במבחנת דוגמנות של פלישה העצבית סרטנית: מודל גנגליון השורש הגבה

המטרה הכוללת של מודל זה היא לסכם את המיקרו-סביבה העצבית הסרטנית. זה מאפשר לחקור אינטראקציות של נוירונים של תאים סרטניים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המיקרו-סביבה של הגידול, כגון אינטראקציה בין תא הגידול לנוירונים וההשפעה ההדדית של כל קבוצה.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא אמינה, קלה לביצוע ומטפלת בגורמים תאיים ומוחיים כאחד בנישה העצבית. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על פיתוח טיפולי ומיקוד פרמקולוגי של גורמי מפתח בתהליך העיצוב מחדש והפלישה העצבית לאורך התפתחות הסרטן. לאחר המתת חסד של החיה בתא CO2, יש להשרות את הפרווה באתנול 70% ולאפשר לה להתייבש.

הצמד את העכבר למצב שכיבה, ולאחר מכן בצע חתך בקו האמצע המשתרע באופן גולגולתי מהצוואר האחורי לעמוד השדרה של העץ. לאחר מכן, השתמש במלקחיים כדי להרים את דשי העור באופן דו-צדדי ולחשוף את הרקמה התת עורית. משש את גולגולת העכבר עד לזיהוי צומת הגולגולת.

השתמש במספריים בזווית מאונכת לבעל החיים כדי לחתוך את שרירי צוואר הרחם ועמוד השדרה בצומת הגולגולת. לאחר מכן, נתחו את עמוד השדרה בזנב והשתמשו במספריים כדי לבצע חתך זנב מלא בחוליות המותניות החמישיות. לאחר מכן, מקם את העכבר במצב שכיבה, ולאחר ביצוע חתך לאורך קו האמצע מהצוואר לבטן, החזר את העור לרוחב ואז חתוך את הצפק.

באופן גולגולתי, פתח את דופן החזה במספריים. לאחר הסרת איברי הצפק והרטרופריטונאליים, השתמש במלקחיים ובלהב כירורגי כדי לחתוך את הצלעות, ולהשאיר כחמישה מילימטרים של צלעות בולטות מעמוד החוליות. הסר את עמוד השדרה משאר הגוף.

ולשטוף פעמיים עם PBS קר. מקם את עמוד השדרה כלפי מעלה באותו כיוון גולגולתי על פלטפורמה סופגת שאינה נצמדת תחת מיקרוסקופ סטריאו המצויד בהגדלה פי 4. תוך כדי הסתכלות דרך מיקרוסקופ סטריאו זה, הסר את כל שרירי עמוד השדרה ורקמת החיבור.

השתמש בצלעות כנקודות ציון לעצבים, כשהן עוזבות את עמוד השדרה. ה-DRG ממוקמים בחוליות צוואר הרחם, בית החזה והמותני. השתמש במספריים כדי לחתוך את גוף החוליה בקו האמצע, ליצור חלון לחוט השדרה, ולאחר מכן למשוך בעדינות את גוף החוליה כדי לחשוף את חוט השדרה ואת שורשי ה-DRG.

לאחר מכן, בעזרת מספריים קפיציים, הסר את הצלע העליונה כדי לחשוף את ה- DRG. עקוב אחר העצב ההיקפי באופן מדיאלי לאורך הצלע לרוחב ה-DRG. זהה את ה-DRG, שניתן לתאר אותו כנראה כמו חלמון של ביצה מטוגנת המונחת על העצב.

חותכים את העצב הבין-צלעי הדיסטלי ל-DRG ומשאירים שניים עד שלושה מילימטרים של עצב דיסטלי לגרעינים שישמשו לנסיגה. אחוז בזהירות בעצב הזורם באמצעות מלקחיים מבלי לצבוט או לפגוע ב-DRG. כעת החל נסיגה עדינה על ה-DRG על ידי משיכת העצב לרוחב.

לאחר מכן חותכים את השורשים הקדמיים והאחוריים קרוב ל-DRG. העבירו את ה-DRG המבודד לצלחת פטרי בגודל 35 מילימטר מלאה ב-DEM בתוספת קר כקרח. עבדו על קולט אדים למינארי, הניחו צלחת פטרי תחתית זכוכית בגודל 35 מילימטר על רשת נייר על קרח.

בעזרת קצה פיפטה מקורר מראש, הוצא כ-10 מיקרוליטר של ECM מדולדל גורם גדילה במרכז הרשת. בזמן צפייה במנה דרך מיקרוסקופ סטריאו בהגדלה של פי 2 עד 4, הנח את ה-DRG במרכז ה-ECM קרוב לתחתית המנה. לאחר הקציר והשטיפה 40,000 תאי סרטן מעניינים מתרביות קונפלואנט משעים מחדש את הגלולה ו-40 מיקרוליטר ECM על קרח.

שוב, צפו ברשת דרך מיקרוסקופ הסטריאו, מדדו 500 מיקרון מה-DRG והוציאו 10 מיקרוליטר של תרחיף התא בשלב זה. חזור על כל הכיוונים מה-DRG. השאירו את הכלי בקולט האדים למשך 10 עד 15 דקות כדי להתמצק אך לא להתייבש.

לאחר שה-ECM התמצק, הוסף לאט לאט תוספת DMEM על ידי פיפטינג על דופן הצלחת. הוסף כשני מיליליטר מדיה, מספיק כדי לכסות את ה-ECM. הוספת DMEM צריכה להיעשות לאט מאוד על ידי פיפטינג כנגד דופן הצלחת כדי למנוע ניתוק של ה-DRG מתחתית הצלחת.

הנח את הצלחת בחממת תרבית הרקמות, ופעל לפי ההוראות בחלק הכתוב של הפרוטוקול כדי לשמור על התרבית. המיקרוגרף הזה מראה את ה-DRG בחלק העליון של שדה הראייה ואת התאים הסרטניים בתחתית שדה הראייה ביום האפס לאחר הזריעה. כאן, אותה תרבות מוצגת שבעה ימים לאחר הזריעה.

כפי שמצוין על ידי החיצים, תאים סרטניים נודדים לאורך תא העצב DRG. היסטוגרמה זו מציגה את אינדקס פלישת העצבים DRG של סוגים שונים של תאים סרטניים. ניתן לראות כי לתאי Kpc 989 ו-MiaPaCa יש אינדקס פלישה עצבי גבוה יותר מאשר לתאי QLL2 או NIH3T3.

גרף קואורדינטות זה מתאר את נתיב הנדידה של תא סרטן Kpc במגע עם העצב המוצג באדום ותא QLL2 המוצג בסגול. הקואורדינטות X ו-Y מוצגות. איור זה מציג ניתוח ממרחק המוצא של תאי סרטן QLL2 נודדים עם מגע אקסונלי.

כאן מוצג מרחק המוצא של תאי סרטן Kpc. בכל אחד מהמקרים, כיוון הנדידה היה לכיוון גנגליון העצבים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להכין יותר גנגליונים מהנדרש מכיוון ששיעור הבדיקה אינו 100%לאחר פיתוחו, המניע של DRG סלל את הדרך לחוקרים בתחום חקר הסרטן לחקור את הנישה העצבית בתוך מיקרו-סביבת הגידול.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לזהות ציוני דרך אנטומיים כמו ה-DRG בעכבר, לחלץ את ה-DRG, ולבסוף, כיצד לתרבת אותו ב-DCM. מוצגת גם קוקולטורציה של ה-DRG יחד עם תאים סרטניים.