זמן לשגות הדמיה הקרינה של השלם S. venezuelae מחזור החיים באמצעות מכשיר microfluidic

המטרה הכוללת של פרוטוקול מיקרוסקופיה פלורסנט זה היא לספק שיטה לחקר תהליכי תאים ביולוגיים העומדים בבסיס ההתפתחות וההתמיינות התאית בחיידק החוטים הנבגים, Streptomyces venezuelae. שיטת התיאור מספקת פלטפורמה מצוינת לחקר תהליכים ביולוגיים בתא שהם מרכזיים במחזור החיים של Streptomyces, כולל לוקליזציה דינמית של חלבון, גידול מקוטב וספיגת נבגים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא ש- Streptomyces venezuelae נבגים בנוזל, מה שמאפשר לנו לגדל את התאים במכשיר מיקרופלואידי, ולפקח מיקרוסקופית על מחזור החיים המלא.

שיטה זו מדגימה את הפוטנציאל העצום של Streptomyces venezuelae כמערכת התפתחותית חדשה לסוג, מכיוון שהיא מאפשרת הדמיה של תאים חיים של התמיינות של תפטיר רב-מרכזי לשרשראות של נבגים. בתור התחלה, יש לחסן 30 מיליליטר של מדיום גידול נוסף עם 10 מיקרוליטר של נבגים מזן S.venezuela להדמיה. לצמיחה עקבית ונבגים של התאים, השתמש בבקבוק מבולבל או בבקבוק המכיל קפיץ כדי לאפשר אוורור מספיק.

תרבית התאים במשך 35 עד 40 שעות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס ו -250 סל"ד. כשתהיה מוכן, אתה אמור להיות מסוגל לראות את שברי התפטיר והנבגים באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה המותקן בנוזל. צנטריפוגה של מיליליטר אחד של התרבית בצנטריפוגה שולחנית ב-400 פעמים G למשך דקה אחת כדי לגלול את התפטיר ואת שברי התאים הגדולים יותר.

לאחר מכן העבירו כ-300 מיקרוליטר של הסופרנטנט המכיל תרחיף של נבגים, לצינור חדש של 1.5 מילימטר והניחו את הצינור על קרח. שמור את אמצעי התרבות הנותר לשימוש בשלב מאוחר יותר. לאחר מכן, יש לדלל את הנבגים מ-1 עד 20 במדיום גידול נוסף, ולשמור את הנבגים המדוללים על קרח עד שהם נחוצים.

יוצקים את מדיום התרבות הנותר בכוס של 50 מיליליטר ואז שואבים 10 מיליליטר בעזרת מזרק ומשתמשים בפילטר מזרק סטרילי של 22 מיקרומטר כדי לסנן לעקר את מדיום התרבות שנותר. כדי להשיג מדיום גידול משלים משומש נקי מנבגים ושברי תפטיר. שמור את מצע הגידול המשולם המסונן למשך מספר ימים בארבע מעלות צלזיוס אם יש לערוך ניסויים נוספים, תוך שימוש בתנאי גידול דומים.

ניתן להשתמש בכל צלחת מיקרופלואידית לעד ארבעה ניסויים עצמאיים. כדי להימנע מזיהום תאי הזרימה שאינם בשימוש, הקפד להשתמש בתמיסות סטריליות ובתנאי עבודה בעת הגדרת הניסוי. התחל בהסרת תמיסת המשלוח מהצלחת המיקרופלואידית.

לאחר מכן שוטפים את הבארות במדיום גידול סטרילי בתוסף. לאחר השטיפה, הוסף 300 מיקרוליטר ממצע הגידול המשלים לכניסה של באר אחת, ו-300 מיקרוליטר ממצע הגידול המשלים המושקע לבארות שתיים עד שש. לאחר מכן, טען 40 מיקרוליטר מהנבגים המדוללים לבאר שמונה של נתיב A ואטום את הסעפת לצלחת בהתאם להוראות היצרן.

הפעל את תוכנת הבקרה של המיקרופלואידיק, ובחר את סוג הצלחת המתאים. הגדר תוכנית זרימה להזרמת מדיום מבארות כניסה אחת עד חמש בשש psi למשך שתי דקות לכל באר על מנת להניע את ערוץ הזרימה ואת תא התרבית. לאחר מכן יש לו להזרים מדיום גידול משלים בשישה psi לבאר כניסה אחת למשך שש שעות.

זה יאפשר נביטה וצמיחה וגטטיבית. יש לעבור את התוכנית לאחר שש שעות למצע הגידול המשולם המושקע ולהזרים אותו לבארות שתיים עד חמש בשישה psi למשך שארית הניסוי. מחממים מראש את החדר הסביבתי ל -30 מעלות צלזיוס מראש.

לאחר מכן הפעל את המיקרוסקופ ואת תוכנת בקרת המיקרוסקופ. שים יעד טבילה בשמן עם צמצם מספרי גבוה ואשר כי המסננים המתאימים והמראות הדיאגרמטיות המוגדרים לרכישת תמונות ניגודיות של הפרעות דיפרנציאליות, יחד עם התמונות של היתוך החלבון הפלואורסצנטי הצהוב והאדום נמצאים במקום. הנח טיפה של שמן טבילה לתוך המטרה ולתחתית חלון ההדמיה גם על הצלחת המיקרופלואידית.

התקן בזהירות את המכשיר המיקרופלואידי האטום על הבמה של המיקרוסקופ ההפוך ואבטח אותו למקומו. השתמש בסמני המיקום המוטבעים כדי להביא את חלון ההדמיה של תא התרבית המיקרופלואידית למיקוד. התמקדו בחלק השמאלי ביותר של תא הזרימה הראשון המסומן A, ולאחר מכן הזיזו את השלב למלכודת בגודל חמש, המתאים לגובה המלכודת של 7 מיקרומטר.

בתוכנה המיקרופלואידית, הגדר את המערכת לטעון תאים מבאר הכניסה שמונה בארבע psi למשך 15 שניות. לאחר הפעלת התהליך, בדוק את צפיפות התאים בתא התרבית על ידי הזזת השלב על פני חלון ההדמיה. אם לא נלכדו נבגים, חזור על שלב טעינת התאים או לחילופין, הגדל את לחץ הטעינה ו/או הזמן עד להשגת צפיפות התא הרצויה של 1 עד 10 נבגים לכל חלון הדמיה.

הקפד להימנע מעומס יתר על תא התרבית. לאחר מכן, התחל את תוכנית הזרימה שהוכנה קודם לכן בתוכנת הבקרה ואפשר לצלחת המיקרופלואידית להתייצב בחום למשך שעה אחת בשלב המיקרוסקופ לפני תחילת רכישת התמונה. בתוכנת בקרת המיקרוסקופ, הגדר רכישה רב מימדית כדי לצלם תמונות מרובות במיקומי שלבים מרובים לאורך זמן על ידי ציון תחילה של ספרייה לשמירה אוטומטית של קבצי התמונה.

לאחר מכן, עבור להגדרות התאורה והזן הגדרות תאורה אופטימליות שנקבעו מראש עבור כל מבנה ספציפי. לאחר מכן הגדר סדרת זמן לרכישת תמונות כל 40 דקות למשך 24 שעות. על מנת לקבוע את מיקומי הבמה ולהגדיר את המיקוד האוטומטי, סרוק את תא התרבות ואחסן את מיקומי הבמה עבור כל עמדת הדמיה מעניינת.

ודא שהמיקומים החד-שלביים ממוקמים רחוק מספיק זה מזה כדי למזער הלבנת תמונות ורעילות צילום. לאחר אימות קואורדינטות ה-Z של עמדות הבמה שנבחרו, הפעל את המיקוד האוטומטי של החומרה. לאחר מכן התחל את ניסוי ה-time-lapse בתוכנת בקרת המיקרוסקופ.

עצור את רכישת התמונה לאחר 24 עד 30 שעות, או כאשר הקורים באזור העניין התמיינו לנבגים. לאחר מכן עצור את תוכנית הזרימה בתוכנה ופרק את המכשיר המיקרופלואידי. הכן את הצלחת המיקרופלואידית המשומשת לאחסון לטווח קצר על ידי הוצאת כל המדיום שנותר מבארות הכניסה, באר הפסולת וטעינת התא היטב.

לאחר מכן מלאו את הבארות המשומשות של נתיב A ובארות של הנתיבים שאינם בשימוש ב-PBS סטרילי. לבסוף, אטמו את הצלחת בניילון אגס כדי למנוע את התייבשותה. ואחסן את הצלחת בארבע מעלות צלזיוס.

הדמיית תאים חיים מוצלחת של כל מחזור החיים של S.venezuela מניבה סדרות זמן רציפות, כולל שלבי ההתפתחות העיקריים של נביטה, צמיחה וגטטיבית ונבגים. במהלך הנביטה או הצמיחה הווגטטיבית, DivIVA-mCherry מצטבר אך ורק בקצות ההיפנלים הגדלים או מסמן נקודות הסתעפות היפאליות שנוצרו לאחרונה. לעומת זאת, FtsZ-YPet יוצר מבנים דמויי טבעת בודדת במרווחים לא סדירים בתפטיר הגדל.

מבנים אלה מספקים את הפיגום לסינתזה של קירות צולבים צמחיים לא קונסטרוקטיביים המובילים להיווצרות תאי היפאלים מחוברים זה לזה. בקורות נבגים, דפוס הלוקליזציה של FtsZ-YPet משתנה באופן דרמטי. תחילה, חוטי FtsZ-YPet סליליים נופלים לאורך הקורים, ואז באירוע פתאומי, כמעט סינכרוני, סלילי אלה מתלכדים לסולם של טבעות FtsZ-YPet המרווחות באופן קבוע.

לבסוף, ניתן להבחין במחיצת הנבגים בתמונות ניגודיות ההפרעות הדיפרנציאליות ובסופו של דבר, הנבגים החדשים משתחררים. טכניקה זו מספקת פרוטוקול חזק לביצוע הדמיית תאים חיים של מחזור החיים המלא של Streptomyces. המערכת המיקרופלואידית קלה לשימוש.

הוא מציע גמישות ניסויית והוא מאפשר ניטור ארוך טווח של מערך ניסיוני זה מציע גם נקודת התחלה מצוינת לחקור אירועים התפתחותיים ספציפיים בתגובה לתנאים תרבותיים משתנים או שימוש בצבעי פלורסנט לניטור סינתזת פפטידוגליקן או להמחשת ארגון הכרומוזומים.