Name: ובידוד Ex Vivo תרבות של Vδ1 + CD4 + תאי T γδ, Extrathymic αβT-תא אב (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: למד לבודד ולשכפל תאי T מסוג Vδ1+ CD4+ מדם אנושי בתרבית ex vivo. שיטה זו מאפשרת בידוד מהיר ויעיל של אוכלוסייה נדירה תוך שמירה על תפקודיות וחיוניות התאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Christian Welker ממומן על ידי מענק הניתן על ידי קרן יורגן-מנצ'וט.

הצהרת מוסר: כל הנהלים בוצעו בהתאם להצהרת הלסינקי ואושרו על ידי ועדת האתיקה הקלינית באוניברסיטת טובינגן (פרויקטי 38 / 2009B02 ו470 / 2013B02). 1. בידוד של תאי הדם ההיקפיים mononuclear (PBMCs) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 50-100 מ&quot;ל ממתנדב בריא באמצעות venipuncture באמצעות מזרק 50 מיליליטר מכיל 1,000 סולפט הפרין IU ולדלל את הדם 1: 2 עם PBS (pH = 7.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שכבה בזהירות 35 מיליליטר של הדם: פתרון PBS על פתרון הפרדת 15 מיליליטר דם כגון Biocoll (ד = 1.077 גרם / מיליליטר) בצינור חרוטי 50 מיליליטר. צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 800 XG ב RT. הערה: אין להשתמש בבלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את התאים של שכבת ימפוציטית עם טפטפת ולשטוף את התאים פעמיים בלפחות 50 מיליליטר PBS (צנטריפוגות במשך 12 דקות; ב 400 XG). הסר את supernatant לאחר צנטריפוגה עם טפטפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse נותר אריתרוציטים ידי השעיית וincubating חלק ימפוציטית עם 1-5 מיליליטר של תמיסת חיץ hypotonic במשך 2-4 דקות. הערה: משך החשיפה והנפח של lysing חיץ תלוי בחיץ lysing משמש ועל כמות תאי דם אדומים שנשארו בחלק הלימפוציטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את התאים עם PBS (01:10) וצנטריפוגות ב 250 XG דקות 12 ולאחר מכן resuspend ולשטוף את התא גלולה פעם אחת ב 10 מיליליטר PBS ב XG 300 דקות 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend לימפוציטים בPBS ולספור את התאים בתא ספירת נויבאואר באמצעות Trypan פתרון כחול. הערה: בדרך כלל,&gt; 1 x 10 8 ימפוציטים מתקבלים מ-100 מיליליטר טרי נמשכת דם היקפי. </li></ol> 2. בידוד של תאי T Vδ1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח &lt;1 x 10 6 ימפוציטים מבודדים לFACS ראשוני קביעת התדירות של תאי CD4 T Vδ1. הערה: גודל אוכלוסייה של ישות T-cell זה עשוי להיות שונה מאוד בין אנשים ובהתאם למצב החיסוני שלהם. Typicברית, כ -1% מתאי T הם Vδ1 + ועל 1-5% מVδ1 + התאים CD4 +. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את התאים עם 1 מיליליטר FACS חיץ, אשר מורכב מPBS FCS המכיל 2% ו 5 מ&quot;מ EDTA. צנטריפוגה ב 660 XG למשך 2 דקות ולמזוג supernatant. ריפלוקס הנפח של חיץ FACS על 100 μl מספיק לצביעה לאחר מכן. בקצרה מערבולת דגירה התאים עם 5 μl FC-חסימה מגיב במשך 5 דקות על RT עבור סגוליות מוגבר של הכתמת FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף נוגדנים חד שבטיים אנושיים ישירות לתאים מבלי להסיר את חסימה מגיב-FC. הקפד להכתים את התאים עם נוגדנים נגד Vδ1 (01:50), CD3 (01:50), CD4 (1: 200), CD8 (1: 200) וTCRαβ (01:25). הכן את שליטת אלוטיפ עם isotypes אימונוגלובולינים המקביל. דגירה תאים עם נוגדנים במשך 20 דקות ב 4 ° C בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים במאגר FACS מיליליטר 1 (צנטריפוגות במשך 2 דקות, ב660 XG), למזוג supernatant ולהמשיך לרכישת FACS בנותר חיץ הנפח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pelletize התאים (שאינם משמשים בניתוח FACS) על ידי צנטריפוגה דקות 12; ב300 גרם; 8 מעלות צלזיוס. הסר את supernatant ו resuspend תא pelletin 60 μl MACS-חיץ לכל 1 x 10 7 תאים. הוסף 20 מגיב חסימה-FC μl לכל 1 x 10 7 תאי דגירה במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl נוגדן Vδ1 אנטי אנושי FITC- מצומדות לכל 1 x 10 7 תאים ישירות לתאים. דגירה של 12 דקות על 4 מעלות צלזיוס בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים באמצעות 14 מיליליטר MACS-חיץ (צנטריפוגות במשך 12 דקות; ב 300 גרם; 8 מעלות צלזיוס). בטל supernatant לחלוטין וresuspend תאי חיץ MACS 80 μl ל1x10 7 תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 1-2 x 10 5 תאים ולדלל אותם במאגר FACS 100 μl לאימות של התיוג על ידי ניתוח FACS. אין תוספים נוספים נדרשים לצעד זה. ודא שיש suffiהבדל מספיק בבהירות לVδ1 - ותאי Vδ1 +. אם זה לא המקרה, חזור על שלבים 2.3) ו -2.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף microbeads אנטי FITC 20 μl לכל 1 x 10 7 תאים לתאים הנותרים, ומערבב היטב דגירה במשך 15 דקות בחושך על 4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לשטוף את התאים באמצעות לפחות 10 חיץ MACS מיליליטר (צנטריפוגות במשך 12 דקות, ב XG 300; 8 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך צנטריפוגה, לאזן את העמודה המגנטית מקורר מראש להציב מגנט עם חיץ MACS 500 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאי 500 μl MACS-חיץ (למספרים סלולריים גבוהה יותר מאשר 1 x 10 8, בהיקף של עד נפח זה בהתאם) ולהחיל את התאים בזהירות על הטור. לאסוף את הזרימה דרך מכיל Vδ1 - תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את העמודה שלוש פעמים עם 500 μl MACS-חיץ ולאסוף את הזרימה דרך שוב באותו הצינור. שים לב שהמאגר חייב להיות ריק לפני יישום חיץ על הטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העמודה מהמכשיר המגנטי ולמקם אותו לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר. מהירות לשטוף את העמודה עם חיץ MACS 1 מיליליטר בתוקף דוחף את הבוכנה לתוך הטור. לאסוף את eluate בצינור. הערה: על מנת לקבל טוהר&gt; 98%, זה בדרך כלל צורך לחזור על שלבים 2.7-2.9) עם עמודה שנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא את הטוהר של התאים על ידי ניתוח FACS 18 עם אותו פנל הנוגדנים כמו קודם (ראה 2.1.2) ולספור את התאים. </li></ol> 3. בידוד של תאי Vδ1CD4 + T <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend 25 μl של חרוזים CD4 עם מערבולת ל&gt; 30 שניות. שטוף את החרוזים (הסכום המינימאלי כמתואר על ידי היצרן) בחיץ 1 מיליליטר MACS בצינור 1.5 מיליליטר תגובה על ידי הנחת הצינור לאבן שואבת ל1 דקות. בטל supernatant בזהירות עם פיפטה בקנה מידה קטנה (200 μl) וresuspend חרוזים בנפח המקורי של MACS-חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pelletize Vδ1 + תאים (צנטריפוגות במשך 12 דקות; ב XG 300) ולשאוב supernatant ו resuspend כל Vδ1 התאים + ב500 μl MACS-חיץ ולהוסיף אותם לצינור המכיל את החרוזים. מערבבים נמרצות ודגירה של 20 דקות ב 4 ° C עם הטיה קבועה (למשל, במסובב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור המכיל את התאים במגנט למשך 2 דקות. ודא שאין שאריות במכסה. הערה: תאי CD4 + תהיה מחויבים חרוזים המגנטיים ולצרף לצד של הצינור מול המגנט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתוח בזהירות את המכסה תוך שמירה על הצינור בתוך המכשיר המגנטי ולאסוף את supernatant המכיל CD4 - Vδ1 + תאים בעזרת פיפטה בקנה מידה קטנה. הנח CD4 - Vδ1 + תאים לתוך צינור נפרד ומניח הצינור הזה לתוך המגנט שוב כדי למנוע אולי נותרו תאי CD4 או חרוזים מהאוכלוסייה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את CD4 - תאים ב 5 מיליליטר MACS-חיץ (צנטריפוגות במשך 12 דקות; ב XG 300)ND resuspend אותם בריכוז של 1 x 10 5 תאים לכל 100 מדיה μl. CD4 - תאים יכולים להיות מתורבתים בקלות בתנאים כדלקמן (4.2). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור עם מטרות תאי CD4 + מחוץ לשדה המגנטי, resuspend תאי 500 μl MACS-חיץ ולשים אותם בחזרה לתוך המכשיר המגנטי. חזור על שלבים 3.3-3.5 פעמיים כדי להשיג טוהר גבוה יותר. הסר supernatant ידי pipetting </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend CD4 + התאים בתקשורת ותרבות 100 μl (1640 RPMI, FCS 10%, 1% L-גלוטמין, 1% פניצילין / סטרפטומיצין) ולהוסיף 10 μl של פתרון ניתוק-חרוז. לדגור על RT עבור 45 דקות עם הטיה קבועה (למשל, במסובב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את התאים במגנט דקות 1. לאסוף בזהירות את supernatant המכיל תאים + CD4 + ללא חרוז Vδ1 בעזרת פיפטה בקנה מידה קטנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחוץ למגנט, resuspend חרוזים עם תקשורת ותרבות 100 μl וחזורצעדים 3.6 ו -3.7 פעמיים כדי לקבל מספרים סלולריים גבוהים יותר של תאים מסוג CD4 +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pelletize התאים (צנטריפוגות ב 300 XG, דקות 12) וזורקים supernatant לחלוטין על ידי pipetting. Resuspend תאים בתקשורת טרי, מחוממת מראש ולספור אותם. לבחון את טוהר של Vδ1 + CD4 + התאים על ידי ניתוח FACS המתואר בצעדי 2.1.1-2.1.3. </li></ol> 4. תא בודד שיבוט על ידי דילול מוגבל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בודד תאים היקפיים mononuclear הדם (PBMCs) מתורם אלוגנאית כמתוארים ב1.1-1.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקרין 2.5 x 10 7 PBMCs אלוגנאית עם 80 Gy בתקשורת ותרבות 25 מיליליטר באמצעות γ-קרינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף IL-2 (200 U / ml), IL-7 (20 ng / ml) וPHA (2 מיקרוגרם / מיליליטר) לתאים מזינים המוקרנים ולהפיץ אותם ב96-גם צלחות U-צורה, 5 x 10 4 מזין תאים ב -50 μl בכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את תאי Vδ1 + CD4 + לריכוז של 0.3 תאים לכל 50 μl. Pipette 50 μl של פתרון התא לכל מחסה גם תאים וציטוקינים המוקרנים. הערה: כך, ציטוקינים הם בדילול לריכוז הסופי של 100 IL-2, 10 ng / ml PHA מיליליטר U / IL-7 ו 1 מיקרוגרם / מיליליטר. דגירה צלחות 96-היטב בחממה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 אווירת humidified. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, לטפח נותר מטוהר Vδ1 + CD4 + תאים כתרבות בתפזורת באותם תנאי התרבות כמו השיבוטים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספק את התאים כל 3-4 ימים עם ציטוקינים ותקשורת טריות. לשם כך, מחצית חילופי הבינוני בבארות עם 50 בינוני μl טרי על ידי pipetting. להוסיף ריכוז פי 2 של ציטוקינים לכל תוספת. להוסיף 5x10 4 תאים מזינים המוקרנים לכל גם כל סיבוב של האכלה אחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ, להתבונן השיבוטים הראשונים הפכו גלויים לאחר 3-4 שבועות, כפי שהם חילוף חומרים ובכך לשנות את הצבע של המושבות בינוני תרבות וצורה. הערה: לפרווהטיפוח יס, resuspend השיבוטים היטב ולהעביר אותם להפריד 96-גם צלחות. נתח את התאים באמצעות FACS כפי שצוין ב2.1.1-2.1.3. שיבוטים המשיכו בתנאים אלה עלולים סופו של דבר לשנות את TCR שלהם מVδ1 לαβTCR. הנקודה לtransdifferentiation זה הזמן משתנה משיבוט לשבט. </li></ol>

<ol><li>Bhandoola, A., von, B. H., Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commitment+and+developmental+potential+of+extrathymic+and+intrathymic+T+cell+precursors%3A+plenty+to+choose+from%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Commitment and developmental potential of extrathymic and intrathymic T cell precursors: plenty to choose from.</a> Immunity. 26 (6), 678-689 (2007).</li>
<li>Von, B. H., Melchers, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Checkpoints+in+lymphocyte+development+and+autoimmune+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease.</a> Nat. Immunol. 11 (1), 14-20 (2010).</li>
<li>Prinz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+earliest+steps+of+gammadelta+T+cell+development+in+the+adult+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Visualization of the earliest steps of gammadelta T cell development in the adult thymus.</a> Nat. Immunol. 7 (9), 995-1003 (2006).</li>
<li>Ferrero, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCRgamma+silencing+during+alphabeta+T+cell+development+depends+upon+pre-TCR-induced+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">TCRgamma silencing during alphabeta T cell development depends upon pre-TCR-induced proliferation.</a> J. Immunol. 177 (9), 6038-6043 (2006).</li>
<li>Krangel, M. S., Carabana, J., Abbarategui, I., Schlimgen, R., Hawwari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enforcing+order+within+a+complex+locus%3A+current+perspectives+on+the+control+of+V%28D%29J+recombination+at+the+murine+T-cell+receptor+alpha%2Fdelta+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Enforcing order within a complex locus: current perspectives on the control of V(D)J recombination at the murine T-cell receptor alpha/delta locus.</a> Immunol. Rev. 200, 224-232 (2004).</li>
<li>Hawwari, A., Krangel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+rearranged+variable+gene+segments+in+directing+secondary+T+cell+receptor+alpha+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Role for rearranged variable gene segments in directing secondary T cell receptor alpha recombination.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (3), 903-907 (2007).</li>
<li>Hawwari, A., Krangel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+TCR+delta+and+alpha+repertoires+by+local+and+long-distance+control+of+variable+gene+segment+chromatin+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Regulation of TCR delta and alpha repertoires by local and long-distance control of variable gene segment chromatin structure.</a> J. Exp. Med. 202 (4), 467-472 (2005).</li>
<li>Hawwari, A., Bock, C., Krangel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+T+cell+receptor+alpha+gene+assembly+by+a+complex+hierarchy+of+germline+Jalpha+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of T cell receptor alpha gene assembly by a complex hierarchy of germline Jalpha promoters.</a> Nat. Immunol. 6 (5), 481-489 (2005).</li>
<li>Hager, E., Hawwari, A., Matsuda, J. L., Krangel, M. S., Gapin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+constraints+at+the+level+of+TCRalpha+rearrangement+impact+Valpha14i+NKT+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Multiple constraints at the level of TCRalpha rearrangement impact Valpha14i NKT cell development.</a> J. Immunol. 179 (4), 2228-2234 (2007).</li>
<li>Linton, P. J., Dorshkind, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+changes+in+lymphocyte+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Age-related changes in lymphocyte development and function.</a> Nat. Immunol. 5 (2), 133-139 (2004).</li>
<li>Sprent, J., Tough, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+life-span+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte life-span and memory.</a> Science. 265 (5177), 1395-1400 (1994).</li>
<li>Guy-Grand, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrathymic+T+cell+lymphopoiesis%3A+ontogeny+and+contribution+to+gut+intraepithelial+lymphocytes+in+athymic+and+euthymic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Extrathymic T cell lymphopoiesis: ontogeny and contribution to gut intraepithelial lymphocytes in athymic and euthymic mice.</a> J. Exp. Med. 197 (3), 333-341 (2003).</li>
<li>McClory, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+stepwise+program+of+extrathymic+T+cell+development+within+the+human+tonsil%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Evidence for a stepwise program of extrathymic T cell development within the human tonsil.</a> J. Clin. Invest. 122 (4), 1403-1415 (2012).</li>
<li>Jbakhsh-Jones, S., Jerabek, L., Weissman, I. L., Strober, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrathymic+maturation+of+alpha+beta+T+cells+from+hemopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Extrathymic maturation of alpha beta T cells from hemopoietic stem cells.</a> J. Immunol. 155 (7), 3338-3344 (1995).</li>
<li>Garcia-Ojeda, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+development+of+committed+progenitors+in+the+bone+marrow+that+generate+functional+T+cells+in+the+absence+of+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Stepwise development of committed progenitors in the bone marrow that generate functional T cells in the absence of the thymus.</a> J. Immunol. 175 (7), 4363-4373 (2005).</li>
<li>Arcangeli, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrathymic+hemopoietic+progenitors+committed+to+T+cell+differentiation+in+the+adult+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Extrathymic hemopoietic progenitors committed to T cell differentiation in the adult mouse.</a> J. Immunol. 174 (4), 1980-1988 (2005).</li>
<li>Maillard, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch-dependent+T-lineage+commitment+occurs+at+extrathymic+sites+following+bone+marrow+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Notch-dependent T-lineage commitment occurs at extrathymic sites following bone marrow transplantation.</a> Blood. 107 (9), 3511-3519 (2006).</li>
<li>Ziegler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Peripheral+CD4%28%2B%29+Vdelta1%28%2B%29+gammadeltaT+Cells+Can+Develop+into+alphabetaT+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human Peripheral CD4(+) Vdelta1(+) gammadeltaT Cells Can Develop into alphabetaT Cells.</a> Front Immunol. 5, 645(2014).</li>
<li>Mollet, M., Godoy-Silva, R., Berdugo, C., Chalmers, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+simulations+of+the+energy+dissipation+rate+in+a+fluorescence-activated+cell+sorter%3A+Implications+to+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Computer simulations of the energy dissipation rate in a fluorescence-activated cell sorter: Implications to cells.</a> Biotechnol Bioeng. 100 (2), 260-272 (2008).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

ללמוד את הפנוטיפ, הביולוגיה ותפקוד של גוף תא נדיר (טי), כלומר תאי Vδ1 + CD4 + T, השתמשנו שני סמנים: Vδ1 וCD4 לבידוד המגנטי החיובי שלה תא. Vδ1 הוא קולטן יתום, ואילו CD4 מתבטא בתאי T מסייע, ברמה נמוכה יותר במונוציטים ותאים דנדריטיים, וברמה נמוכה מאוד ובתאי hematopoietic. טכניקות להעשרה והבחירה של תאים בטוהר גבוה כוללות הקרינה הופעלה תא מיון (FACS), טכניקה שמפרידה בין אוכלוסייה של תאים לתוך תת-...

בבעלי חוליות, חסינות אדפטיבית שבנויה בסלולרי וחלק הלחות של חסינות משחקת תפקיד מרכזי בהגנה מפני פתוגנים. ההכרה במגוון רחב של אנטיגנים מתווך על ידי T-hyperpolymorphic וקולטני תא B (TCR / BCR), אשר ביחס לתאי T הם הניחו להיות מיוצרים בעיקר בבלוטת התימוס 1. לכך, תאי גזע hematopoietic (HSCs), הנגזרים ממח עצם, זרע התימוס ולהבדיל לאורך שלבים מוגדרים היטב לבסוף והוליד את כל שושלות תאי T. אבות זריעת התימוס הם CD4 - וCD8 - ובכך מהווים את חלק thymocyte לא בוגר, שלילי כפול (DN). אותות נגזר התימוס אז לגרום למחויבות שושלת היוחסין שלהם ובידול לאו תאי T αβ או γδ. הביטוי של גני שרשרת תפקודית משוחלפים TCR-γ וTCR-δ בDN2 / 3 thymocytes מוביל לγ מתחמי δTCR, אשר כונן תרבות תאיםd לקדם בידול לתאי δT γ 2,3. לעומת זאת, הארגון מחדש של שרשרת TCR-β פונקציונלי, שיכול להתאים עם preTα לבנות PT preTCR, גורם להשתקת תעתיק של שרשרת TCR-γ בthymocytes DN3 ומעברם לthymocytes CD4 + CD8 + כפול החיובי 4 . בשלב זה, רקומבינציה של שרשרת TCR-α מתרחשת, מחיקת מוקד TCR-δ שמקנן בתוך מוקד TCR-α, וכך בביטול הייצור γδTCR בתאים אלה באופן בלתי הפיך 5-9. αβTCRs מחדש נבחר לאחר מכן ליכולתם להיקשר עצמי MHC חלש (בחירה חיובית), אשר לא תעלה על סף מסוים, כדי למנוע אוטואימוניות (סלקציה שלילית). על פי יכולתם של מחייב כיתת MHC I או II, תאי αβT נבחרו להתפתח לאחד חיובי מסוג CD4 + או CD8 + T תאים, שיציאת התימוס תאי T נאיביים כ. עם זאת, לפוף של התימוס מתחיל מוקדם בחיים המובילים לתפוקה מופחתת באופן אקספוננציאלי של תאי T הנאיביים שהיא פוסט-התבגרות כמעט כבויה 10. עם זאת, בגודל של בריכת תא T נשאר קבוע לאורך כל חיים, שיכול להיות מוסבר רק בחלקו על ידי התפשטות פוסט-הרתי homeostatic של תאי T וההתפשטות של זיכרון חיסוני הארוך חי 11. כתוצאה מכך, חייבת להתרחש התפתחות תאי T extrathymic. מחקר שנערך לאחרונה צבר משיכה משמעותית שאפיינה את אבות תא αβT, אשר-בextrathymic אתרים-הולידו αβ התפקודי תאי T 12-17. עם זאת, ידע מפורט על מבשרי תא αβT extrathymic שעצמאיים מהתימוס להתמיין לתאי αβT הוא מקוטע כמו הרקע שיש לנו במסלול שהם לוקחים ובכך. לאחרונה זיהו את ישות תא T הקטנה של Vδ1 + </sup&gt; תאי CD4 + γδT כprognitor extrathymic αβT תא 18, שכאשר מבודדים מהדם היקפי של תורמים אנושיים בריאים יכול transdifferentiate לתאי αβT בסביבה דלקתית קלה. מעניין ובניגוד לתרבות הומיאוסטטית של תאי T פוסט-הרתי, transdifferentiation של Vδ1 CD4 + תאים מייצר קולטנים תא T חדשים, ובכך להרחיב את מגוון הרפרטואר, כך שיכולים להיות מוכרים אנטיגנים חדשים פוטנציאלי והוא רשאי הגנת המארח מפני פתוגנים חדשים שנרכשו. זה מוסיף לגמישות של תאי T ומוסיף עד כה שלא מעריך את מסלול חדש לפיתוח תא T extrathymic. בידוד כמותית ממקורות ימפוציטית, הדור של שיבוטים תא בודד וההרחבה היעילה שלהם הם חיוניים למטרה לזהות את אותם סמנים ומולקולות המפעילים תא αβT זה precursor`s פיתוח extrathymic.

<table><tbody><tr><td>Biocoll Solution</td><td>Biochrom</td><td>L 6113</td><td>תמיסת הפרדת לימפוציטים</td></tr><tr><td>Lysing Buffer BD</td><td>BioSciences</td><td>555899</td><td>ליזה של אריתרוציטים&nbsp;</td></tr><tr><td>תמיסת מלח סיגמא</td><td>אולדריץ</td>' <td>D8537&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>מאגר MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>תוסף עם BSA וקירור מראש לפני השימוש</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td>לא חובה מספק</td></tr><tr><td>זה אנטי אנושי Vd1 FITC (שיבוט:&nbsp; TS8.2)</td><td>Thermo Scientific</td><td>TCR2730</td><td>לא חובה מספק זה</td></tr><tr><td>אנטי אנושי CD3 PerCP (שיבוט: SK7)</td><td>BD BioSciences</td><td>345766</td><td>לא חובה מספק זה או</td></tr><tr><td>מ-TCRab PE אנטי-אנושי פלורוכרום זה (שיבוט: T10B9.1A-31)</td><td>BD BioSciences</td><td></td><td>555548 לא חובה מספק זה או מ-CD4 VioBlue אנטי-אנושי פלורוכרום זה</td></tr><tr><td>(שיבוט: M-T466)&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-333</td><td>לא חובה מספק זה או מ</td></tr>- <tr><td>CD8 APC-H7 אנטי אנושי זה של פלורוכרום (שיבוט: SK1)</td> <td>BD BioSciences</td><td>641400</td><td>לא חובה מספק זה או ערכת flurochrome</td></tr><tr><td>Anti-FITC MultiSort</td> זו <td>Miltenyi Biotec</td><td>130-058-701</td><td>מניבה תוצאות טובות יותר מאשר עמודות MS MicroBeads אנטי FITC</td></tr><tr><td></td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td>קירור מקדים לפני השימוש</td></tr><tr><td>מפריד MiniMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>CD4 ערכת בידוד חיובי</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>11331D</td><td></td></tr></tbody></table>

ובידוד<em&gt; ex vivo</em&gt; תרבות של vδ1<sup&gt; +</sup&gt; cd4<sup&gt; +</sup&gt; תאי t γδ, extrathymic αβt-תא אב

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

התימוס, האיבר העיקרי לייצור תאי T αβ ועמוד השדרה של המערכת החיסונית אדפטיבית בבעלי חוליות, כבר מזמן נחשב כמקור היחיד של תאי αβT. ובכל זאת, לפוף הרתי מתחיל מוקדם בחיים מובילים לתפוקה מופחתת באופן דרסטי של תאי αβT נאיביים לפריפריה. עם זאת, גם בני מאה יכולה לבנות חסינות מפני פתוגנים חדשים שנרכשו. המחקרים אחרונים מצביעים פיתוח תא αβT extrathymic, אולם ההבנה שלנו של מסלולים שעשויות לפצות על אובדן הרתי של פונקציה עדיין rudimental. תאי T γδ הם לימפוציטים מולדים המהווים תת-הקבוצה T-cell העיקרי ברקמות. לאחרונה ייחסו פונקציה מצטיינת עד כה שלא מעריכים לקבוצת משנה תא T γδ ידי מראה כי הישות נדירה של CD4 + Vδ1 + γδ תאי T יכולים transdifferentiate לתאי αβT במצבים דלקתיים. כאן, אנו עמ &#39;rovide הפרוטוקול לבידוד של אב זה מהדם היקפי והטיפוח הבא שלה. תאי Vδ1 מועשרים באופן חיובי מPBMCs של תורמים אנושיים בריאים באמצעות חרוזים מגנטיים, ואחריו שלב שני שבו אנו ממקדים את החלק יחסי הנדירים של תאי CD4 + עם טכניקת תיוג מגנטית נוספת. הכוח המגנטי של התיוג השני עולה על אחד מהתווית המגנטית הראשונה, ובכך מאפשר את הבידוד החיובי יעיל, כמותי וספציפי של האוכלוסייה של עניין. לאחר מכן, אנו מציגים את מצב הטכניקה והתרבות הנדרש לשיבוט וביעילות הרחבת התאים ולזיהוי של השיבוטים שנוצרו על ידי ניתוח FACS. לפיכך, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לטיהור, התרבות והרחבת vivo לשעבר של CD4 + Vδ1 + γδ תאי T. ידע זה הוא תנאי הכרחי ללימודים הקשורים לביולוגיה progenitor`s תא αβT זה ועבור מי ששואף לאיידntify גורמים המולקולריים המעורבים בtransdifferentiation.

איור 1 מתאר את השלבים השונים ואת התוצאה של הבידוד של תאי T Vδ1 מהדם היקפי. איור 1 א מציג התפלגות טיפוסית של Vδ1 + תאים לימפוציטים בCD3 +, כמו גם ביטוי שיתוף קולט של אוכלוסיית Vδ1 +. בתורם זה, תדירות Vδ1 + תאים (אדום) היא 2.3% מכלל ספירת הלימפוציטים וביטוי CD4 (הירוקה) של Vδ1 + לימפוציטים הוא 2.6%. בסך הכל, אוכלוסיית היעד לבידוד מייצגת 0.06% של לימפוציטים כולל בתורם זה. איור 1 ...

כאן, אנו מספקים פרוטוקול אופטימלי לבידוד ושיבוט של ישות תאי T הנדירה של תאי T Vδ1+CD4+ היקפיים, שהיא, כפי שהראינו לאחרונה, אב תאי T αβ חוץ-תימיים. טכניקה זו מאפשרת לבודד כמותי, לשכפל ולהרחיב ביעילות תאים אלה בתרבית ex vivo.

ובידוד<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבות של Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; תאי T γδ, Extrathymic αβT-תא אב

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been ...

המטרה הכללית של הליך ניסיוני זה היא לבודד באופן כמותי ולהשיג אוכלוסייה מטהרה מאוד של תאי V delta one gamma delta T חיוביים ל-CD four הנדירים, כפי שהודגם עבור תאי אב של alpha beta T-cell. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום התפתחות תאי T חוץ-תימוסית לגבי הגורמים המאתחלים, המניעים והממזמנים את השראת התגובות החיסוניות האדפטיביות. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת העשרה מהירה ויעילה של ישות תא נדירה תוך שמירה על התפקוד, החיוניות והסטריליות של התאים.כדי לבודד את ה-PBMC, התחילו בדילול של 50 עד 100 milliliters של דגימת דם אנושית שהושגה לאחרונה ביחס של אחת לשתיים עם PBS. לאחר מכן, העבירו בזהירות 35 milliliters של הדם המדולל כשכבה מעל 15 milliliters של גרדיאנט להפרדת תאים בתוך מבחנה קונית של 50 milliliters, והפרידו את התאים באמצעות סבוב (centrifugation). לאחר איסוף שכבת הלימפוציטים, שטפו את התאים ב-PBS והשעיקו מחדש את משקע הלימפוציטים ב-one to five milliliters של תמיסת בופר היפוטוני כדי לבלוע את כדוריות הדם האדומות שנותרו.עצרו את הליזיס לאחר שתי עד ארבע דקות על ידי הוספת נפח של PBS הגדול פי 10 מהנפח הקיים, ולאחר מכן השקיעו את התאים ושטפו אותם ב-10 milliliters של PBS טרי לפני תחילת בידוד תאי V delta 1 T. השתמשו במכסה של 1×10⁶ של PBMC כדי להעריך את השכיחות של תאי V delta 1, CD4 positive T בדגימת התורם באמצעות ציטומטריה של זרימה. לאחר מכן, סובבו את שאר הלימפוציטים במ centri-fuge ושחזרו את המשקע ב-60 microliters של max buffer לכל 1×10⁷ תאים.בשלב הבא, חסמו את התאים ב-20 µL של FC blocking reagent לכל 1×10⁷ תאים, ולאחר מכן הוסיפו 10 µL של ZI conjugated anti-human V delta one antibody לכל 1×10⁷ תאים למשך 12 דקות ב-4 °C בחשיכה. בסיום האינקובציה, שטפו את התאים ב-14 mL של max buffer. השעיו את המשקע ב-80 µL של max buffer לכל 1×10⁷ תאים, והוסיפו 20 µL של anti FTSE microbeads לכל 1×10⁷ תאים עם ערבוב, למשך 15 דקות בחשיכה ב-4 °C.שטוף את התאים ב-10 milliliters של max buffer טרי במהלך הסנטריפוגציה. שווה עמודה מגנטית שקוללה מראש עם 500 microliters של max buffer. לאחר מכן, השהה מחדש את התאים ב-500 microliters של max buffer והוסף אותם בזהירות לחלק העליון של העמודה.שטפו את העמודה באמצעות שלושה שטיפות של 500 µL של max buffer. לאחר מכן, הוציאו את העמודה מהמגנט והשתמשו בבוכנה כדי לשטוף במהירות את תאי ה-V delta 1 החיוביים עם 1 mL של max buffer לתוך מבחנה קונית של 15 mL. לאחר העברת התאים דרך עמודה שנייה, ערבבו ב-vortex כ-25 µL של CD four beads למשך 30 שניות.לאחר מכן, העבירו את החרו지를 למבחנת תגובה של 1.5 milliliter המכילה one milliliter של max buffer והניחו את המבחנה על מגנט. לאחר דקה אחת, השתמשו בפיפט של 200 microliter כדי לשאוב בזהירות את supernatant ותלו את החרוזים ב-25 microliters של max buffer. לאחר מכן, סבבו (spin down) את תאי ה-v delta one positive המבודדים ותלו את המשקע (pellet) ב-500 microliters של max buffer.ערבבו את התאים בעוצמה עם החרוזיים. לאחר 20 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס תוך נטייה מתמדת, הניחו את המבחנה בחזרה על המגנט. כדי למנוע איבוד של נפח מהדגימה ולמזער את נוכחותם של תאים מזוהמים שליליים ל-CD four, חיוני להעביר באמצעות פיפט את שארית הבופר מהחלק הפנימי של המכסה בחזרה אל הבקבוקון.לאחר שתי דקות, השתמשו בפיפט של 200 µL כדי להעביר את העלייה (supernatant) המכילה תאי CD4 negative Vδ1 positive למבחנה נקייה. לאחר מכן, הוציאו את תאי ה-CD4 positive מהמגנט ותלו אותם מחדש ב-500 µL של max buffer, לאחר הסרה של תאי ה-CD4 negative פעמיים נוספות כפי שהודגם זה עתה. דגרו את תאי ה-CD4 positive ב-100 µL של תוצר תרבית ו-10 µL של תמיסה לניתוק חרוזים (bead detaching solution) בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות תוך הטיה מתמדת. בסיום הדגירה, החזירו את התאים למגנט למשך דקה אחת והשתמשו בפיפט של 200 µL כדי להעביר את התאים ללא החרוזים.העבירו את העליון המכיל תאי V delta one positive CD four positive למבחנה חדשה לאחר הסרת כל החרוזים שנותרו. בצעו את הפעולה פעמיים נוספות כפי שהודגם זה עתה, סובבו את התאים במצנטריפוגה ולאחר מכן השעיו מחדש את תאי ה-V delta one positive CD four positive במצע טרי שחומם מראש לצורך ספירה לתא בודד. בצעו שיבוט של התאים באמצעות דילול מוגבל, ובודדו PBMC מתורם אחר כפי שהודגם זה עתה.לאחר מכן, הקרינו בבדיקת גמא 2.5 times 10 של השביעי מתוך תאי PBMC אלוגנואיים אלו ב-80 grays ב-25 milliliters של מצע תרבית. לאחר מכן, הוסיפו IL two, IL seven ו-PHA לתאי המזין (feeder cells) שהוקרנו, וזריעו 5 times 10 to the fourth תאים ל-50 microliters של מצע לכל באר בלוחות 96. Well U form. דללו את תאי ה-V delta one positive CD four positive המבודדים לריכוז של 0.3 תאים ל-50 microliters, וחלקו 50 microliters של תאים לכל באר המכילה תאי מזין וציטוקינים.לאחר מכן, מקמינו את הצלחות באטמוספירה לחה של 37 degrees Celsius ו-5%CO2, והחליפו מחצית מהמדיום בכל באר של תרביות השיתוף (co cultures) ב-50 microliters של ציטוקינים ומדיום טריים מדי שלושה עד ארבעה ימים. השבטים הראשונים יהיו נראים תוך שלושה עד ארבעה שבועות, כאשר צבע מדיום התרבית ישתנה ככל שהתאים יעברו מטבוליזם וייצרו מושבות; כאן מוצגת התפלגות טיפוסית של תאי v delta one חיוביים בדגימה של לימפוציטים מדם פריפריאלי CD three חיוביים בתורם עבור תורם זה. השכיחות של תאי v delta one חיוביים היא 2.3% מסך מספר הלימפוציטים, כאשר 2.6% מהם הם CD four חיוביים, ואוכלוסיית המטרה לבידוד מהווה 0.06% מסך הלימפוציטים.חשוב לציין, כפי שניתן לראות בתרשים נקודות (dot plot) זה מניסוי בידוד טיפוסי, ששום תאי alpha beta T לא נשארים במאגר תאי ה-T המועשר לאחר שלב הבידוד החיובי הראשון להעשרת תאים חיוביים ל-V delta one. כאן, הפנוטיפ הטיפוסי של שיבוט CD three positive CD four positive מתהווה המבטא רצפטור של תאי T המורכב משרשראות V delta one ו-V gamma nine, מוצג בתרשימי צפיפות אלה של שיבוט בודד שבודד באמצעות טכניקה זו. תהליך הדיפרנציאציה השונה (trans differentiation), במהלכו רמת הביטוי של שרשראת V delta one יורדת ורמת הביטוי של רצפטור alpha beta T-cell עולה, מוצג כאן; תהליך זה מוביל לפנוטיפ זמני של רצפטור תאי T כפול-חיובי עבור השיבוט.חלק מהשבטים עשויים להפגין גם פנוטיפ כפול חיובי, CD4 positive ו-CD8 positive. לאחר רכישת מיומנות, ניתן להשלים טכניקה זו תוך חמש שעות אם היא מבוצעת כהלכה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לעבוד במהירות ללא הפסקות ולהשתמש בריאגנטים סטריליים, בתמיסרי באפר קרים ובערכות בידוד שלא פג תוקפן, בהתאם להנחיות פרוצדורה זו.ניתן להתמקד בסוגי תאים נדירים אחרים, כגון תאי גזע או תתי-סוגים של תאי T, NK או INKT. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום האימונולוגיה לחקור את הטריגרים והמניעים המולקולריים של מסלול הפיתוח החוץ-תימוסי של תא progenitor של T-cell alphabet אנושי שזוהה לאחרונה. במערכות מודל in vitro, אמורה להיות לכם כעת הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבודד ישויות של תאים נדירים ממקורות תאים אנושיים כגון מח עצם, חבל טבילה ודם פריפריאלי, או נוזל סינוביאלי, באופן מהיר וכמותי, תוך שמירה על תפקוד התאים וסטריליותם.

isolation-ex-vivo-culture-v1-cd4-t-cells-an-extrathymic-t-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

פרוטוקול מהיר, פשוט וחסכוני עבור הדור של התורם הנגזרות multivirus ספציפי ההרג (rCTL) עבור עירוי כדי allogeneic hematopoietic בתאי גזע להשתלה (HSCT) מקבלי בסיכון לפתח זיהומים CMV, עו"ד או EBV. תהליך הייצור GMP תואמי וצריך להבטיח את יישום רחב יותר של חיסוני T-cell מעבר במרכזים מיוחדים.

דור Multivirus ספציפיים תאים T כדי למנוע / לטפל זיהומים נגיפיים לאחר השתלת allogeneic תא גזע hematopoietic

סרטון זה מדגים פרוטוקול לבידוד מבוסס תיוג מגנטי של אוכלוסייה בריכוז נמוך של תאי T CD4+Vδ1+γδ מתאי דם חד-גרעיניים היקפיים אנושיים (PBMCs). באמצעות שילוב של נוגדנים מצומדים נגד Vδ1 FITC, מיקרו-חרוזים מגנטיים נגד FITC וחרוזים על-פאראמגנטיים מצופים נוגדנים נגד CD4, תאי T CD4+Vδ1+ יכולים להיות מטוהרים בהצלחה מאוכלוסיית PBMC.

בידוד סלקטיבי של תאי T CD4+ Vδ1+ γδ מתאי דם מונוגרעיניים היקפיים אנושיים

סרטון זה מדגים את היצירה והבידוד של מיקרו-חלקיקים שמקורם בלימפוציטים מסוג T, LMPs, מלימפוציטים מסוג T לאחר טיפול באקטינומיצין-D.

בידוד מיקרו-חלקיקים שמקורם בלימפוציטים אפופטוטיים מסוג T במבחנה

CD4+ תאי T רגולטוריים הם מווסתת חיסונית רבת עוצמה וממלאים תפקידים חשובים בהומאוסטזיס של מערכת החיסון. המחסור בתאים אלה בדם היקפי הופך את המחקרים הפונקציונליים למאתגרים, במיוחד בהקשר של זיהום HIV-1. אנו מתארים כאן שיטה לבידוד והרחבה של CD4+ Tregs פונקציונליים מדם היקפי מאנשים נגועים ב-HIV-1.

כלים חדשים כדי להרחיב תאי T רגולטוריים מאנשים HIV-1 נגוע-

ניתן להתמיין בתאי גזע עובריים של עכבר לתאי T במבחנה באמצעות מערכת התרבות המשותפת OP9-DL1. הצלחה בהליך זה דורשת תשומת לב קפדנית לתחזוקת ריאגנט/תאים, ושלבים רגישים לטכניקה מרכזית. כאן אנו דנים בפרמטרים קריטיים אלה ומספקים פרוטוקול מפורט לעידוד אימוץ טכנולוגיה זו.

גזירה של תאי T במבחנה מתאי עכבר גזע העובריים

תאי T נאיביים CD4+ מקוטבים לתת-קבוצות שונות בהתאם לסביבה בזמן ההפעלה.  ניתן להשיג את ההתמיינות של תאי CD4+ T נאיביים לתת-קבוצות אפקטורים שונות במבחנה באמצעות הוספת גירויים של קולטני תאי T ואותות ציטוקינים ספציפיים.

העכבר נאיבי CD4<sup&gt; +</supו&gt; בידוד תא T<em&gt; במבחנה</em&gt; בידול לתוך תת תא T

מאמר זה מתאר מתודולוגיה in vivo ו-in vitro לאפיון אבות התיישבות תימית על ידי ניתוח הקינטיקה של הדור, הפנוטיפ והמספרים של צאצאי תאי ה-T שלהם.

אפיון של הרתי יישוב אבות בעובר העכבר באמצעות<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; מבחני

המשלב בפרוטוקול הנוכחי לתא בודד לזווג אדם TCR אלפא, ביתא שרשרת רצף עם אווירודינמית דור תואם במבחנה ויוו TCR והביטוי retroviral וקטורים.

יעיל בידוד TCR תא בודד, דור של וקטורים Retroviral עבור במבחנה In Vivo הביטוי של האדם TCRs

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לגרום סובלנות ב השתלת ולאחר להעריך חוץ גופית בתוך ויוו הקיבולת המדכא של תאים נפרדים קבוצות משנה של המטופל, את מצב המערכת החיסונית של המטופל כלפי התורם או אנטיגנים אקסוגני.

במבחנה In Vivo למזהמים סביבתיים T, B והתאים מיאלואידית פעילות מדכא ומענים ההורמונאלית מן המקבלים

מאמר זה מתאר את השיטה הרומן לייצר אנטיגן הגידול-ספציפי המושרה ביותר תאים גזע מהגרים הרתי (iTE) על ידי תלת מימדי (3D) מערכת התרבות הרתי. iTE הינם תת-קבוצה הומוגנית של תאי T הקשורים היטב לתאי T תמימים עם יכולת התפשטות, היווצרות הזיכרון ודיכוי הגידול.

תלת מימדי הרתי תרבות מערכת לייצר Murine המושרה תא גזע Pluripotent-הגידול הנגזר אנטיגן-מהגרים ספציפיים הרתי

פרוטוקול זה מתאר בידוד של תימוציטים שליליים כפולים מתימוס העכבר ולאחר מכן התמרה רטרו-ויראלית ותרבית משותפת על מערכת תרבית משותפת של קו תאי סטרומה דמוי מח עצם דמוי דלתא (OP9-DL4) לניתוח פונקציונלי נוסף.

תרבית משותפת והתמרה של תימוציטים מורינים על תאי סטרומה דמויי דלתא המבטאים 4 כדי לחקור אונקוגנים בלוקמיה של תאי T

למד לבודד ולשכפל תאי T מסוג Vδ1+ CD4+ מדם אנושי בתרבית ex vivo. שיטה זו מאפשרת בידוד מהיר ויעיל של אוכלוסייה נדירה תוך שמירה על תפקודיות וחיוניות התאים.

ובידוד

גלה סרטונים נוספים