מדידה של הזחל פעילות ב דרוזופילה צג פעילות
April 30th, 2015
דוח זה מתאר שיטה למדידת פעילות הזחלים של דרוזופילה באמצעות מוניטור פעילות הדרוזופילה TriKinetics. המכשיר משתמש בקרני אינפרא אדום כדי לזהות תנועות של עד 16 בעלי חיים בודדים. ניתן לנתח נתונים כדי לייצג פרמטרי תנועה כולל קצבים ומיקומי בעלי החיים בתוך תאי הבדיקה.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לנתח את פעילות הזחלים ללא שימוש בתוכנת ניתוח וידאו מסובכת. זה מושג על ידי העברת זחלים נבחרים למסנן רשת כדי לנקות פסולת. לאחר מכן, זחלים בודדים מועברים לצינורות בדיקה שם הם מאובטחים על ידי פקקי מקדחה, המוכנסים למוניטור פעילות דרוזופילה או למכשיר סכר.
לאחר שלוש עד חמש דקות של התאקלמות נלקחות הקלטות ממערכת ה-DAM לניתוח. בסופו של דבר, הסכר שנמדד בתנועות הזחלים יכול לשמש לניתוח פרמטרי פעילות שונים עבור גנוטיפ נתון. יתרון אחד שיש לטכניקה זו על פני השיטות הקיימות הוא שהיא אוטומטית ואובייקטיבית.
למרות שהן פשוטות מספיק למדידות פעילות שגרתיות, למעבדות רבות כבר יש את הציוד הדרוש שניתן להתאים בקלות לשימוש על זחלים. מי שידגים את ההליך יהיה איידן מקפרלין, סטודנט לתואר ראשון מהמעבדה שלי. פרוטוקול זה משתמש במכשיר ניטור פעילות דרוזופילה מרובה אלומות M חמש או סכר.
להקים את הסכר. ראשית, חבר את הצג ליחידת ממשק אספקת החשמל או ל-PSIU באמצעות כבל טלפון CAB שישה. לאחר מכן חבר את ה-PSIU לשקע חשמל.
אור ירוק יצביע על חיבור מתאים. שלישית, חבר את ה-PSIU דרך כבל USB למחשב להקלטת נתונים. כעת התקן ופתח את מערכת ה-DAM MB אחת V שש X תוכנית במחשב.
כאשר התוכנה נפתחת, היא מתחילה להקליט נתונים באופן אוטומטי בבקרת התוכנה. עבור הסכר הגדר את מרווח ההקלטה הרצוי. בחר העדפות ולאחר מכן לחץ מעל או מתחת לאפשרות מרווח הקריאה כדי לבחור מסגרות זמן שונות בהן יאוחסנו נתונים.
ישנם מגוון פרמטרים אחרים שניתן להגדיר תחת העדפות ותחת סוג נתוני פלט. כל פרמטר מספק ניתוח ייחודי של פעילות הזחל בתוך הצינור. מוצע לבחור את כל הפרמטרים לפני איסוף הנתונים.
אם אינך בטוח איזה פרמטר ברצונך למדוד לבדיקה זו, הכן בקבוקון עם זחלי חיפוש מזון עבור כל גנוטיפ המיועד לבדיקה. השתמש בסביבה סטנדרטית והטיס מזון להכנת צינורות הבדיקה. שופכים תמיסת מקדחה של 4% לעומק של 1.5 סנטימטרים לצלחת פטרי.
זה הופך לחומר התקע של צינור הבדיקה, צפוף מכדי להתחפר לתוכו. לאחר מכן, ודא שהצינורות נקיים וללא הפרעה על ידי שטיפתם במים חמים. לאחר מכן, מחממים בקבוק סחיטה עם 100 מיליליטר מים במיקרוגל למשך 10 עד 15 שניות או עד להופעת עיבוי.
לאחר מכן הפוך את הבקבוק וסחט בעדינות את האוויר הלח החם לתוך צינור הבדיקה. כאשר מופיעה שכבה דקה של עיבוי על דופן הצינור, היא לחה מספיק. לאחר מכן, הסר את דיסק הג'ל מהכלי והניח אותו על משטח רשת, שהוא לא יידבק אליו בחוזקה.
כדי לאסוף את הזחלים, הכינו מסנן רשת על ידי מתיחת רשת ניילון בדרגת משי על משפך. אבטח את הרשת בצוואר המשפך בעזרת גומיה, ומקם את המשפך בכוס. כעת קחו מרית מלאה במזון המכיל זחלי מזון מבקבוק התרבית והעבירו אותם למסנן הרשת.
שוטפים את המזון מהזחלים באמצעות טמפרטורת החדר, מי ברז, ניתן לאסוף זחלים בודדים מהרשת באמצעות מברשת. העבירו את הזחלים כ-1.5 סנטימטרים לצינור בדיקה לח. ואז אטום את הצינור על ידי חיבורו עם מקדחה.
זה נעשה על ידי לחיצה על קצה אחד של הצינור לתוך הג'ל פעמיים ועל הקצה השני. ברגע שהלחץ מאלץ את אחד משני התקעים החוצה בקצה הנגדי, כאשר הצינורות נטענים, הנח אותם בסכר. לאחר מכן, התאם את המיקום של כל צינור כך שהחיה לא תוכל לנוע מעבר לטווח החיישנים.
לאחר מכן אבטח את הצינורות למכשיר באמצעות טבעת מרק. רשום את פעילות ה-LARVAS באינקובטור של 20 מעלות צלזיוס כדי למנוע קריאות לא מדויקות שעלולות להתרחש עקב צללים, אורות פלורסנט או שינויי טמפרטורה במעבדה. בחממה.
השתמש בתאורת LED שאינה פלואורסצנטית במהלך ההקלטה. לפני איסוף הנתונים, אפשר לזחלים להתאקלם במשך חמש דקות. זה יכול להיות שימושי לבצע ניסוי ללא בעלי חיים כדי להבטיח שתנאי האור לא יפעילו את חיישני ה-DAM.
לאחר חמש דקות, הפעל את תוכנת ה-DAM המוגדרת מראש כדי להתחיל את ההקלטה. הבדיקה יכולה להימשך 30 דקות ללא עיבוי או מזון נוסף. חיוני שלפני ההקלטה נבחר פרמטר הפעילות המיועד לניתוח תחת העדפות.
אם לא נבחר, פעילות זו לא תהיה זמינה לניתוח פוסט הוק. לאחר השלמת זמן ההקלטה הרצוי סגור את תוכנת ה-DAM, הנתונים נשמרים אוטומטית תחת תיקיית נתוני מערכת הסכר. העבר את קובץ הנתונים לתיקיה נפרדת כדי שניתן יהיה לעבד אותו מאוחר יותר.
ניתן לנקות את צינורות הבדיקה במים רותחים לשימוש חוזר. כדי לעבד את הנתונים הגולמיים לפורמט מובן, פתח את יישום סריקת קבצי DAM ובחר. בחר את תיקיית נתוני הקלט, ולאחר מכן בחר את תיקיית הנתונים ואת הקובץ הרצוי ובחר באפשרות הסריקה.
לבסוף, בחר את אורך הסל לתקופת הקריאה הרצויה. זה מארגן את הנתונים הגולמיים לפרמטרים שנקבעו על ידי המפעיל. כעת בחר את סוג נתוני הפלט כדי לנתח את הגדרת התנועה הרצויה.
אם אורך הסל גדול ממרווח הקריאה של המערכת שנבחר, עבור לתפריט הקריאות הנוספות ובחר באפשרות סכום שניים לסלים. לאחר מכן, שמור את הקובץ בשם מתאים באותה תיקייה שאליה הועברו הנתונים הגולמיים. באמצעות תוכנית גיליון אלקטרוני רגילה, פתח את הקובץ השמור.
בהתאם לסוג הנתונים המנותח, יש לקרוא את הגיליון האלקטרוני בצורה שונה. בדרך כלל, כדי למדוד מהלכים או ספירות, פרק הזמן של המחקר יירשם מספרית בעוד שכל צינור קריאה בודד יקבל אות ייעודית. בדרך כלל עמודות K עד Z מייצגות את החריצים עבור צינורות בדיקה, והשורות מייצגות את נקודות הנתונים שנאספו.
אם, למשל, נאספו מהלכים במשך 20 דקות, בדקה אחת, המרווחים ממוצעים את 20 השורות כדי לחשב מספר ממוצע של מהלכים לדקה ומדידות אחרות. מחקר תגובת טמפרטורה של זחלי כוכב שלישי מזן W 1 1 1 8 נעשה באמצעות מכשיר הניטור כדי לזהות הבדלים בזחלים ובתנועה. בשבע טמפרטורות שונות, כל זחל נותח במשך 20 דקות.
ברור שהזחלים נעשו פעילים יותר באופן משמעותי ככל שהסביבה התחממה. לשם השוואה, נבדקה מוטציה היפואקטיבית של הזן W 1 1 18 שנקראת לא פעילה. הניתוח הצביע על כך שזחלים לא פעילים היו פחות ניידים באופן משמעותי מביקורת כדי לבחון את גבולות הזיהוי של הבדיקה.
השוואה של זחלים בשלבים שונים נעשתה בעוד שהם קטנים בהרבה מהשלישי בזחלי כוכבים. הפעילות של הראשון והשני בזחלי כוכבים אכן הייתה ניתנת לזיהוי ומדידה בהסתכלות על שינויים בפעילות עם הזמן במכשיר. נמצא כי הפעילות של זחלי הכוכבים השלישי בכל דקה של הבדיקה של 20 הדקות נותרה עקבית יחסית.
לאחר שליטה, פרוטוקול זה מספק שיטה מדויקת, פשוטה וחסכונית להערכת פרמטרים בסיסיים של פעילות הזחלים במגוון תנאי ניסוי.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
הדוח מתאר שיטה למדידת פעילות זחלי Drosophila באמצעות מנטר הפעילות של Drosophila של TriKinetics. המכשיר משתמש בקורות אינפרא אדום כדי לזהות תנועות של עד 16 בעלי חיים בודדים, ומאפשר ניתוח פרמטרים של תנועה כולל שיעורים ומיקום בתוך תאי בדיקה.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ניתוח התנהגות
- גנטיקה
רקע
- ניתוח פעילות זחלים הוא קריטי להבנת ההשפעות הגנטיות על ההתנהגות.
- שיטות מסורתיות לרוב דורשות תוכנת ניתוח וידאו מורכבת.
- מנטר הפעילות של Drosophila של TriKinetics מציע חלופה פשוטה יותר.
- שיטה זו מאפשרת איסוף נתונים אובייקטיבי ואוטומטי.
מטרת המחקר
- למדוד את פעילות זחלי Drosophila ביעילות.
- לספק שיטה שמבטלת את הצורך בניתוח וידאו מורכב.
- לנתח פרמטרי פעילות שונים עבור גנוטיפים שונים.
שיטות בשימוש
- העברת זחלים נבחרים למסננת רשת כדי לנקות פסולת.
- אבטחת זחלים בודדים בצינורות בדיקה באמצעות פקקי מגרפה.
- הכנסת צינורות למנטר הפעילות של Drosophila (DAM).
- הקלטת תנועות זחלים לאחר תקופת התאקלמות של 3-5 דקות.
תוצאות עיקריות
- הקלטות אוטומטיות של תנועות זחלים הושגו בהצלחה.
- ניתוח הנתונים חשף פרמטרים שונים של פעילות.
- השיטה הוכחה כאובייקטיבית ויעילה.
- ניתן להשתמש בתוצאות להשוואת פעילות בין גנוטיפים שונים.
מסקנות
- מנטר הפעילות של DAM של TriKinetics מספק שיטה אמינה למדידת פעילות זחלים.
- הטכניקה משפרת את היכולת לחקור השפעות גנטיות על ההתנהגות.
- מחקר עתידי יכול לנצל את השיטה זו ליישום רחב יותר במדעי המוח.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This protocol enables automated, objective measurement of Drosophila larval locomotion using an adapted TriKinetics activity monitor, providing a scalable, cost-effective alternative to video-based behavioral assays. By delivering quantitative movement data across genotypes and environmental conditions, it supports early-stage target validation and mechanistic de-risking in neurobehavioral discovery pipelines. The method enhances predictive confidence in larval phenotype screening by standardizing activity readouts for high-throughput genetic or pharmacological studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying larval activity changes across genotypes, supporting functional target validation.
- Operational Value: Provides automated, reproducible locomotion metrics that reduce variability and increase confidence in early phenotypic screening.
- Predictive Value: Facilitates biological de-risking through standardized, high-resolution activity readouts that correlate with neural circuit function.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated larval activity measurements for downstream compound screening by establishing baseline locomotion parameters.
- Scalability: Supports parallel monitoring of up to 16 individual larvae per run, enabling medium-throughput screening workflows.
- Data Compatibility: Outputs are compatible with standard spreadsheet and graphing software, streamlining data integration into existing analytics pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Larval activity serves as a disease-relevant system for modeling neurodevelopmental and neurodegenerative conditions.
- Translational Continuity: Enables seamless transition from discovery to preclinical validation by maintaining consistent behavioral readouts across model systems.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by quantifying hyper- or hypoactivity phenotypes with statistical rigor.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows as a phenotypic screening tool for target validation, bridging genetic manipulation to quantifiable behavioral output before lead identification stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring larval locomotion as a functional readout of gene or drug effects on neural activity.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible activity data with minimal operator bias, enhancing screening reliability.
- Analytics: Generates quantitative outputs such as move counts and positional data, enabling statistical comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Maintains continuity by using larval behavior as a translatable biomarker for neural function in preclinical models.
- Enterprise Reuse: Leverages existing DAM infrastructure, positioning the method as a reusable platform across multiple projects and teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through objective behavioral quantification.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility across labs by eliminating subjective video analysis.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by repurposing existing equipment and reducing reliance on specialized imaging resources.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of genetic targets based on robust, quantifiable phenotypic profiles.
Implementation Considerations
- Requires basic expertise in Drosophila handling and behavioral assay setup.
- Depends on access to a TriKinetics DAM system and compatible data analysis software.
- Necessitates cross-team standardization of assay conditions, including temperature, humidity, and lighting.
- Involves adaptation considerations for different larval stages and genetic backgrounds.
- Limited to measuring gross locomotion and position preference; not suitable for complex sub-behavioral analysis without modification.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:11
Setting Up the DAM Software
2:34
Preparations
3:42
Setting Up the Assay
4:56
Measuring Locomotion
6:18
Preparing and Processing the Data
7:57
Temperature Regulation of Locomotion, Locomotion of Mutant Larvae, Locomotion at Three Instar Stages and Consistency of Locomotion
9:04
Conclusion
