חינם מדויק פנול DNA זיהוי מין של יום 30 חזירים העוברים על ידי PCR

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות במדויק את המין של עוברי חזירים ביום 30, באמצעות DNA נטול פנולים המתקבל מכל עובר. ושני זוגות פריימרים ספציפיים למין לתגובת PCR. לשיטה זו יש פוטנציאל לענות על שאלות שונות הקשורות לפיזיולוגיה של הרבייה בבעלי חיים, כגון השפעת הגורמים האימהיים על יחס המינים כולל קיבולת הרחם והמצב המטבולי של הזרע וכן גורמים אבהיים שונים.

היתרון של טכניקה זו אינו כרוך בכימיקלים רעילים כגון פנול-כלורופורם, או עמודות יקרות במהלך טיהור ה-DNA. אז בואו נצא לדרך. הדגמה חזותית של שיטה זו חשובה לא פחות מהכנת הסימפטומים.

קל ללמוד את השלבים אך חשוב להקפיד במיוחד על הפרטים, כדי למנוע זיהום צולב של הסימפטומים. העבירו דגימות עובר למקפיא שלילי של שמונים מעלות צלזיוס, על פי הטקסט. סמן צינורות דגימה עם מזהה הדגימה הדרוש למספר הדגימות שיש לנתח.

השתמש בקרח יבש כדי למלא חצי מיכל תרמי והכנס צינור דגימה מוכן מראש לקרח היבש. תוך כדי לבישת כפפות חורף, עם זוג כפפות בדיקה מעל, העבירו מרגמות ועלים מקוררים מראש מהמקפיא השלילי של שמונים מעלות צלזיוס למיכל קרח יבש. לאחר מכן, הניחו עובר קפוא בתוך המרגמה על הקרח היבש, ולאחר מכן שפכו חנקן נוזלי מספיק כדי לכסות את העובר.

והשתמש בעלי כדי לטחון אותו לאבקה דקה. בעזרת מיקרו-מרית העבירו את אבקת העובר לצינור דגימה שנבנה מראש, והניחו את הצינור במקפיא שלילי של שמונים מעלות. חזור על הטחינה וההקפאה של כל עובר נוסף, החלף כפפות בדיקה בין הדגימות כדי למנוע זיהום צולב.

לאחר תיוג כל הצינורות המיקרו-צנטריפוגים הדרושים למספר הדגימות שיש לנתח, העבירו את צינורות הדגימה המכילים אבקת עוברים מהמקפיא השלילי של שמונים מעלות צלזיוס למיכל קרח יבש. הכניסו 180 מיקרוליטר של נתרן הידרוקסיד 50 מילי-מולרי לכל שפופרת מיקרו-צנטריפוגה שהוכנה מראש. מחממים חממה לתשעים וחמש מעלות צלזיוס.

בעזרת קיסם, העבירו כחמישה עד עשרה מיליגרם של אבקת עובר מצינור דגימה לתוך שפופרת מסומנת מראש של נתרן הידרוקסיד. הרם לאט את הקיסם מהתמיסה כדי לדמיין את ליזאט ה-DNA כחומר לבן דביק דמוי שקוף. העבירו את הדגימות עם ליזאט DNA לאינקובטור של תשעים וחמש מעלות צלזיוס למשך חמש דקות, ואז העבירו מיד את הצינור למיכל מבודד מלא בקרח.

לאחר מכן, הוסיפו עשרים מיקרוליטר של טריס-הידרוכלוריד טוחנת אחת ישירות לתוך הצינורות, והקישו על הצינורות כדי לערבב בעדינות. עם נייר pH, ודא שה-pH הוא כ-8.0. לאחר מכן, צנטריפוגה של הצינורות ב-2,000 G, וטמפרטורת החדר למשך שתי דקות כדי להסיר פסולת רקמה לא מומסת.

העבירו 150 מיקרוליטר של הסופרנטנט השקוף העליון לצינורות חדשים. או, צלחת 96 בארות. ומאחסנים בארבע מעלות צלזיוס עד שבועיים.

או, שלילי עשרים מעלות צלזיוס עד שנה. ההצלחה של פרוטוקול זה תלויה במידת הספציפיות שבה אתה מתכנן את הפריימר שלך על כרומוזום X ו-Y. אז איך מוודאים שהם נמצאים על כרומוזום X ו-Y?

שימוש ב-NCBI Map Viewer, היא הדרך הטובה ביותר להראות זאת. כדי לעצב פריימרים ספציפיים למין עבור PCR, השתמש באתר NCBI כדי לקבל מספרי הצטרפות לאזור קביעת מין סימן נקבוביות Y.Or SRY וחלבון אצבע אבץ מקושר X, או ZFX. העתק והדבק את מספרי ההצטרפות לכלי עיצוב פריימר מקוון.

השתמש בפיצוץ נוקלאוטיד או בפיצוץ N כדי לאמת את הספציפיות של הפריימרים מול מסד הנתונים הגנומי הנוכחי של סימני הנקבוביות 104. כדי להיכנס לרצפים, ממוקמים רק על כרומוזום X ו-Y עבור SRY ו-ZFX, בהתאמה. כדי לבצע PCR עם ליזטי ה-DNA, השתמש בכל אנזים PCR מוכן להתחלה חמה, והכין תערובת מאסטר על ידי הוספת שני פריימרים ספציפיים למין בריכוז סופי של 0.3 מיקרומולר בתגובת PCR של 15 מיקרוליטר.

לראשונה בהפעלת התגובות מכינות צינור PCR אחד לבקרה שלילית ללא תבנית, ושני צינורות נוספים לבקרה חיובית על ידי הוספת מיקרוליטר אחד של DNA גנומי של נקבוביות מין שהושג באופן מסחרי. לסבבים הבאים של PCR, כלול מיקרוליטר אחד של דגימה מניתוח המין המוצלח האחרון כביקורת חיובית. הגדר את תוכנית ה-PCR הבאה בתרמו-סייקלר ובצע PCR.

כדי לגוון את הדגימות לאחר PCR, הכינו ג'ל אגרוז 2% TBE עם כתם ג'ל סייבר DNA או אתידיום ברומיד. הוסף 1.5 מיקרוליטר של צבע טעינה פי 10 לדגימות לפני הטעינה על הג'ל והפעלתו. התבונן והתאם את עוצמות הרצועה תחת אור פלורסנט וצלם תמונה של הג'ל.

זהה עוברים עם רצועה אחת כנקבה ושתי רצועות כזכר. מוצגת כאן תוצאה מייצגת לקביעת מין מ-345 ליזטים של DNA שנבדקו על ידי PCR. טמפרטורת החישול האופטימלית של הפריימר של 65 מעלות צלזיוס גבוהה במראה מה-TM של הפריימרים המוצגים כאן ליצירת עוצמה דומה וגדלי אמפילקון חזויים.

שני מוצרים מוגברים של SRY ו-ZFX מוצגים כאן. דגימת ליזאט מעוברים נקביים מייצרת רק רצועה אחת של 506 זוגות מבוססי שבר DNA מהגן ZFX הממוקם על כרומוזום X. כל העוברים הזכרים מייצרים שני שברי DNA בעוצמה שווה של 400 זוגות בסיסים עבור SRY ו-506 זוגות בסיסים עבור ZFX.

כפי שמוצג כאן, ליזטים של DNA לא הראו עיכוב תגובת PCR לאחר בדיקת 345 עוברים. רק שלושה פרטים לא היו מינים ואחוז העוברים הנקבות היה מעט גבוה יותר מזכרים. לאחר שליטה בטכניקה זו מהטחינה ועד לביצוע PCR, לוקח כשעה לעבד כעשרה עוברים.

כאשר עושים טכניקה זו, חשוב להימנע מזיהום צולב, במיוחד בעת העברת אבקת עובר לצינורות. בעקבות הליך זה, אנו יכולים להשתמש בשיטות אחרות כגון מתילציה של DNA, מיקרו-מערך וריצוף כדי לחקור השפעות גנומיות ואפיגנטיות של תזונה ומחלות זיהומיות בין המינים. פיתוח טכניקה זו יסלול את הדרך לחוקרים בתחומי הפיזיולוגיה של הרבייה ומדעי בעלי החיים לערוך מחקר הקשור לדימורפיזם מיני במינים שונים של בעלי חיים.

לאחר צפייה בסרטון זה אמורה להיות לך הבנה טובה כיצד לעצב פריימרים ספציפיים למין, לפשט DNA מעוברים ולבצע תגובת PCR באמצעות ליזטים של DNA. זכור שעבודה עם קרח יבש היא די מסוכנת, לכן נקוט באמצעי זהירות נאותים ללבוש כפפות ומשקפי מגן.