סינתזה של Thermogelling midi (N-isopropylacrylamide) מרוכבים -graft-כונדרואיטין סולפט עם אלגינט microparticles עבור הנדסת רקמות

המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא להעריך הן את תכונות ההדבקה והן את התאימות הביולוגית התאית של מרוכב ההידרוג'ל המוצע להנדסת רקמות דיסק בין-חולייתי של הגרעין המוכן. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנדסת הרקמות, כמו כיצד לתכנן ולהכין הידרוג'לים הפיכים תרמיים בעלי תכונות דבק ביולוגי לאנקפסולציה של תאים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנו מסוגלים להדגים מחקרים במבחנה עם קומפוזיט הניתן להזרקה ורגיש תרמית כדי להעריך את השימוש בו כתחליף פוטנציאלי לגרעין העיסה.

במחקר הנוכחי אנו מעריכים פיגום הידרוג'ל חדש על ידי ביצוע בדיקות מכניות מתיחה ומבחני כדאיות תאית. מי שידגים את מבחני התאימות הביולוגית יהיו אמילי שמידט, מארק דיטמר, אדוארד גולדשמידט ופרנצסקה גיגיניס, סטודנטים מהמחלקות למדעי הביולוגיה והביוכימיה. לפני הסינתזה של ההידרוג'ל הביו-דביק, יש לטהר את המונומר NIPAAm ואת ה-mCS, כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

לאחר מכן, יש להמיס 10 גרם NIPAAm מטוהר ו-2.209 גרם mCS ב-232 מיליליטר של מים נטולי יונים. נקה את תמיסת החמצן באמצעות גז חנקן אינרטי. שמור על קצב זרימת גז נמרץ אך נמוך, כדי למנוע מהתמיסה לבעבע למשך 15 דקות.

המשך לטהר את התמיסה בגז חנקן והוסף 0.976 מיליליטר TEMED. לאחר מכן, התחל את תגובת הפילמור על ידי ערבוב של 97.6 מיליגרם אמוניום פרסולפט. מערבבים את התמיסה למשך כ-20 שניות, ואטומים במהירות את התמיסה כדי למנוע כניסת אוויר לכלי.

אפשר לתמיסה להתפלמר באור פלורסנט למשך 24 שעות לפני עיבוד הדגימה לאבקה דקה, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. צור תערובת שמן ומים על ידי שילוב של 100 מיליליטר שמן קנולה, מיליליטר אחד TWEEN 20 ו-20 מיליליטר של 2% אלגינט. מתחלב את התערובת למשך 10 דקות עם הומוגנייזר ב -15, 000 סל"ד.

בנוסף, ערבבו עם מוט ערבוב מגנטי ב-200 סל"ד ליצירת מיקרו-חלקיקים גדולים, או 2,000 סל"ד ליצירת מיקרו-חלקיקים קטנים. שאפו את תמיסת הסידן הכלורי 2% באמצעות מזרק עם קצה מחט בגודל 18. הוסיפו לאט את הסידן הכלורי לתוך האמולסיה.

לאחר שאפשרו למיקרו-חלקיקים לקשר צולב למשך 10 דקות, חלקו באופן שווה את קבוצת המיקרו-חלקיקים לצינורות חרוטיים מכוסים של 50 מיליליטר. צנטריפוגה ב-1, 400 פעמים G למשך שתי דקות כדי להסיר את השכבה הראשונית של שמן קנולה לפני שטיפה וליופיליזציה של המיקרו-חלקיקים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. השתמש באבקת הפולימר המיובשת בהקפאה המתקבלת כדי ליצור תמיסת שתל CS בנפח 5% על ידי המסה ראשונה של 50 מיליגרם של אבקת הידרוג'ל במיליליטר אחד של מי מלח חוצץ פוספט 1X, או PBS.

מערבבים את התמיסה בעזרת מערבולת לפני שמצננים במקרר בחום של ארבע מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. לאחר שנוצרת התמיסה הצמיגה, צור קומפוזיט הומוגני על ידי הוספת 25 או 50 מיליגרם של מיקרו-חלקיקי אלגינט מיובשים בהקפאה לתמיסת ההידרוג'ל והמערבולת. אחסן את הקומפוזיט במקרר בארבע מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר.

לפני ביצוע בדיקות מתיחה, יש לחלץ מצע סחוס מאוזן חזירית, כמפורט בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, חבר את מד הכוח לזרוע עמדת הבדיקה. הנח פלטה חמה על גבי מעמד הכוח, והגדר את הטמפרטורה ל-50 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, הדביקו חתיכת סחוס של סנטימטר על סנטימטר אחד לגוש הנירוסטה עם דבק ציאנואקרילט וזוג פינצטה. הדביקו חתיכת סחוס נוספת לגליל דלרין, והצמידו את הגליל למד הכוח. חשוב מאוד ששני משטחי הסחוס יפנו זה לזה ויצרו קשר עם ההידרוג'ל.

הנח את אמבט הפרספקס על גבי משטח החימום, והכנס את גוש הנירוסטה עם מצע הסחוס בתוך האמבטיה. הורד את זרוע עמדת הבדיקה, ויישר את שני מצעי הסחוס זה עם זה. לאחר מכן, הרם את הזרוע, והשאיר מספיק מקום למרוח את ההידרוג'ל.

עם פיפטה תזוזה חיובית, הוציא 200 מיקרוליטר של ההידרוג'ל הביולוגי לחתיכת הסחוס התחתונה. הורד את זרוע הכוח לעמוד על מיליליטר לדקה עד שההידרוג'ל יוצר קשר עם חתיכת הסחוס העליונה, ומפעיל כוח טעינה מראש של 0.001 ניוטון. יוצקים את תמיסת המלח של 37 מעלות צלזיוס לאמבטיה עד שהנפח מגיע למפלס המים המיועד.

בדוק את טמפרטורת התמיסה בעזרת צמד תרמי. לאחר שאפשרת להידרוג'ל להתייצב למשך חמש דקות בסך הכל, הרם את הזרוע במהירות של שני מילימטרים לדקה. הבדיקה מסתיימת לאחר שהדבק הביולוגי מתנתק ממצע הסחוס, או כאשר מתרחשת ירידה משמעותית בכוח, מה שמאותת על כישלון.

אסוף את הנתונים המוקלטים והרם את זרוע עמדת הבדיקה. הסר את גליל Delrin ממד הכוח. שופכים את תמיסת המלח למיכל הקודם שלה, ומחממים מחדש ל -37 מעלות צלזיוס.

חשב את הלחצים, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לפני ביצוע בדיקת חי/מת עם השתלת PNIPAAm CS, הכן כליה עוברית אנושית, או תאי HEK 293, כמפורט בפרוטוקול הטקסט. צור חד-שכבות בקרה חיובית על ידי פיפטינג של נפחים מרובים של 300 מיקרוליטר של תערובת התאים לצלחת של 24 בארות כדי ליצור ארבע עד שש דגימות משוכפלות.

שמור על אותו ריכוז תאים על ידי השעיה מחדש של התאים בכשני מיליליטר של שתל PNIPAAm CS עבור כל דגימת שכפול. פיפטה את תערובת תאי הפולימר למעלה ולמטה באמצעות פיפטה סרולוגית עד לקבלת תערובת אחידה. אם זורעים עם מיקרו-חלקיקי אלגינט, העבירו שני מיליליטר של תרחיף תאי CS של PNIPAAm לתבנית תרבית של 35 מילימטר, והכניסו 200 מיליגרם חלקיקים לתערובת.

פיפטה את תערובת התאים למעלה ולמטה בעזרת פיפטה סרולוגית עד לקבלת תערובת אחידה. לאחר מכן, בעזרת פיפטה סרולוגית, הוציא נפחים מרובים של 300 מיקרוליטר של תערובת תאי הפולימר לכל אחת מהבארות לצורך הדברת הרוג, השתלת PNIPAAm CS והשתלת PNIPAAm CS עם מיקרו-חלקיקי אלגינט כדי ליצור ארבע עד שש דגימות שכפול. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 עד 15 דקות, ואפשרו לשתל PNIPAAm CS לעבור מנוזל לג'ל.

הפולימר יוצר דיסק לבן אטום. מקם מחמם שקופיות במכסה המנוע, והגדר את הטמפרטורה ל -37 מעלות צלזיוס. השתמש במחמם השקופיות כדי לשמור על טמפרטורת הצלחת היטב, ופיפטה 600 מיקרוליטר של מדיה מחוממת מראש לכל באר.

כדי למנוע עוד יותר את מעבר הפולימר למצב נוזלי, מקם מנורה עם נורת פלורסנט מעל הכלי כדי לחמם את האוויר שמעליו. דגרו על התאים במשך חמישה ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. לאחר שחלפו חמישה ימים, הסר את המדיה מבארות החד-שכבה, שתל PNIPAAm CS ו-PNIPAAm השתל CS עם מיקרו-חלקיקי אלגינט.

שטפו את כל הבארות ביסודיות, אך בעדינות, עם PBS, ולאחר מכן הסירו את ה-PBS. אפשר לדיסקיות ההידרוג'ל המכילות מיקרו-חלקיקי אלגינט להתנזל בטמפרטורת החדר, והוסף שני מיליליטר של 50 מילי-מולרי נתרן ציטראט לכל אחת מהבארות. להוציא את אמצעי התקשורת מבארות התאים שנהרגו.

הניחו לדיסקיות ההידרוג'ל להתנזל בטמפרטורת החדר, והוסיפו 300 מיקרוליטר של 70% מתנול לכל באר לפני הדגירה של הצלחת למשך 45 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הסר את תמיסות הנתרן ציטראט והמתנול מהבארות, ופיפטה כל אחד מתרחפי ההידרוג'ל לצינורות מיקרו-צנטריפוגה בודדים. צנטריפוגה את הצינורות ב -2, 000 פעמים G למשך 10 דקות כדי להפריד את התאים מתרחיף ההידרוג'ל.

הסר בזהירות את המתלה על ידי פיפטינג התמיסה מהצינור החרוטי והשארת כדור התא מאחור. השעו מחדש את הגלולה ב -300 מיקרוליטר PBS, והעבירו לצלחת הבאר המקורית. לאחר מכן, הוסף 300 מיקרוליטר מתערובת הצבע חי/מת לכל אחת מהבארות.

עטפו את צלחת הבאר בנייר אלומיניום, ודגרו במשך 45 דקות על נדנדה בטמפרטורת החדר לפני הדמיית כל הדגימות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך עם מטרה פי 10. תוצאות חוזק מתיחה מייצגות הן עבור PNIPAAm שתל CS והן עבור PNIPAAm שתל CS עם ניסוחים משתנים של מיקרו-חלקיקי אלגינט מוצגות כאן. חוזק המתיחה של PNIPAAm שתל CS הוכפל פי ארבעה עם תוספת של 50 או 75 מיליגרם למיליליטר של מיקרו-חלקיקי אלגינט.

כצפוי, שתל PNIPAAm CS מתכווץ ומתכווץ בנפח מעל טמפרטורת התמיסה הקריטית הנמוכה שלו. הכנסת מיקרו-חלקיקים בתוך ההידרוג'ל מעניקה אפקט נפיחות לאורך תקופה של שבעה ימים ב-PBS. תאי HEK 293 עטופים הן ב-PNIPAAm שתל CS והן ב-PNIPAAm השתל CS עם מיקרו-חלקיקי אלגינט הראו פלואורסצנטיות תאית פעילה באמצעות צבע חי/מת לאחר תקופה של חמישה ימים.

ניתן להשוות תוצאות אלה לבארות הבקרה החיוביות והשליליות. במקביל, נעשה שימוש בבדיקה כמותית כדי לאשר את ההדמיה החיה/מתה, שלא הראתה הבדלים משמעותיים בכדאיות התאית בין שתל PNIPAAm CS, שתל PNIPAAm CS עם מיקרו-חלקיקי אלגינט ושכבת הבקרה. נוצר קומפוזיט הידרוג'ל המורכב מפולי (N-isopropylacrylamide) רגיש תרמית המושתל במיקרו-חלקיקי כונדרויטין סולפט ואלגינט להחלפת גרעין עיסה.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שהקומפוזיט רגיש לטמפרטורה, ויתנזל מתחת לטמפרטורת התמיסה הקריטית הנמוכה שלו. לאחר השליטה, ניתן לבצע בדיקות מכניות מתיחה בקלות כל עוד מתרגלים דיוק זהיר. מחקרי נפיחות חושפים את יכולתו של הידרוג'ל לאגור מים.

עם זאת, בדיקות אלה חייבות לחקות את סביבת ה-in-vivo המקורית. ניתן לאשר ולהעריך את הכדאיות התאית של הג'לים הרגישים תרמית על ידי שילוב של ריאגנטים לסימון פלואורסצנטי וריאגנטים המייצרים מטבוליים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד מיושמים הזרקות רגישות תרמית בדיסקים בין חולייתיים, הנדסת רקמות וכיצד חומרים מרוכבים עשויים לשפר תכונות חומר מסוימות.