In vivo לשעבר vivo גישות לחקר סרטן השחלות גרורתי התיישבות של מבני ספוט החלב בהצפק שומני

אנו מתארים פרוטוקול המיישם גישות in vivo ו-ex vivo לחקר קולוניזציה של סרטן השחלות ברקמות השומן הצפקיות, במיוחד האומנטום. יתר על כן, אנו מציגים פרוטוקול לכימות וניתוח מבני תאים חיסוניים באומנטום המכונים כתמים חלביים, המקדמים גרורות של שומן צפק.

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים את השימוש בטכניקות סטנדרטיות לכימות קולוניזציה של סרטן השחלות במאגרי שומן צפקי. זה מושג באמצעות הזרקה תוך-צפקית של תאי סרטן השחלות לעכברים לאחר הקרבת העכברים בנקודות זמן ספציפיות. מחסני שומן צפקי מזוהים ומבודדים מהעכברים.

לבסוף, מספר תאי סרטן השחלות הקיימים במחסני שומן ספציפיים מכומת באמצעות ציטומטריית זרימה. בנוסף למחקרים מבוססי מנגנונים, ניתן לחקור קולוניזציה של תאי סרטן השחלות גם בתרבית משותפת ex vivo, ולאחר מכן ניתוחים כמותיים ו/או מולקולריים מתאימים. בסופו של דבר, גישות in vivo ו-ex vivo אלה מאפשרות חקירה של תהליכים המעורבים בקולוניזציה של תאי סרטן השחלות של שומן צפקי באמצעות שיטות איכותיות או כמותיות.

היתרון העיקרי של גישה זו הוא שאנו מסוגלים ליישם טכניקות סטנדרטיות להערכת שלבים ספציפיים בקולוניזציה גרורתית של סרטן ביצית של שומן צפק. ההשלכות של הטכניקה מרחיבות את מניעת הגרורות. באופן ספציפי, הוא מאפשר לזהות אינטראקציות מיקרו-סביבתיות של תאים סרטניים המווסתות את צמיחת תאי סרטן השחלות בתוך מבנים המכילים תאים חיסוניים המכונים כתמים חלביים.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו ימצאו שזה מועיל להיות בעלי ניסיון בטיפול בעכברים. למרות שהזרקות תוך צפקיות הן לכאורה פשוטות, היעדר טכניקה טובה יכול להוביל לנתונים לא מדויקים. יתר על כן, דיסוציאציה של רקמות לתרחיף תא בודד דורשת תרגול ותכנון קפדני לפני תחילת הניסוי.

טכניקה מסוימת זו אינה מחייבת את בעלי החיים להיות תחת הרדמה. על פי פרוטוקולים מאושרים, בצע טכניקה זו על בעלי חיים חיים. טען 500 מיקרוליטר של מתלה התא היחיד המתויג פלואורסצנטי לתוך המזרק.

לאחר מכן הכניסו את המזרק למחט סטרילית עם מכסה 25 כדי להפחית את גזירת התאים לפני ההזרקה. ריסון העכבר ביד השנייה, הרם את העכבר בצוואר והחזק את הזנב באמצעות כף היד והאצבע. לאחר מכן תקן את הרגל האחורית השמאלית בין הטבעת לאצבע הקטנה כדי למנוע טראומה של איברי הבטן.

רסנו היטב את העכבר כך שלא יוכל לזוז במהלך ההזרקה. דמיינו קו לרוחב הבטן ואתרו נקודה בצד ימין של החיה וקרוב לקו האמצע. נקודת הכניסה היא גולגולת שתיים ומעט מדיאלית של הפטמה האחרונה.

התכוננו להחדיר את המחט בצד ימין של העכבר כדי להימנע מהצקום ולהפחית את הסיכון לניקוב המעיים. הכנס את המחט באזור הצדדי התחתון של בטן העכבר לעומק של כ-0.5 סנטימטרים. משוך לאחור את הבוכנה כדי לוודא שהמחט לא חדרה לכלי דם או לאיברי צפק.

אם לא נשאב נוזל, הזריק את הדגימה בלחץ איטי ויציב. לאחר מכן משוך את המחט והחזיר את העכבר לכלוב שלו. אין לכסות את המזרק לפני השלכתו למיכל החדים.

הקריבו את העכברים בנקודות זמן ספציפיות לאחר ההזרקה להסרת איברים חיוניים. כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט שכן קצירת מחסני שומן צפקי מהווה הסרת איברים פנימיים. בצע חתך בקו האמצע קרוב לפאפ המפשעתי דרך דופן הצפק כדי לחשוף את האיברים הפנימיים לכריתת השומן האומנטלי.

חשוף את קומפלקס הלבלב האומנטלי על ידי הארכת הטחול מחלל הצפק בעזרת מלקחיים לשומן בלוטת המין. השתמש במלקחיים כדי להרים את שומן בלוטת המין המקיף את השחלות ולהוציא אותו על ידי חיתוך חיבורי רקמות. מיד. מניחים את הטישו ב-PBS קר כקרח.

לאחר מכן, הסר את השומן ברחם באמצעות מלקחיים כדי להרים את שומן הרחם המקיף את קרני הרחם ולכרות על ידי חיתוך חיבורי הרקמות לפני הנחת הרקמות מיד ב-PBS קר כקרח. בעת השגת השומן המזנטרי, חתכו את הצומת בין המעי הדק לפילורוס. השתמש במלקחיים כדי לאחוז בחוזקה בקצה החופשי של המעי הדק ולקלף אותו לאט מהשומן המזנטרי.

שחרר את השומן המזנטרי מהשורש המזנטרי בעזרת מספריים לניתוח. לאחר מכן הניחו מיד את הרקמות ב-PBS קר כקרח. לבסוף, כדי להסיר את שומן פורטל הפאולו, הרם את הקצה הדיסטלי של הטחול באמצעות מלקחיים כדי לחשוף את רצועת השומן הדקה של הרקמה, ולחבר את הילום הטחול ללבלב.

הסר את שומן פורטל הפליאו על ידי שחרורו תחילה מהלבלב ולאחר מכן ניתוחו בזהירות מהטחול. לאחר מכן הניחו מיד את הרקמות ב-PBS כדי להתחיל במשקל. התאם את כל רקמות השומן לאומנטום.

העבירו את הרקמות להפרדה של חמישה צינורות מיליליטר המכילים 1.5 מיליליטר של ECCOs ללא סרום, מדיום נשרים שונה או DMEM ו-0.1% אלבומין בסרום בקר. אסוף את הרקמות שנקטפו משלושה עכברים עצמאיים כדי להבטיח תשואה מספקת של תאים לזרימה ציטומטרית. לאחר מכן, טחנו את הרקמות באמצעות מספריים כירורגיים והוסיפו 1.5 מיליליטר של DMEM ללא סרום המכיל 0.4% קולגנאז.

דגרו את תרחיף הרקמות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם ערבוב סיבובי כשלב אופציונלי. לנתק עוד יותר את הרקמה על ידי לעיסה. במקרה זה, העבירו את תרחיף הקולגנאז לרקמות לקיבה או לשקית מיקרו ולעיסה למשך 10 דקות על נמוך, תוך סיבוב כיוון השקיות לאחר חמש דקות.

לאחר מכן, סנן את הדגימות דרך מסנן רשת ניילון כדי להסיר פסולת גדולה. אסוף את התאים באמצעות צנטריפוגה ב -250 פעמים G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס והשליך את שבר הסופרנטנט. השעו מחדש את גלולת התא ב-100 מיקרוליטר PBS בשילוב עם 900 מיקרוליטר אמוניום כלוריד, ליזיס אשלגן, חיץ ודגירה בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת.

לאחר מכן צנטריפוגה את התאים שוב כמו קודם והשליכו את הסופרנטנט לאחר החייאה, תוך תליית כדור התא ב-250 מיקרוליטר של PBS קר כקרח מסננים את הדגימות דרך רשת ניילון של 60 מיקרון כדי להבטיח השעיית תא בודד. לאחר מכן שטפו את המסנן עם 250 מיקרוליטר PBS קר כקרח, גדלו והכינו תאים והחייאה מתויגים פלואורסצנטיים. השעיה בריכוז של 2 מיליון תאים למיליליטר.

מרחו כשישה מיקרוליטרים של דבק הרקמות על קרום התרבות. הכנס והניח לו להתייבש באוויר. לאחר מכן שטפו את הממברנה פעמיים במים סטריליים כדי להסיר דבק מוגזם לפני ייבוש האוויר של הממברנות מתחת למכסה המנוע הלמינר, כרתו בזהירות את ה-OA והצמידו אותו לקרום המצופה דבק באמצעות מלקחיים סטריליים.

לאחר שאפשרתם לרקמה להיצמד לקרום למשך דקה אחת, הוסיפו 500 מיקרוליטר של תרחיף התאים על גבי כל אומנטום בכל תוספת תרבית. לאחר מכן מלאו את האזור סביב תא הטרנסוול ב-2.5 מיליליטר של מדיה DMEF 12. דגרו את הדלקת מפרקים ניוונית עם תרחיף תאים למשך שש שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בסביבה של 5% CO2.

הסר בזהירות ושטוף את ה-OA עם כ-10 מיליליטר PBS. לבסוף, דמיין מוקדי תאים סרטניים פלואורסצנטיים באמצעות מערכת הדמיה פלואורסצנטית מתאימה. ניתן לראות את המיקומים היחסיים של מצבורי השומן הצפק באמצעות דיסקציה אנטומית גסה.

מוצג כאן מבט מקרוב על פורטל Pleo ושומן אומנטלי. הגדלים היחסיים של מחסני השומן שנכרתו מוצגים כאן. כתמים חלביים נצפים בשומן אומנטלי ופורטל פליאו באמצעות היסטולוגיה סטנדרטית.

מוצגות תוצאות כמותיות מניתוח הזרימה של מחסני שומן צפקי שונים. קריטריוני השער לניתוחים מוצגים כאן. תאי הורים רעיוניים שימשו כבקרה שלילית.

תכשירי רקמת האומנטל הכילו אוכלוסייה משמעותית של תאים חיוביים לעגבניות TD ביחס לשומן המזנטרי של הרחם ושומן בלוטת המין. בזרימה הכמותית הנתונים מתבטאים כעלייה ממוצעת בשינוי הקיפול של אירועים חיוביים של עגבניות TD ביחס לעכברים שהוזרקו PBS in vivo וקולוניזציה ex vivo של OA על ידי SKV שלוש, תאי סרטן שחלות IP אחד GFP מוצגים כאן. הדמיה פלואורסצנטית של OA שלם הדגימה דפוסי קולוניזציה דומים של לוקליזציה של תאים סרטניים הן במבחני in vivo והן במבחני ex vivo.

בדיקה היסטולוגית של רקמות אלו אישרה את נוכחותם של תאים סרטניים הממוקמים בכתמים החלביים. לבסוף, זיהוי אימונוהיסטוכימי של ציטוקרטין המתבטא על ידי SKO V שלושה תאי IP אחד GFP מאשר את הממצאים ההיסטולוגיים הללו. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לזהות ולכרות בזהירות רקמת שומן צפקית ולמנוע זיהום על ידי סוגי רקמות אחרים, אשר לאחר מכן יטה את הנתונים הכמותיים המתקבלים מציטומטריית זרימה.

דבר שני, חשוב לזכור לבחור את הזנים המתאימים שלי למחקר המדובר. ניתן להשתמש בטכניקה כדי לזהות אינטראקציות של קווי תאי סרטן שחלות מבוססים היטב במיקרו-סביבת האומנטום החשובים להיווצרות גרורות. זה יכול לשמש גם כדי להעריך את הפוטנציאל הממאיר של קווי תאים המדגימים נגעים מוקדמים הנראים בחצוצרות.