אקס תרבות Vivo של בלוע קשתות לחקר תאי אב לב ושרירים והנישה שלהם

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור את התחזוקה, הנדידה והגורל של אבות הלב והשריר במזודרם הלוע. זה מושג על ידי ניתוח תחילה של קשתות הלוע מעובר עכבר שזה עתה נקטף. לאחר מכן, הקשתות מונחות בסרט מדיה כדי להקל על הצמדתן.

לאחר מכן מנוטרים התאים בתוך הלוע או הנודדים ממנו מדי יום. בסופו של דבר, ניתן להשתמש במעקב אחר שושלת פלואורסצנטית מבוססת קרי כדי לעקוב אחר התמיינות הנדידה והחידוש של אבות הלב והשריר בתוך קשתות הלוע. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שזו המערכת היחידה ex vivo לחקר אוכלוסייה מתחדשת של אבות לב או שרירים והמיקרו-סביבה שלהם במבחנה.

הדגמה של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשתות ההורים בעוברי עכברים בני 9.5 ימים הן בגודל של שניים עד 300 מיקרומטר בלבד, מה שמקשה מאוד על זיהויים וניתוחן ללא הדמיה מוקדמת. לפני תחילת ההליך. קודה 12, צלחת באר עם PBS בתוספת 10% FBS.

לאחר שעה, החלף את תמיסת הציפוי ב -200 מיקרוליטר של מדיום ללא סרום לבאר. סובב את הצלחת כדי לוודא שסרט בינוני מכסה את כל שטח תחתית הבאר. לאחר מכן, רססו ונקו את הבטן של עכברה בהריון שהורדמה עם 70% אתנול.

לאחר מכן, בעזרת כלים סטריליים, בצע חתך של 0.5 סנטימטר באזור הימי. תפוס את העור מעל ומתחת לחתך ומשוך בעדינות לכיוונים מנוגדים. לאחר מכן בצע חתך בצורת V בקרום מהטבור לשחלות בכל צד של הבטן כדי לחשוף את הרחם.

צבט את צינור הביצית המחבר את הרחם לשחלה בעזרת מלקחיים ואת צינור הביצית בצד השחלה במספריים כדי לשחרר את הרחם מהשחלה. מושך בעדינות את הרחם על ידי ה-uct. חותכים את הרחם מאזור שלפוחית השתן.

לאחר מכן משוך את הרחם עוד יותר למעלה על ידי ה-UCT וחתך את ה-UCT בצד השני, ומשחרר את הרחם מחלל הבטן. העבירו את הרחם לצינור של 50 מיליליטר המכיל 20 מיליליטר PBS קר וסטרילי עם סידן ומגנזיום. לנער בעדינות את הצינור למשך 10 שניות כדי לשטוף את הדם.

לאחר מכן השתמש במלקחיים כדי להעביר את הרחם לכלי של 10 מיליליטר ולהוסיף חמישה מיליליטר PBS קר לרקמה. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ סטריאו, השתמש בשני זוגות מלקחיים כדי לפתוח בעדינות את הרחם ולנתח את שקי מי השפיר המכילים את העוברים בזה אחר זה. לאחר מכן, עבור כל עובר בתורו, צבטו והוציאו בעדינות את שק מי השפיר בעזרת זוג מלקחיים אחד באמצעות הזוג השני כדי לחתוך ולשחרר את השק מהעובר.

הניחו את העובר על צדו והשתמשו במלקחיים כדי לחתוך את הקשת הראשונה והשנייה מאחור ללב בין הקשת לכיס הלוע. לאחר היפוך העובר וחיתוך הקשת בצד השני רק מודגם. חותכים את דרכי יציאת הלב המחברות את הקשתות לעובר ומסירים אותן.

צבט ושחרר כל אחת משתי קשתות הלוע ממערכת יציאת הלב הנותרת וארבעה אנדודרם מעיים. בתורו, ואז העבירו את הרקמות למרכז בארות בודדות של צלחת 12 הבאר המצופה תוך הקפדה על כך שהקשתות לא יכוסו במדיום. כדי להקל על ההתקשרות, דגרו את הקשתות בתנאי תרבית תאים.

לאחר שעתיים, הוסיפו 200 מיקרוליטר של 37 מעלות צלזיוס, מדיום נטול סרום בצידי הבארות, דאגו שהקשתות יישארו מחוברות וידגרו על הרקמות למשך הלילה. למחרת אישר ויזואלית שהקשתות עדיין מחוברות. לאחר מכן הוסף בעדינות עוד 200 מיקרוליטר של מדיום נטול סרום 37 מעלות צלזיוס לבארות.

אם הרקמות מתנתקות ומתחילות לצוף, הסר בעדינות את המדיום בעזרת פיפטה מבלי להסיר את הקשתות עד שנותר רק סרט מדיה. לאחר מכן השתמש בקצה הפיפטה כדי להזיז את הקשתות בחזרה לאמצע הבאר ולדגור שוב על הרקמות. כל יומיים, החלף כל מדיום מאודה ב -100 עד 200 מיקרוליטר של מדיום טרי במהלך הפיתוח.

ניתן לעקוב אחר שרירי הפנים ואבות הלב כשהם מתרבים ונודדים מקשת הלוע הראשונה והשנייה והופכים לשרירי הראש והלב בהתאמה. תרבית קשתות הלוע מציעה דרך ייחודית לחקור את התפתחות הלב והשרירים בפירוט ex vivo. באמצעות מערכת נעילת CRE, ניתן לעקוב אחר צאצאי מזודרם של עכבר על ידי מדווחים פלואורסצנטיים על ביטוי Cree תוך 24 עד 48 שעות מתרבית ex vivo לאחר 36 עד 72 שעות.

ניתן לאשר חזותית היווצרות קרדיומיוציטים על ידי התכווצות ספונטנית של אשכולות של תאים נודדים בתוך הקשת השנייה, כמו גם על ידי ניתוח של סמני קרדיומיוציטים ספציפיים. לאחר שלושה עד שבעה ימים של תרבית, ניתן לדמיין את היווצרות צינור השרירים והפנים כתאים מוארכים ומתעוותים באופן ספונטני בתוך הקשת הראשונה, ועל ידי ניתוח סמני שרירים ספציפיים לאחר התפתחותו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של תאי גזע של הלב והשריר לנטר ולחקור ישירות אבות מתרחבים והנישות שלהם במבחנה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לנתח קשתות פוראליות מעוברי עכברים מתפתחים ולתרבות במבחנה, המאפשרת לחקור את ההתפתחות הפרו-גנרטיבית של הלב והשרירים, ex vivo.