העסקת דיגיטלי אגל PCR לזיהוי מוטציות V600E BRAF בשורות תאי ההפניה תקן קבוע פורמלין מוטבע-פרפין

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לבודד גנום אנושי, DNA מקווי תאי ייחוס סטנדרטיים משובצים בפרפין פורמלי וקבוע באמצעות מערכת הכנת רקמות, ולאחר מכן ניתוח מוטציות bra V 600 E ב-DNA הגנומי באמצעות טיפה דיגיטלית. P-C-R-D-D-P-C-R יכול לעזור לענות על שאלות מפתח באונקולוגיה מולקולרית, כגון נוכחות ושפע של מוטציה ברצף RA וכימות של חומצת גרעין במספרי עותקי תבנית נמוכים. למרות ששיטה זו מודגמת ב-AEP מאז קווי תאים סטנדרטיים, ניתן להשתמש בהם גם בדגימות ביולוגיות אחרות רק כדי לוודא שאתה מייעל את התנאים לבידוד ה-DNA המעניין שלך.

ניתן להשתמש במערכת הכנת רקמות זו כדי לבודד עד 48 דגימות של DNA גנומי אנושי נטול מזהמים תוך ארבע שעות בהשוואה להליכים ידניים אחרים. מערכת זו יקרה במקצת להכנה בגלל השימוש בחרוז מגנטי. עם זאת, הוא בטוח יותר ומיוצר וקלאז' באיכות גבוהה הדגמת הלחץ תהיה ssu A וטכנאי מהמעבדה שלנו.

מיצוי DNA יבוצע במכשיר בידוד DNA אוטומטי לחלוטין באמצעות מערכת הכנת הרקמות או פרוטוקול TPS. התחל בהפעלת המכשיר והמחשב. פתח את תוכנת בקרת ההפעלה והכנס מגש טעינה אוטומטית לאזור הטעינה של סיפון TPS.

לאחר מכן, חלק ריאגנטים לשקתות המתאימות שלהם כפי שמוצג באיור זה הנח את ארבע הדגימות במדף נושא הדגימה. הקפידו על ערבוב נכון של מאגר הליזיס ומאגרי הכביסה על ידי היפוכם שלוש עד חמש פעמים ולאחר מכן העמיסו אותם לתוך השקתות המתאימות בעמודה ארבע. לאחר היפוך מספר פעמים או מערבולת קלה, טען את החרוזים המגנטיים של המאגר האלוסיאני ואת מאגר ה-FFPE לתוך השקתות הקטנות בעמודה חמש, והשאיר שני חריצים ריקים היכן שמצוין.

טען צלחת באר בעומק של שני מיליליטר על מנשא הצלחת. לפני תחילת ריצה מכסה UNC את כל הצינורות ושקתות הריאגנטים. ודא שיש קיבולת מספקת בבקבוק הפסולת הנוזלית ושבקבוק הפסולת המוצקה ריק ומרופד בשקית ביולוגית.

ודא שלוחית פליטת הקצה מרוכזת במכלול הפסולת. סגור את המכסה הקדמי, הפעל את התוכנה, פתח את כוכב ה-ML הראשי של NA prep. עשה קובץ רפואי.

לחץ על התחל. מצב המכשיר יעבור ממצב סרק לפועל. הזן את מספר הדוגמאות עבור ריצה זו.

בחר את השיטה הרצויה לריצה זו. הזן את המיקום של קצה הנפח הגבוה הראשון, ובחר אחד. אם כל המגשים מלאים, הזן את המיקום של קצה אמצעי האחסון הסטנדרטי הראשון ובחר אחד.

אם כל המגשים מלאים, המכשיר יעבור את השלבים האוטומטיים ללא התערבות המשתמש. זרימת עבודה מפורטת מוצגת כאן כדי למנוע זיהום. פעל לפי אמצעי הזהירות הסטנדרטיים כגון לבישת כפפות ושימוש במכסה מנוע PCR נקי.

נקו פיפטות וצינורות קשירה דלי חלבון. הרכיבו את תערובות התגובה ברצועות צינור PCR, הפשירו ואזנו את רכיבי התגובה לטמפרטורת החדר. דגימת ה-DNA הגנומית האנושית לניתוח טיפות דיגיטליות, PCR או D-D-P-C-R חייבת להיות בריכוז מינימלי של 3.3 ננוגרם למיקרוליטר.

הכן את תגובות ה-PCR. שלב את שני ה-X-D-D-P-C-R סופר מיקס 20 x קדימה ואחורה ובדיקה עם כל דגימת DNA מטוהרת וצור עד 20 מיקרוליטר עם מים מזוקקים. מערבולת את התערובת ביסודיות כדי להבטיח הומוגניות וצנטריפוגה קצרה כדי לאסוף את התוכן בתחתית הצינורות לפני החלוקה.

הפעל את מחולל הטיפות לפי הפרוטוקול המומלץ של היצרן. הכנס את המחסנית למחזיק עם חריץ במיכל הדיו הממוקם בצד השמאלי העליון של המחזיק. הוסף 20 מיקרוליטר של תערובת תגובה המכילה דגימות לבארות האמצעיות ו-70 מיקרוליטר של שמן גנרטור לבארות התחתונות.

חבר את האטם על פני החלק העליון של המחסנית. ודא שהאטם מחובר היטב בשני קצוות המחזיק. אחרת, לא יושג לחץ מספיק ליצירת טיפות.

פתח את מחולל הטיפות על ידי לחיצה על הכפתור הירוק בחלק העליון של המכשיר. הכנס את המחסנית כאשר המחזיק נמצא במצב הנכון. גם נוריות חיווי ההפעלה וגם נוריות חיווי המחזיק ירוקות.

לחץ שוב על הכפתור העליון במכשיר כדי לסגור את הדלת ולהתחיל ביצירת טיפות. נורית החיווי של הטיפות מהבהבת בירוק לאחר 10 שניות כדי לציין שיצירת טיפות מתבצעת. לאחר השלמת יצירת הטיפות, כל שלושת נוריות החיווי ישתנו לירוק מלא.

פתח את הדלת על ידי לחיצה על הכפתור והסר את המחזיק מהיחידה. הסר את האטם החד פעמי מהמחזיק והשליך אותו. שימו לב שהבארות העליונות של המחסנית מכילות את הטיפות והבארות האמצעיות והתחתונות כמעט ריקות עם כמות קטנה של שאריות שמן לאחר יצירת הטיפות.

התכוננו להגברת PCR קונבנציונלית. עבור כל דגימה, בצינור היו 40 מיקרוליטר מתכולת הטיפות מהבאר העליונה של המחסניות לבאר אחת של צלחת PCR מומלצת של 96 בארות כפי שמצוין בפרוטוקול המכשיר של היצרן, שאפו את הטיפה לאט ובעדינות כדי למזער את גזירת הטיפות במהלך ההעברות. מיד לאחר העברת הטיפות, יש לאטום את לוחית ה-PCR כדי למנוע אידוי.

הגדר את טמפרטורת אוטם הצלחות ל -180 מעלות צלזיוס ואת הזמן לחמש שניות. געו בחץ כדי לפתוח את דלת המגש. מקם את בלוק התמיכה על המגש כשצד 96 הבאר פונה כלפי מעלה.

הנח את צלחת 96 הבארות על בלוק התמיכה וודא שכל בארות הצלחת מיושרות עם מכסה בלוק התמיכה. צלחת 96 בארות עם גיליון אחד של אטם נייר כסף השתמש באטמי צלחת נייר כסף משלים התואמים לאוטם צלחות PCR ולמחטים בקורא הטיפות. לאחר שצלחת 96 הבאר מאובטחת על בלוק התמיכה ומכוסה בחותם נייר כסף הניתן לריפוי.

גע בלחצן האיטום. המגש ייסגר ותקרת החום תתחיל. לאחר השלמת איטום החום, הדלת תיפתח אוטומטית.

הסר את הצלחת מגוש החום ואז הסר את גוש החום. ודא שכל הבארות בצלחת אטומות על ידי בדיקת השקעים פנימה. נייר הכסף ניכר בקלות מעל כל באר.

לאחר האיטום, הצלחת מוכנה לרכיבה תרמית. בצע הגברת PCR קונבנציונלית על ידי ביצוע הפרמטרים המפורטים בטקסט הפרוטוקול. לאחר השלמת הגברת ה-PCR של יעד חומצת הגרעין בטיפות הללו.

השלב הבא הוא לנתח כל טיפה בנפרד באמצעות מערכת זיהוי שני צבעים. בדרך כלל, מכשיר קורא הטיפות מוגדר לזהות ארבע פלואורו של מדווח FAM ו-VIC. לחץ על מערכת שטיפה כדי להכין את קורא הטיפות ולהכין אותו לניתוח D-D-P-C-R.

טען את הצלחת בקורא הטיפות ולחץ על התחל. לאחר השלמת קריאת הטיפות, פתח את הדלת והסר את מחזיק הצלחת מהיחידה. להסיר. הסר את לוחית הקיר 96 מהמחזיק והשליך אותה.

לאחר מכן לבצע פרופיל מוטציות DNA באמצעות תוכנת ניתוח נתונים כמתואר בטקסט הפרוטוקול. בניתוח D-D-P-C-R זה, נחקרו המוטציות של RAF V 600 E. הקרינה זוהתה ועובדה לתצוגת פיזור דו-ממדית.

נעשה שימוש בתוכנה מותאמת אישית כדי לשרטט שערים מתאימים ומספר הטיפות בתוך כל שער נספר. טיפות המיוצגות על ידי נקודות כחולות מעל קו החיתוך הוורוד עבור כל הדגימות הן חיוביות. עבור מוטציה של RAF V 600 E טיפות חזייה מסוג Wild מיוצגות על ידי נקודות ירוקות בשתי החלקות.

הנקודות האפורות בתחתית נחשבות לרקע הקרינה. לאחר מכן חושבו תדירות האלל המוטנטית הכוללת על סמך האחוזים היחסיים של ריכוזי תבנית bra מסוג בר ו-brav V 600 E שזוהו בסמסטר אחד. ניתן לבצע HR עם הניתוח האישי תוך ארבע שעות לאחר תנוחה זו.

ניתן לבצע דגימות אחרות כמו ביופסיה נוזלית PPT על מנת לענות על שאלות נוספות כמו ניטור התקדמות הסרטן לאחר התפתחותו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האבחון הנלווה לחקור גילויים שונים של מוטציות בתחום האונקולוגיה המולקולרית. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לבצע את מערכת הכנת הרקמות ואת הטיפה הדיגיטלית P-C-R-S-A עבור נקודה מסוימת, זיהוי מוטציות DNA.