפתופיזיולוגיה של המעיים.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות לקראת ביסוס הבנה של הפיזיולוגיה והפתופיזיולוגיה של הפרעות מעי תפקודיות ומחלות מעי דלקתיות באמצעות שימוש בשיטה פשוטה וחזקה לבחינת יחסי הגומלין המורכבים בין נוירונים וגליה מעיים באמצעות הדמיית NC 2 סידן המדגימה הליך זה יהיה בחינם למדענים מהמעבדה שלי. ההליכים הבאים הכוללים רקמות מחיות מעבדה עולים בקנה אחד עם הנחיות A VMA להמתת חסד של בעלי חיים 2013, ואושרו מראש על ידי אוניברסיטת מישיגן I-A-C-U-C לאחר המתת החיה על פי נהלים מאושרים, הניחו את החיה במצב שכיבה ונקו את העור מעל הבטן עם אתנול 70%. השתמש במלקחיים כדי לצבוט את עור הבטן בקו האמצע ולאחר מכן השתמש במספריים כירורגיים כדי לבצע חתך מדיאלי של שישה סנטימטרים לאורך המרפק הליניארי כדי לחשוף את איברי העיכול הפנימיים.

לאחר מכן, השתמש במלקחיים קהים כדי לאתר ולחשוף את המעי הגס בתוך הצפק. חותכים את המזנטריה של המעי הגס האיליאלי במספריים ומתחילים לפרק את המעי. לאחר שאורך המעי נפרש כראוי, חתכו את המעי הגס הדיסטלי לצקום ופרוקסימלי לפי הטבעת להכנת המעי הגס, שיוצג בסרטון זה.

לאחר מכן יש להסיר במהירות את מקטע המעי ולהניח אותו בכוס המכילה DM EMF 12 Media בתוספת שלושה מיקרו-מולרי ניקרדיפין הידרוכלוריד ומיקרו-מולרי אחד S scopolamine hydrochloride על קרח. הוספת מעכבים אלה מקלה על מיקרו-דיסקציה והדמיה לאחר מכן על ידי שיתוק השריר החלק של המעיים. הסר קטע קטן של ארבעה עד שישה סנטימטרים מקטע המעי הרצוי והניח בצלחת פטרי מצופה מגן סיל מלאה בחומר משלים צונן.

לאחר מכן אבטח את הקצוות הפרוקסימליים והדיסטליים של קטע המעי בעזרת סיכות חרקים ופתח את צינור המעי על ידי ביצוע חתך ישר לאורכו לאורך הגבול המזנטרי. כעת הצמידו את הרקמה למצב שטוח במתח קל כשצד הרירית כלפי מעלה ונתחו בזהירות את שכבת הרירית על ידי הרמת הרירית עם מלקחיים עדינים מספר חמש וחיתוך מתחתיה עם מספריים קפיציים עדינים מאוד. חותכים את הרקמה לתכשירים קטנים יותר של כ-0.5 סנטימטרים רבועים ומניחים כל חתיכה בצלחת הדמיה מלאה במדיה משלימה ומניחים על קרח.

הצמד כל תכשיר בארבע פינות כששכבת שרירים עגולה פונה כלפי מעלה. נתח בזהירות את השריר העגול על ידי התגרות בו בפינצטה עדינה. כדי לחשוף את המקלעת המיאנטרית, הימנע ממתיחה מוגזמת, הנח את כלי ההדמיה בחזרה על קרח והחלף את התמיסה בכל צלחת בחומר משלים טרי.

לאחר מכן, הוציאו את הכלים מהקרח והוסיפו שני מיליליטר תערובת אנזימים לכל מנה ודגרו בטמפרטורת החדר עם 5% פחמן דו חמצני ו -95% אוויר למשך 15 דקות. לבסוף, שטפו את תכשירי הטישו במדיה שלוש פעמים ורסנו את הפינות תוך כדי עבודה בתנאים של אור מוגבל כדי למנוע פוטוהלבנה ב-1.5 מיליליטר של חומר משלים ו-1.2 מיקרוליטר של מלאי פרוביט של 250 מילי-מולרי ל-1.5 מיקרוליטר Eloqua של ארבעה מילי-מולרי Fluro ארבעה מלאי בכ-1.5 מיליליטר שפעת או ארבע תמיסת העמסה לצלחות ההדמיה ודגירה באינקובטור חשוך ב-37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. לאחר הוצאת הכלים מהחממה יש לשטוף את התכשירים שלוש פעמים במדיה.

לאחר מכן הוסיפו מדיה טרייה המכילה 200 חומצה מיקרו-מולרית כדי לשפר את התיוג העצבי העצבי ולדגור כמו קודם למשך 15 דקות. במהלך הדגירה, הכינו בופר קרבס מותאם בהתאם להוראות בחלק הכתוב של הפרוטוקול, והוסיפו שלושה ניקרדיפין מיקרו-מולרי וסקופולמין מיקרו-מולרי אחד כדי לעכב את התכווצויות השרירים. במהלך סידן שתי פלוס הדמיה ודיסקציות הרכבה שלמות ממקמות את תא ההקלטה מתחת למיקרוסקופ הפלואורסצנטי ומשתמשות במערכת זלוף זרימת כבידה עם מספר מאגרי מזרק מחוממים.

קבע קצב זלוף רציף של שניים עד שלושה מיליליטר לדקה של 37 מעלות צלזיוס קרבס. הקפד למנוע היווצרות בועות אוויר הן בכניסה והן בקו היניקה המחובר למלכודת ואקום. הבא את המקלעת הרצויה למיקוד תחת תאורת שדה בהירה.

הימנע מחשיפת יתר של הרקמה שעלולה להוביל להלבנת אור. בדוק את העמסת השפעת או ארבע בתוך הגרעינים ובחר גנגליונים בריאים להדמיה. גנגליונים פגומים לא בריאים יציגו אוטופלואורסצנטיות או מורפולוגיה מנוקבת ואין להשתמש בהם להדמיה.

לאחר בחירת גנגליון, הסיטו את נתיב האור למצלמה וקבלו תמונה חיה. עם תוכנת רכישת תמונות, ודא שהגנגליון נמצא בפוקוס והגדר את קצב רכישת התמונה וזמני החשיפה שיעורי רכישת התמונות והזמנים ישתנו בהתאם לאירועים שהחוקרים רוצים לתעד. עבור רוב הניסויים, תמונות נרכשות באופן מסורתי ב-0.5 עד 1 הרץ עבור תאי גליה ועד 2 עד 10 הרץ.

עבור נוירונים, מכיוון שחולף סידן גליאלי אינו מהיר כמו נוירונים חולפים של סידן, התחל את הרישום וקבע את הפעילות הפיזיולוגית הבסיסית של הגנגליון הנבחר בהיעדר גירויים ניסיוניים למשך 30 שניות. לאחר מכן יש למרוח תרופות מעניינות כגון אגוניסטים ואנטגוניסטים של קולטנים באמצעות מערכת הזלוף של זרימת הכבידה בקצב של שניים עד שלושה מיליליטר לדקה על פי פרוטוקול אופטימלי לתרופה שלך. עצור את ההקלטה וצפה בסרטון דולג הזמן של הניסוי.

בחר בקפידה את אזורי העניין או את ההחזר על ההשקעה באמצעות תוכנת ניתוח התמונה המתאימה. לבסוף, השתמש בתוכנת הדמיה מתאימה כדי לנרמל ולהשוות את עוצמת הפלואורסצנט של אזורי עניין מול שינויי הערך הבסיסיים שלה בקרינה מנורמלת עומדים ביחס ישר לשינויים בסידן. שלוש התמונות הבאות מדגימות כי גליה אנטרית בשרקן מגיבה ל-TP באתרו.

בתנאים בסיסיים, ניתן לראות פלואורו ארבע פלואורסצנטי ברמה נמוכה כפי שמתואר על ידי הקו המקווקו. החצים מצביעים על דרכי סיבים בין-גנגליוניים עבים בעת גירוי עם 100 מיקרו מו לליטר תאי גליה TP, אך לא נוירונים מגבירים במהירות את הפלואורו ארבע פלואורסצנטי המעיד על עלייה בסידן. שימו לב שהתאים המגיבים קטנים ומקיפים את תאי העצב הגדולים בהרבה שמסומנים על ידי החללים הכהים המסומנים בכוכבית.

היסטוגרמה זו מראה כי גליה אנטרית מגיבה ל-TP באופן תלוי מינון עם מילי-מול אחד לליטר המעורר תגובות מקסימליות. סרטון זה מציג גנגליון מיאנטרי מהמעי הגס הדיסטלי של העכבר טעון בסידן שניים פלוס צבע אינדיקטור שפעת הו ארבע. אגוניסט תאי הגליה DP מתווסף לאמבטיה כאשר מצוין.

DP מעורר עלייה בסידן תוך-תאי שתיים פלוס בגליה אנטרית כפי שנצפה על ידי העלייה החולפת בפלואורסצנציה של שפעת או ארבע. אחרי הצפייה בסרטון הזה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לבחון במדויק את יחסי הגומלין המורכבים בין תאי עצב ושימוש אמפירי בהדמיית סידן. אפיון המנגנונים וההשלכות התפקודיות הפוטנציאליות של תגובות סידן בתכשירים של הרכבה שלמה דורש חיתוכים מדויקים לאיכות הדמיה אידיאלית.

השימוש בתיוג פלואורסצנטי וגירויים פרמקולוגיים בטכניקה מבוססת מיקרוסקופיה זו מאפשר הערכה משופרת של תאים אלה בסביבתם הרב-תאית הטבעית.