Name: זמן לשגות הדמיה הקרינה של השלם S. venezuelae מחזור החיים באמצעות מכשיר microfluidic (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: למד מיקרוסקופיית פלואורסצנציה בזמן אמת לחקירת מחזור החיים של Streptomyces venezuelae באמצעות מכשיר microfluidic. שיטה זו מאפשרת תצפית ישירה על התמיינות תאים ותהליכי ספורולציה בחיידקים פילמנטיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לגרנט קלדר על הסיוע הטכני עם המיקרוסקופ, למאט בוש על הערותיו על הפרוטוקול, ולמרכז ג'ון אינס על רכישת מיקרוסקופ השדה הרחב של צייס. עבודה זו מומנה על ידי מענק BBSRC BB/I002197/1 (ל-M.J.B), על ידי מענק התוכנית האסטרטגית של מכון BBSRC BB/J004561/1 למרכז ג'ון אינס, על ידי מענק מועצת המחקר השוודית 621-2010-4463 (ל-K.F.), ועל ידי מלגת פוסט-דוקטורט של לאופולדינה (ל-S.S).

1. ניתוק של טרי S. נבגי venezuelae ואת הכנת בינוני תרבות שהות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 30 מ&quot;ל מלטוז-שמרים-מאלט חלץ חלץ (MYM) בינוני, בתוספת 60 μl פתרון אלמנט עקבות R2 (TE), עם 10 נבגים μl של SV60 זן [pSS209 :: BT1 φ attB (divIVA P - divIVA-mCherry P ftsZ -ftsZ-ypet)]. לצמיחה עקבית נביגה של התאים, להשתמש בבקבוק מבולבל או בקבוקון המכיל באביב כדי לאפשר אוורור מספיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות תאים עבור 35-40 שעות ב 30 מעלות צלזיוס, 250 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את התאים על ידי מיקרוסקופיה נוזלי רכוב שלב ניגודיות. בשלב זה שברים ונבגי mycelial יהיו גלויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 1 מ&quot;ל תאים בצנטריפוגה בטבלה העליונה ב 400 XG דקות 1 עד גלולה תפטיר ושברי תאים גדולים יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר כ 300 שיתוף supernatant μlntaining השעיה של נבגים לצינור 1.5 מיליליטר חדש ולשמור על קרח. שמור את מדיום התרבות הנותרת עבור צעד 1.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל נבגים 01:20 ב MYM-TE (ריכוז סופי: 0.5-5 x 10 7 נבגים / מ&quot;ל) ולשמור על הקרח עד הצורך (ראה שלב 2.3). הערה: למרות התנאים המדויקים המפעילים נביגה ב Streptomyces אינם מובנים, באמצעות מדיום MYM-TE בילו, לרבות כל אותות תאיים ידועים מתרבה sporulating, מגרה נביגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסנן לעקר 10 מ&quot;ל של מדיום תרבות הנותרים כדי להשיג בילה MYM-TE כי הוא חופשי של נבגים ושברי mycelial. שימוש במסנן 0.22 מיקרומטר מזרק סטרילי ולהעביר בילה MYM-TE לצינור 15 מ&quot;ל סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את מוכן בילה MYM-TE במשך כמה ימים על 4 מעלות צלזיוס אם ניסויים נוספים באמצעות תנאי הגידול דומים הם להתנהל. </li></ol> 2. הכנת המכשיר microfluidic הערה: כל PLA microfluidicte מאפשר עד ארבעה ניסויים בלתי תלויים להתבצע. כדי למנוע זיהום של תאי זרימה בשימוש, השתמש פתרונות סטרילי ותנאי עבודה בעת הגדרת ניסוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון משלוח מהצלחת microfluidic ולשטוף את הבארות עם MYM-TE סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 300 μl MYM-TE כדי מפרצון גם 1 ו 300 μl בילה MYM-TE לבארות 2 עד 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 40 טענו μl מדולל נבגים משלבים 1.6 טעינת תא היטב 8 של השביל &quot;A&quot; ו לאטום את הסעפת לצלחת פי הוראות מייצרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את תוכנת בקרת מיקרופלואידיקה, לבחור את סוג הצלחת המתאים ולהקים תכנית זרימת ממשלת ערוץ הזרימה הקאמרית תרבות ידי בינוני זורם מבארות כניסה 1 עד 5 בשעה 6 psi במשך 2 דקות לכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשנת תוכנות שליטת מיקרופלואידיקה, ליצור פרוטוקול זרימה לניסוי: זורם MYM-TE מבאר כניסה 1 עבור 6 שעות, כדי לאפשר נביטה וצמיחה וגטטיבי של התאים. מֶתֶגאז כדי טפטוף של בילה MYM-TE מבארים 2 עד 5 בפעם הנותרת של הניסוי. במהלך הניסוי לשמור קבוע בלחץ הזרימה 6 psi (המקביל ל כ 9 μl בינוני / hr). התחל תוכנית תזרים לאחר שלב 3.5. </li></ol> 3. הגדר של מיקרוסקופ פרוטוקול זמן לשגות הערה: שיטה זו יושמה על מיקרוסקופ widefield הפוך ממונעת האוטומטי לחלוטין מצוידת במצלמת sCMOS, מנורת מתכת הליד, פוקוס אוטומטי חומרה, בעל קרקע צלחות 96-היטב בתא סביבתי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום לחמם את החדר הסביבתי עד 30 מעלות צלזיוס מראש על מנת למנוע בעיות עם הפוקוס האוטומטי לאחר תחילת הניסוי. הזמן הדרוש תלוי בתא הסביבתי בשימוש, המיקרוסקופ ומערכת החימום. התחל כדי לחמם את המערכת בלילה שלפני הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את Softwa מיקרוסקופ ואוטומציה מיקרוסקופיה ובקרהמִחָדָשׁ. השתמש צמצם מספרי גבוהת טבילה אובייקטיבי שמן (NA) לאיסוף אותות אופטימלי ברזולוציה מרחבית, כגון 100X, 1.46 אובייקטיבי NA שמן דסק&quot;ש. בחר מסננים מתאימים ומראות dichromatic לרכוש התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) תמונות ותמונות של תערובות חלבון צהוב-ניאון אדום ניאון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח טיפת שמן טבילה על המטרה ולהוסיף נוזל טבילה לתחתית חלון ההדמיה על צלחת microfluidic לשפר פוקוס תא במהלך רכישת תמונה. בזהירות הר מכשיר microfluidic האטום (שלב 2.5) על הבמה של מיקרוסקופ ההפוכה. ודא כי הצלחת מונחת היטב בעל הבמה אינו עוברת במהלך הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על חלון ההדמיה של תא תרבות microfluidic אל מוקד באמצעות סמני עמדה המוטבעות להתמצאות. פוקוס על החלק השמאלי ביותר של תא הזרימה הראשונה (שכותרתו &quot;A&quot;) עם הגודל מהלכודה 5, המקבילה לגובה מלכודת של 0.7 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוכנת מיקרופלואידיקה, תאי עומס מן המפרצון גם 8 ב 4 psi במשך 15 שניות. בדוק את צפיפות התאים בתא התרבות ידי הזזת הבמה על חלון ההדמיה. אם לא נבגים נלכדו, לחזור על שלב טעינת תא או לחלופין להגביר את לחץ הטעינה ו / או זמן עד צפיפות התאים הרצויה מושגת (1-10 נבגים לכל חלון הדמיה עם 2,048 x 2,048 פיקסלים). הימנע להעמיס את חדר התרבות. הערה: בדרך כלל אנחנו משתמשים מלכודת גודל 5 הדמית Streptomyces, אבל אנחנו גם השגנו תוצאות טובות עם מלכודת בגדלי 4 ו -3, עיינו במדריך למשתמש של הספק לקבלת הצעות נוספות על אופטימיזציה של תהליך טעינת תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעילו את תוכנית הזרימה תוכנות שליטה משלב 2.5 ולאפשר הצלחת microfluidic לחום-לאזן במשך שעה 1 בשלב מיקרוסקופ לפני תחילת רכישת התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשנת תוכנות שליטת מיקרוסקופ, להקים רכישה רבה ממדים לקחת muתמונות רובים של בעמדות במה מרובות לאורך זמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור שמירה אוטומטית: לציין ספרייה עבור שמירה אוטומטית של קבצי תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת הגדרות תאורה, לקבוע הגדרות תאורה אופטימלית עבור כל מבנה ספציפי מראש. לצורך הניסוי המתואר, השתמש פעמי החשיפה הבאות: דסק&quot;ש 150 msec, YFP 250 msec, RFP 100 msec. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור זמן-סדרה: להגדיר סדרה עתית לרכוש תמונות בנקודות הזמן הרצוי ברצף. הדמית מחזור החיים של ס venezuelae, לבחור מרווח זמן 40 דקות במשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למשרות במת פוקוס אוטומטית: לסרוק את חדר התרבות על ידי הזזת עמדות במת חנות במה לכל תפקיד הדמיה של עניין. ודא כי עמדות חד-שלבי ממוקמים מספיק מזה כדי למזער photobleaching ו phototoxicity.Typically להשתמש עד 12 עמדות. שגרת פוקוס אוטומטית מפעיל עבור כל נקודת זמן לתקן מוקדי סחף האט. אם אפשרות זו זמינה תוכנות שליטה מיקרוסקופ, אסטרטגית פוקוס אוטומטית מוגדר &quot;עדכון שטח מקומי על ידי פוקוס אוטומטי חומרה&quot;. לאחר Z-הקואורדינטות של עמדות הבמה שנבחרו מאומתות, להפעיל את הפוקוס אוטומטי חומרה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הניסוי זמן לשגות של תוכנות שליטה מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק שכל העמדות הבמה עדיין בפוקוס בנקודות מאוחר יותר. בניסויי זמן לשגות פועלים במשך כמה שעות, מעת לעת אנו מבחינים להיסחף הבמה גם בעת שימוש פוקוס אוטומטי. אם עמדות במה צריכות להיות refocused, להפסיק את הניסוי בכל נקודת זמן מתאימה, לשנות את הפוקוס ולהפעיל מחדש את הניסוי בתוך פרק הזמן המוגדר הדמיה (שלב 3.7.3). ראה שלב 4.3 עבור איך לשרשר סדרת הזמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור רכישת תמונה לאחר 24-30 שעות או כאשר העובש באזור של עניין יש בדיל לתוך נבגים (ראה סדרת תמונת DIC). לעצור את תוכנית תזרים בתוכנה לפרק את המכשיר microfluidic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן צלחת microfluidic משומש STO לטווח קצרזַעַם. הסר הנותרים MYM-TE ובילה MYM-TE מבאר 1 עד 6, גם בזבוז ריק 7 וטעינה התא היטב 8. בתנאים סטריליים, למלא מחדש בשימוש בארות של השביל &quot;A&quot; ובארות של נתיבים שאינם בשימוש ( &quot;B&quot; כדי &quot;D&quot;) על צלחת עם בופר פוספט סטרילית (PBS). חותם את הצלחת עם parafilm כדי למנוע ממנו להתייבש ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. </li></ol> 4. דור של זמן לשגות סרטים שימוש פיג&#39;י תוכנה הערה: יש לציין כי חבילות תוכנה מסחרית וחופשית שונות זמינות כדי לעבד תמונות מיקרוסקופיה זמן לשגות כולל ZenBlue, Metamorph, קפוא, ImagePro או ImageJ. כאן נתמקד פיג&#39;י, אשר הנה תכנית עיבוד תמונת קוד פתוח מבוססת על ImageJ, ואשר כבר מספק מספר התוספים המותקנים מראש שימושיים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתוני הדמיה העברת מניסוי זמן לשגות למחשב אשר פיג&#39;י מותקן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השקת התוכנית ולייבא את הקובץ הדמיה באמצעות &amp;# 34; קובץ&gt; יבוא&gt; ביו-פורמטים &quot;. או פשוט על ידי גרירת קובץ ההדמיה לתוך פיג&#39;י ב&quot; אפשרויות היבוא ביו-הפורמטים &quot;, סמן את התיבה&quot; ערוצים לפצל &quot;כדי לקבל ערימת תמונה נפרדת עבור כל ערוץ תאורה (DIC , RFP, YFP). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי: כדי למזג זמן-סדרות נפרדות נובעות הפסקה ברכישת התמונה בשל refocusing (שלב 3.9), פתח ערימות תמונת בהתאמה וברח &quot;תמונה&gt; סטאקס&gt; כלים&gt; לשרשר&quot; לכל ערוץ (DIC, RFP, YFP ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את איכות נתוני הזמן לשגות ידי גלילת ערימות תמונה. חפש עובש כי נשאר בפוקוס לאורך זמן, צמיחת mycelial מופע ובסופו של דבר ליצור נבגים (מחסנית DIC). בדוק את לוקליזציה subcellular הצפויה DivIVA-mCherry על קצות hyphal (מחסנית RFP) ו FtsZ-YPet להרכיב טבעות יחידות או מבנים רבים, כמו-סולם וגטטיבי או עובש sporogenic (מחסנית YFP), בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד אזור של אינטרס עבור processi במורד הזרםng של תמונות. זמן לשגות מיקרוסקופ לעתים קרובות מייצרת קבצים גדולים והדבר עשוי להאט עיבוד על ידי פיג&#39;י. לכן מומלץ לזהות ולבודד אזור של העניין (ROI) ולבצע צעדי עיבוד תמונה נוספים על גרסה קטנה יותר זה של מחסנית התמונה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר באפשרות &quot;הבחירה מלבנית&quot; בתפריט וצייר ROI מלבני בערימת תמונת DIC בצורה כזאת כי העובש בפיתוח מוקף על ידי ROI במהלך סדרת התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שכפל ROI מחסנית עם &quot;Ctrl&quot; + &quot;Shift&quot; + &quot;D&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש על הבר שם ערימת תמונת YFP ובחר &quot;ערוך&gt; בחירה&gt; שחזר בחירה&quot; בתפריט כדי לשחזר את הבחירה מלבני הקודמת של דסק&quot;ש המקורי מחסנית לאותה ההופעה במיקום בערימת YFP לשכפל את ההחזר על ההשקעה עם &quot;Ctrl&quot; + &quot;Shift&quot; + &quot;D&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על תהליך זה עבור מחסנית RFP. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את התמונות בתמונה השלוש ערימות to להסיר מרחף במה במישור xy לאורך זמן. גלול אל המסגרת האחרונה במחסנית דסק&quot;ש ובחר &quot;Plugin&gt; הרשמה&gt; StackReg&gt; RigedBody&quot; מהתפריט. חזור על שלב זה עבור RFP ואת מחסנית תמונת YFP. במידת הצורך, לחתוך את ההחזר על ההשקעה על ידי חזרה על צעד 4.5.1-4.5.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונלי: כוונון הבהירות והניגודיות באופן ידני עבור כל ערימה התמונה עם &quot;כוונון הבהירות והניגודיות כלי&quot; ( &quot;Ctrl&quot; + &quot;Shift&quot; + &quot;C&quot;) או בחר &quot;תהליך&gt; שפר ניגודיות&quot; מהתפריט ולהחיל את &quot;לנרמל&quot; פקודה לכל התמונות בערימה. יצוין כי הפקודה האחרונה תשנה ערכי הפיקסלים ולכן עשוי להשפיע ניתוח התמונה במורד הזרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי: שלב ערימות פרט (מרה לפורמט קובץ RGB, ראה 4.11) אופקי או אנכי באמצעות התוסף &quot;תמונה&gt; סטאקס&gt; כלים&gt; שלב&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת סרגל קנה מידה ( &quot;נתח&gt; כלים&gt; בר סולם&quot;) ואת חתם זמן (&amp;# 34; תמונה&gt; סטאקס&gt; זמן סטמפר &quot;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור ערימות תמונה שונות כרצף תמונה בפורמט &quot;.tiff&quot;. כדי להפיק סרט, שמירה בשם &quot;.אבי&quot;. לחלופין, סדרת תמונת יצוא בפורמט QuickTime באמצעות התוסף &quot;ביו-פורמטים&gt; ביו-פורמטי יצואן&quot; ובחר את סוג הקובץ &quot;.mov&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשיג תמונות מסגרות יחידות, בחר במסגרת של הריבית לשכפל את התמונה &quot;Ctrl&quot; + &quot;Shift&quot; + &quot;D&quot;. שינוי סוג של התמונה המתקבלת כדי &quot;RGB&quot; או &quot;8-bit&quot; תחת &quot;תמונה&gt; סוג&gt; צבע RGB או 8 סיביות&quot; ולשמור את התמונה בשם &quot;.tiff&quot;. הערה: פיג&#39;י מציעה מספר פונקציות נוספות בהמשך ויסמנו או תהליך הסדרת הזמן לשגות. עבור אל תמיכה מקוונת פיג&#39;י לקבלת מידע מפורט (http://fiji.sc/Fiji). </li></ol>

<ol><li>Bush, M. J., Tschowri, N., Schlimpert, S., Flärdh, K., Buttner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-di-GMP+signalling+and+the+regulation+of+developmental+transitions+in+streptomycetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">c-di-GMP signalling and the regulation of developmental transitions in streptomycetes.</a> Nat. Rev. Microbiol. 13, 749-760 (2015).</li>
<li>Jakimowicz, D., van Wezel, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+division+and+DNA+segregation+in+Streptomyces.%3A+how+to+build+a+septum+in+the+middle+of+nowhere%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cell division and DNA segregation in Streptomyces.: how to build a septum in the middle of nowhere?</a> Mol. Microbiol. 85, 393-404 (2012).</li>
<li>McCormick, J. R., Flärdh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signals+and+regulators+that+govern+Streptomyces+development%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Signals and regulators that govern Streptomyces development.</a> FEMS Microbiol. Rev. 36, 206-231 (2012).</li>
<li>Flärdh, K., Richards, D. M., Hempel, A. M., Howard, M., Buttner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+apical+growth+and+hyphal+branching+in+Streptomyces%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of apical growth and hyphal branching in Streptomyces.</a> Curr. Opin. Microbiol. 15, 737-743 (2012).</li>
<li>Hempel, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ser%2FThr+protein+kinase+AfsK+regulates+polar+growth+and+hyphal+branching+in+the+filamentous+bacteria+Streptomyces%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The Ser/Thr protein kinase AfsK regulates polar growth and hyphal branching in the filamentous bacteria Streptomyces.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 109, E2371-E2379 (2012).</li>
<li>Fuchino, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+gradients+of+an+intermediate+filament-like+cytoskeleton+are+recruited+by+a+polarity+landmark+during+apical+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dynamic gradients of an intermediate filament-like cytoskeleton are recruited by a polarity landmark during apical growth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, E1889-E1897 (2013).</li>
<li>Holmes, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coiled-coil+protein+Scy+is+a+key+component+of+a+multiprotein+assembly+controlling+polarized+growth+in+Streptomyces%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Coiled-coil protein Scy is a key component of a multiprotein assembly controlling polarized growth in Streptomyces.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, E397-E406 (2013).</li>
<li>McCormick, J. R., Su, E. P., Driks, A., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+viability+of+Streptomyces+coelicolor.+mutant+for+the+cell+division+gene+ftsZ%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Growth and viability of Streptomyces coelicolor. mutant for the cell division gene ftsZ.</a> Mol. Microbiol. 14, 243-254 (1994).</li>
<li>Margolin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FtsZ+and+the+division+of+prokaryotic+cells+and+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">FtsZ and the division of prokaryotic cells and organelles.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 862-871 (2005).</li>
<li>Grantcharova, N., Lustig, U., Flärdh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+FtsZ+assembly+during+sporulation+in+Streptomyces+coelicolor+A3%282%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Dynamics of FtsZ assembly during sporulation in Streptomyces coelicolor A3(2).</a> J. Bacteriol. 187, 3227-3237 (2005).</li>
<li>Richards, D. M., Hempel, A. M., Flärdh, K., Buttner, M. J., Howard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+basis+of+branch-site+selection+in+filamentous+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanistic basis of branch-site selection in filamentous bacteria.</a> PLoS Comput. Biol. 8, e1002423(2012).</li>
<li>Hempel, A. M., Wang, S. B., Letek, M., Gil, J. A., Flärdh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assemblies+of+DivIVA+mark+sites+for+hyphal+branching+and+can+establish+new+zones+of+cell+wall+growth+in+Streptomyces+coelicolor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Assemblies of DivIVA mark sites for hyphal branching and can establish new zones of cell wall growth in Streptomyces coelicolor.</a> J. Bacteriol. 190, 7579-7583 (2008).</li>
<li>Wolanski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replisome+trafficking+in+growing+vegetative+hyphae+of+Streptomyces+coelicolor+A3%282%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Replisome trafficking in growing vegetative hyphae of Streptomyces coelicolor A3(2).</a> J. Bacteriol. 193, 1273-1275 (2011).</li>
<li>Jyothikumar, V., Tilley, E. J., Wali, R., Herron, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+microscopy+of+Streptomyces+coelicolor.growth+and+sporulation%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Time-lapse microscopy of Streptomyces coelicolor.growth and sporulation.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 6774-6781 (2008).</li>
<li>Willemse, J., Borst, J. W., de Waal, E., Bisseling, T., van Wezel, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+control+of+cell+division%3A+FtsZ+is+recruited+by+SsgB+during+sporulation+of+Streptomyces%5BTitle%5D)+AND+%22Genes.+Dev%22%5BJournal%5D)">Positive control of cell division: FtsZ is recruited by SsgB during sporulation of Streptomyces.</a> Genes. Dev. 25, 89-99 (2011).</li>
<li>Glazebrook, M. A., Doull, J. L., Stuttard, C., Vining, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporulation+of+Streptomyces+venezuelae.+in+submerged+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Sporulation of Streptomyces venezuelae. in submerged cultures.</a> J. Gen. Microbiol. 136, 581-588 (1990).</li>
<li>Bibb, M. J., Domonkos, A., Chandra, G., Buttner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+chaplin+and+rodlin+hydrophobic+sheath+proteins+in+Streptomyces+venezuelae.is+controlled+by+sigma%28BldN%29+and+a+cognate+anti-sigma+factor%2C+RsbN%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Expression of the chaplin and rodlin hydrophobic sheath proteins in Streptomyces venezuelae.is controlled by sigma(BldN) and a cognate anti-sigma factor, RsbN.</a> Mol. Microbiol. 84, 1033-1049 (2012).</li>
<li>Al-Bassam, M. M., Bibb, M. J., Bush, M. J., Chandra, G., Buttner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+regulator+heterodimer+formation+controls+a+key+stage+in+Streptomyces+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Response regulator heterodimer formation controls a key stage in Streptomyces development.</a> PLoS Genet. 10, e1004554(2014).</li>
<li>Bush, M. J., Bibb, M. J., Chandra, G., Findlay, K. C., Buttner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+required+for+aerial+growth%2C+cell+division%2C+and+chromosome+segregation+are+targets+of+WhiA+before+sporulation+in+Streptomyces+venezuelae%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Genes required for aerial growth, cell division, and chromosome segregation are targets of WhiA before sporulation in Streptomyces venezuelae.</a> MBio. 4, e00684-e00613 (2013).</li>
<li>Tschowri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrameric+c-di-GMP+mediates+effective+transcription+factor+dimerization+to+control+Streptomyces+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tetrameric c-di-GMP mediates effective transcription factor dimerization to control Streptomyces development.</a> Cell. 158, 1136-1147 (2014).</li>
<li>Mirouze, N., Ferret, C., Yao, Z., Chastanet, A., Carballido-Lòpez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MreB-Dependent+Inhibition+of+Cell+Elongation+during+the+Escape+from+Competence+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">MreB-Dependent Inhibition of Cell Elongation during the Escape from Competence in Bacillus subtilis.</a> PLoS Genet. 11, e1005299(2015).</li>
<li>Zopf, C. J., Maheshri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquiring+fluorescence+time-lapse+movies+of+budding+yeast+and+analyzing+single-cell+dynamics+using+GRAFTS%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Acquiring fluorescence time-lapse movies of budding yeast and analyzing single-cell dynamics using GRAFTS.</a> J. Vis. Exp. (e50456), (2013).</li>
<li>Meniche, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subpolar+addition+of+new+cell+wall+is+directed+by+DivIVA+in+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Subpolar addition of new cell wall is directed by DivIVA in mycobacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 111, E3243-E3251 (2014).</li>
<li>Donovan, C., Schauss, A., Kramer, R., Bramkamp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+segregation+impacts+on+cell+growth+and+division+site+selection+in+Corynebacterium+glutamicum%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Chromosome segregation impacts on cell growth and division site selection in Corynebacterium glutamicum.</a> PLoS One. 8, e55078(2013).</li>
<li>Rojas, E., Theriot, J. A., Huang, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+Escherichia+coli.+growth+rate+to+osmotic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Response of Escherichia coli. growth rate to osmotic shock.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 111, 7807-7812 (2014).</li>
<li>Flärdh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+of+DivIVA+in+polar+growth+and+morphogenesis+in+Streptomyces+coelicolor+A3%282%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Essential role of DivIVA in polar growth and morphogenesis in Streptomyces coelicolor A3(2).</a> Mol. Microbiol. 49, 1523-1536 (2003).</li>
<li>Sliusarenko, O., Heinritz, J., Emonet, T., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+subpixel+precision+analysis+of+bacterial+morphogenesis+and+intracellular+spatio-temporal+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">High-throughput subpixel precision analysis of bacterial morphogenesis and intracellular spatio-temporal dynamics.</a> Mol. Microbiol. 80, 612-627 (2011).</li>
<li>Young, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+single-cell+gene+expression+dynamics+in+bacteria+using+fluorescence+time-lapse+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy.</a> Nat. Protoc. 7, 80-88 (2012).</li>
<li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, R100(2006).</li>
<li>Kuru, E., Tekkam, S., Hall, E., Brun, Y. V., Van Nieuwenhze, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+fluorescent+D-amino+acids+and+their+use+for+probing+peptidoglycan+synthesis+and+bacterial+growth+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Synthesis of fluorescent D-amino acids and their use for probing peptidoglycan synthesis and bacterial growth in situ.</a> Nat. Protoc. 10, 33-52 (2015).</li>
<li>Szafran, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+I+%28TopA%29+is+recruited+to+ParB+complexes+and+is+required+for+proper+chromosome+organization+during+Streptomyces+coelicolor.+sporulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase I (TopA) is recruited to ParB complexes and is required for proper chromosome organization during Streptomyces coelicolor. sporulation.</a> J. Bacteriol. 195, 4445-4455 (2013).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

זמן לשגות מיקרוסקופית של מחזור החיים Streptomyces כבר מאתגר מבחינה טכנית בעבר. כאן אנו מציגים פרוטוקול חזק כדי לבצע דימות תאי חיים של מחזור החיים המלא באמצעות התכת חלבון פלואורסצנטי אל DivIVA סמן הקוטבי בתא וחטיבת חלבון תא FtsZ לעזור לחזות להתחקות התקדמות באמצעות תכנית התפתחותית (איור 2). מרכזי לשיטה זו היא הטיפוח של ס venezuelae במכשיר microfluidic המאפשר זלוף בינוני קבוע ואת חילופי מדיום הגידול רגיל (MYM-TE) עם המדיום בילה (בילה MYM-TE). השינוי של מצב ההתרבות חשוב בפרוטוקול תאר כי downshift התזונתי כמו גם בארות עדיין שום אותות תאיים לא מזוהים (למשל מניין אותות חישה) במדיום תרבות בילו, לקדם נביגה, ואילו אספקה ​​רציפה של מדיום תזונתי עשירה מגרה growt וגטטיבישעות עם היווצרות כמעט נבג (מידע לא מוצג). לפיכך, culturing תאים במערכת microfluidic זו עדיף על תאי culturing על agarose כי הוא מציע גמישות ניסיון יותר ומאפשר ניטור ארוך טווח של שינויי התפתחות חיידקים בתגובה לשינויים בתנאי תרבות. למרות צלחות microfluidic מיועדות לשימוש יחיד בלבד, לזרום ערוצים שלא היה מחוסן עם תאים יכול לשמש בניסויים הבאים. אנו ממליצים להשתמש בכל ערוצי צלחת microfluidic תוך שבוע, כפי שחווינו בעיות איטום סעפת צלחות שנפתחו לזמנים ארוכים יותר. בעת הגדרת ניסוי, מצאנו כי נבגים מוכנים טרי מונבטים בתוך שתי שעות של נטען לתוך תא הזרימה, ואילו נבגים נגזרו מנית גליצרול קפוא נדרשים לפחות 6 שעות לפני צינורות ניבטו יצאו (מידע לא מוצג). עיכוב זה בלבלוב משתרע לכל אורכה של הניסוי יכול להפריעזמינות הציוד תנאי הניסוי. כמו כן, חשוב להתחיל את הניסוי עם טפטוף של MYM-TE לפחות 3 שעות כדי לספק חומרים מזינים מספיק לפיתוח תולדה של צינורות נבט. זלוף עם MYM-TE יכול להתארך מעבר hr הראשונית 3 אם הניסוי נועד ללמוד הצמיחה וגטטיבי. בעוד נבגים לספק הבחירה המועדפת של חומר המוצא, שברי hyphal קצר יכול גם להיות טעון לתוך צלחת microfluidic. עם זאת, את יעילות הטעינה בעת שימוש תפטיר טעון היא משמעותית נמוכה ולעתים קרובות דורשת מספר ריצות טעינה אשר עשוי להציג מגבלה כאשר בוחנים מוטנטים שאינם sporulating. ללא קשר לסוג של בידוד המשמש, חשוב לא להעמיס על חדר התרבות עם נבגים או שברי hyphal כמו זה יוביל צפיפות מהירה שיכול להפריע דיפוזיה תקשורת לסבך ניתוח תמונה. חשוב לתכנן את בניית חלבוני כתב carefully לשימוש הדמיה זמן לשגות הקרינה Streptomyces. אורך לינקר בין חלבון המטרה ואת כתב הניאון והבחירה של N- או בשילובי C- מסוף יכול להיות קריטי. יתר על כן, תנאי ניסוי אופטימליים, כוללים תדירות הדמיה וזמן חשיפה, צריכים להיקבע מראש עבור כל חלבון fluorescently- מתויג. ס פלואורסצנציה אוטומט תערוכת עובש venezuelae בערוץ הירוק / צהוב שעשויות להיות בעייתיים כאשר הדמית חלבון שכותרתו fluorescently כי מתבטא ברמות נמוכות. בנוסף, יש לציין כי, במהלך הנביטה ואת שלב הצמיחה וגטטיבי הראשונית, S. venezuelae הוא רגיש במיוחד אור באורך גל קצר (למשל בעת שימוש בשילובי חלבון CFP). למרות ההתקדמות המתמשכת בטכניקות הדמיה ומערכות כתב ניאון עבור הדמיה לחיות תאים של חיידקים, ברוב חבילות התוכנה (למשל MicrobeTracker, Schnitzelcאמות, CellProfiler) לעיבוד האוטומטי הבא של אלו סוגים של ערכות נתונים אינן תומכות הניתוח של תמונות נגזרות חיידקים פילמנטיות עם סגנון חיים רב-תאיים 27-29. לפיכך, יש צורך לפתח אלגוריתם מתאים לניתוח תפוקה גבוהה כמותי של נתונים הדמיה מ- Streptomyces וחיידקים filamentous אחרים. לסיכום, העבודה המתוארת כאן ממחישה את הפוטנציאל העצום של ס venezuelae כמערכת התפתחותית מודל חדשה מהמין, בגלל יכולתה sporulate בנוזל. מכשיר culturing microfluidic הוא פשוט לשימוש גם עבור משתמשים לא מנוסים. הוא מספק פלטפורמה מצוינת ללמוד תהליכים ביולוגיים תא מרכזיים מחזור חי Streptomyces, כולל לוקליזציה חלבון דינמית, צמיחה מקוטבת, ואת הבידול מורפולוגיים של תפטיר רב-תאי לתוך רשתות של נבגי unigenomic. בנוסף זה הניסיון להגדיר up גם מספק נקודת מוצא מפתה כדי לחקור את האירועים בפיתוח שדורשים לסירוגין התנאים תרבות, או את השימוש של צבעי ניאון כגון חומצות -amino D ניאון כדי לפקח סינתזה פפטידוגליקן או יודיד propidium ו 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) כדי לחזות כרומוזום ארגון 30,31.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/53863/fluorescence-time-lapse-imaging-complete-s-venezuelae-life-cycle" target="_blank">Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device</a>
The author&#39;s name was updated from:
Mark Buttner
to:
Mark J. Buttner

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/53863/fluorescence-time-lapse-imaging-complete-s-venezuelae-life-cycle" target="_blank">Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device</a>
The middle initial J. has been added to author Mark Buttner.

Erratum: Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Streptomycetes הם חיידקי אדמת שוכני המאופיינות מחזור התפתחותית מורכב המעורב בידול מורפולוגיים מ תפטיר רב-תאי, הדחה-מזין רדום, נבגי unigenomic 1-3. תחת תנאי גידול נוחים שנבג Streptomyces הטיפוסי מתחיל לנבוט ידי לשיחול צינורות ניבטים אחד או שניים (איור 1). צינורות אלה להאריך ובהרחבת טיפ ולגדול לרשת hyphal קנים המכונית התפטיר וגטטיבי. צמיחת פולאר הסתעפות hyphal מופנה על ידי DivIVA החלבון החיוני. חלבון מפותל, סליל זהו חלק ממכלול ציטופלסמית גדול שנקרא polarisome, שהוא חיוני עבור החדרת חומר מעטפה הסלולרית החדש בקצה הארכת 4-7. במהלך צמיחה של צמח, חוטי hyphal להיות ממודרים כתוצאה מהיווצרותם הנדירה של מה שנקרא חוצת קירות 8. ההיווצרות של קירות הצולבים אלה מחדש<html> quires FtsZ, החלבון cytoskeletal דמוי טובולין כי הוא חיוני עבור חלוקת התא רוב החיידקים 9. בשנת Streptomyces, לעומת זאת, קירות צלב וגטטיבי אלה אינם להוביל לפרידת התכווצות תאי תאים ולכן מסת mycelial נשארה כרשה של תאי סינסיציאלי מחובר יתר. בתגובת הגבלת מזין ואיתות אחרים שאינם מובנים היטב, עובש אוויר מיוחד להתנתק התפטיר וגטטיבי ולגדול לאוויר 3. הקמת המבנים אלה יוזמת את שלב הרבייה של פיתוח, שבמהלכו עובש האוויר רב-גנומי הארוך להיות מחולק עשרות תאי prespore unigenomic השווה בגודלן. אירוע חלוקת תא מסיבי זה הוא מונע על ידי ההתכווצות סינכרוני של טבעות FtsZ מרובות בתוך 2,10 עובש sporogenic היחיד. בידול מורפולוגי הושלם על ידי השחרור של רדומים, בעובי דופן, נבגים פיגמנט. t &quot;FO: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53863/53863fig1.jpg" /> איור 1:. Streptomyces מחזור החיים על תקשורת מוצקה זהו מודל של מחזור החיים מבוסס על מחקרים קלסיים של ס coelicolor גדל על צלחות אגר. פיתוח הסלולר של נבג מתחיל עם ההיווצרות של צינורות ניבטים אחד או שניים, אשר גדלים באמצעות רחבת טיפ ליצירת רשת של הסתעפות עובש. הצמיחה פולאר הסתעפות של העובש וגטטיבי היא נוהלה על ידי DivIVA (אדום). ההיווצרות של חוצת קירות וגטטיבי דורשת FtsZ (ירוק). בתגובה להגבלות מזין אותות אחרים, עובש אווירי מוקמים. מעצר של צמיחה אווירית מרוכז באופן הדוק עם ההרכבה של סולם של FtsZ-טבעות, אשר מעוררות את septa נביגה כי למדר את עובש sporogenic לתאי prespore דמוי קופסא. תאים אלה להרכיב קיר נבג עבה והם בסופו של דבר released נבגים פיגמנט מבוגרים. האירועים התפתחותי החשובים של מחזור חי Streptomyces הם גם מאופיינים 1,3. עם זאת, מה הוא עדיין נדיר מחקרי תא ביולוגי מעסיקות הקרינה מיקרוסקופיה זמן לשגות לספק תובנה תהליכי subcellular שבבסיס בידול, כגון דינמיקת לוקליזציה חלבון, תנועת כרומוזום חלוקת תא מבחינת התפתחותית מבוקרת. Live- תא הדמיה של פיתוח Streptomyces כבר מאתגר בגלל המורכבות של מחזור החיים ואת המאפיינים הפיזיולוגיים של האורגניזם. מחקרים קודמים על צמיחת צמח ו בשלבים הראשונים של septation נביגה יש מועסקים לתאי הדמיה חדיר-חמצן, או הצמיחה נתמכת agarose של coelicolor Streptomyces על במת מיקרוסקופ 11-15. שיטות אלה, עם זאת, מוגבלים על ידי מספר גורמים. חלק מהמערכות רק לאפשר הדמיה לטווח קצר של צמיחה הסלולרחלבוני ניאון ד לפני תאים סובלים אספקת חמצן מספיקה או לצמוח מתוך המטוס מוקד בשל דפוס תלת ממדי של פיתוח hyphal. במקרים בם הדמיה לטווח ארוך אפשרית, טיפוח תאים על גבולות רפידות agarose גמישות ניסיון, כי התאים לא יכולים להיחשף תנאי גידול או מתח חלופיים, ואת קרינת הרקע מהמדיום של רפידות agarose מגבילה מאוד את היכולת לנטר ניאון חלש אותות. כאן אנו מתארים פרוטוקול עבור דימות תאים חיים של מחזור החיים Streptomyces להשלים עם דיוק ורגישות מעולה. על ידי הגדלה Streptomyces במכשיר microfluidic מחובר מיקרוסקופ פלואורסצנטי widefield (איור 2), אנו יכולים כעת לעקוב אחר נביטה, צמיחה צמח ו נביגה septation על פני פרק זמן של עד 30 שעות. זה קל מאוד על ידי השימוש של Streptomyces אורגניזם המודל החדש </em&gt; venezuelae כי זה sporulates להשלמה ליד בתרבות השקועה ובכך מתגבר על המגבלה של מיני מודל הקלסיים ס coelicolor, אשר sporulates רק על תקשורת מוצקה 16-20. כדי לעזור לחזות צמיחה צמח ו נביגה, אנו שיתוף-Express fluorescently מתויג גרסאות של DivIVA סמן הקוטביות בתא ואת החלבון חלוקת התא מפתח FtsZ. אנחנו משתמשים במכשיר microfluidic זמינים מסחרית כי הועסק בהצלחה עבור mycobacteria, Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, subtilis Bacillus ושמרים 21-25. מערכת מלכודות תאי מטוס בודד מוקדי ומאפשרת שליטת זלוף הרציפה של מדיום תרבות ממאגרים שונים. בפרוטוקול המפורט ננצל בתכונה זו כדי לחשוף ס venezuelae תפטיר וגטטיבי על downshift תזונתי לקדם נביגה. הדה הפרוטוקולscribed הוא עבור דימות תאים חיים של מחזור החיים Streptomyces כולו, אבל התנאים תקשורת אלטרנטיבית או הגדרות מיקרוסקופ ניתן לבחור אם בשלבים התפתחותיים ספציפיים הם בעלי עניין מיוחד. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53863/53863fig2.jpg" /> איור 2: סכמטי המתאר את זרימת העבודה הניסויית. שלושת הצעדים העיקריים המתוארים בפרוטוקול מוצגים. ראשית, נבגים ובינוניים בילו ערוכים מתרבות נייחת פאזיים. שנית, נבגים טריים נטענים לתוך מערכת microfluidic וס venezuelae הוא צלם לאורך כל מחזור החיים ההתפתחותיים שלו באמצעות מיקרוסקופ הפוכה אוטומטית לחלוטין עם תא דגירה לשמור על טמפרטורה לצמיחה אופטימלית. שלישית, סדרת הזמן לשגות שהתקבלה מנותחת ומעובד באמצעות תוכנת הקוד הפתוח פיג&#39;י.

<table><tbody><tr><td>B04A צלחת CellAsic ONIX לתאי חיידקים</td><td>Merck-Millipore</td><td>B04A-03-5PK</td><td>לוחות תרבית מיקרופלואידית</td></tr><tr><td>CellAsic ONIX מערכת זלוף מיקרופלואידית ו-ONIX FG (גרסה 5.0.2)</td><td>Merck-Millipore</td><td>EV-262</td><td>ניתן למצוא את הגרסה האחרונה של ONIX (יולי 2015) והוראות כיצד להשתמש בתוכנית כאן: http://www.merckmillipore.com</td></tr><tr><td>Axio Observer.Z1 מיקרוסקופ</td><td>Zeiss</td><td>431007-9902-000</td><td>מיקרוסקופ שדה רחב הפוך אוטומטי וממונע</td></tr><tr><td>לחלוטין אינקובטור XL multi S1 עם מודול טמפרטורה S1 ויחידת חימום XL S2</td><td>Zeiss</td><td>411857-9061-000</td><td>תא סביבתי המקיף את המיקרוסקופ</td></tr><tr><td>Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC objective</td><td>Zeiss</td><td>420792-9800-000</td><td></td></tr><tr><td>Ocra FLASH 4 V2</td><td>Hamamatsu Photonics K.K.</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>תאורה HXP 120V</td><td>Zeiss</td><td>423013-9010-000</td><td></td></tr><tr><td>סט מסנני FL 46 HE YFP ללא משמרת</td><td>Zeiss</td><td>489046-9901-000</td><td>סט מסנני פלורסנט, עירור 500/25 ננומטר, פליטה 535/30 ננומטר</td></tr><tr><td>סט מסנני FL 63 HE RFP ללא משמרת</td><td>Zeiss</td><td>489063-0000-000</td><td>סט מסנני פלורסנט, עירור 572/25 ננומטר, פליטה 629/30 ננומטר</td></tr><tr><td>מסגרת הרכבה K-M למולטיוול צלחות</td><td>Zeiss</td><td>000000-1272-644</td><td>מחזיק במה לצלחת מיקרופלואידית</td></tr><tr><td>ZEN pro 2012</td><td>Zeiss</td><td>410135-1002-120</td><td>תוכנת בקרת מיקרוסקופ</td></tr><tr><td>ZEN מודול Time Lapse</td><td>Zeiss</td><td>410136-1031-110</td><td>מודול תוכנה להגדרת ניסויי מיקרוסקופיה זמן-lapse</td></tr> מודול <tr><td>ZEN אריחים/מיקומים</td><td>Zeiss</td><td>410136-1025-110</td><td>מודול תוכנה לשמירת מיקומי שלב ספציפיים (xzy)</td></tr><tr><td>חבילת תוכנה בקוד פתוח</td> <td>מפיג'י</td><td>http://fiji.sc/Fiji</td><td>יצירת סרטי קיטועי זמן</td></tr><tr><td><חזקים>תמצית מלטוזה-שמרים אקסטרקט-מאלט (MYM)</חזק> 4 גרם מלטוז<> 4 גרם תמצית שמרים 10 גרם תמצית לתת להוסיף 1 ליטר H2O באמצעות 50% מי ברז ו-50% מי אוסמוזה הפוכה ולהוסיף 200 מ"ל תמיסת יסודות קורט R2 ל-100 מ"ל לאחר חיטוי</td><td></td><td></td><td>מדיום נבגים המשמש לתרבית S. venezuelae SV60</td></tr><tr><td>R2 תמיסת יסודות קורט (TE) 8 מ"ג ZnCl2 40 מ"ג FeCl3-6H2O 2 מ"ג CuCl2-2H2O 2 מ"ג MnCl2-4H2O 2 מ"ג Na2B4O7-10H2O 2 מ"ג ( NH4)6Mo7O24-4H2O להוסיף 200 מ"ל H2O Autoclave ולאחסן ב-4 oC</td><td></td><td></td><td>להוסיף 0.002 נפחים ל MYM</td></tr><tr><td>PBS (מלח חוצץ פוספט)</td><td>Sigma</td><td>P4417-100TAB</td><td>משמש למילוי בארות כניסה של נתיבים שאינם בשימוש בלוחות B04A על מנת להכין צלחת לאחסון לטווח קצר.</td></tr><tr><td>0.22 ומיקרו; מסנני מזרק</td><td>m Satorius stedim</td><td>16532-K</td><td>הכנת אוסף</td></tr><tr><td></td> זנים משומש MYM-TE<td>SV60</td><td>John Innes Centre</td><td>S. venezuelae זן המבטא divIVA-mcherry ו-ftsZ-ypet</td></tr></tbody></table>

זמן לשגות הדמיה הקרינה של השלם<em&gt; s. venezuelae</em&gt; מחזור החיים באמצעות מכשיר microfluidic

Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

הדמיית תאים חיים של תהליכים ביולוגיים ברמת התא הבודד הייתה חיונית להבנתנו הנוכחית את הארגון התת-תאי של תאי חיידקים. עם זאת, היישום של מיקרוסקופ זמן-lapse לחקר התהליכים הביולוגיים של התא העומדים בבסיס ההתפתחות בחיידק החוטים הנבגים Streptomyces נפגע על ידי קשיים טכניים. 
כאן אנו מציגים פרוטוקול להתגברות על מגבלות אלה על ידי גידול מין המודל החדש, Streptomyces venezuelae, במכשיר מיקרופלואידי זמין מסחרית המחובר למיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב שדה הפוך. בניגוד למיני המודל הקלאסיים, Streptomyces coelicolor, S. venezuelae נבגים בנוזל, ומאפשרים יישום של תאי גידול מיקרופלואידיים כדי לטפח ולנטר מיקרוסקופית את ההתפתחות התאית וההתמיינות של S. venezuelae לאורך תקופות זמן ארוכות. בנוסף לניטור שינויים מורפולוגיים, ניתן לדמיין את ההתפלגות המרחבית-זמנית של חלבוני מטרה המסומנים פלואורסצנטית גם על ידי מיקרוסקופ זמן-lapse. יתר על כן, הפלטפורמה המיקרופלואידית מציעה את הגמישות הניסיונית להחלפת מדיום התרבית, המשמש בפרוטוקול המפורט לגירוי נבגים של S. venezuelae בתא המיקרופלואידי. תמונות של כל מחזור החיים של דרום ונצואלה נרכשות במרווחי זמן ספציפיים ומעובדות בתוכנת הקוד הפתוח פיג'י כדי להפיק סרטים של סדרות הזמן המוקלטות.

ההדמיה לחיות התאים המוצלחת של ס כולו מחזור החיים venezuelae מניב זמן-סדרה רצופה כולל שלבי ההתפתחות העיקריים של נביטה, צמיחה צמח ו נביגה (איור 3, סרט 1). ויזואליזציה של ההתקדמות דרך מחזור החיים משופרת נוספת על ידי לוקליזציה subcellular הברורה של DivIVA-mCherry ו FtsZ-YPet. במהלך נביטה וצמיחה וגטטיבי, DivIVA-mCherry מצטבר בלעדי בקצות hyphal גדלו או סימני טביעה חדש נקודות סניף (איור 4 א). תוצאות אלו עולות בקנה אחד עם מיצוב subcellular שדווח בעבר של 12,26 DivIVA. לעומת זאת, FtsZ-YPet יוצר יחיד מבנים דמויי טבעת במרווחים לא סדירים של תפטיר גדל (איור 4B). מבנים אלה מספקים את הפיגום לסינתזה של קירות צלב וגטטיבי שאינם מגבילים, המוביל להיווצרות של interconnמדורי hyphal ected 8. בידול הסלולר של גדל עובש לתוך עובש sporogenic הופך לגלוי על ידי היעלמות מוקדי קוטב DivIVA-mCherry, מעצרו של צמיחת קוטב והעלייה במקבילה של קרינת FtsZ-YPet (האיור 4C). בשנת sporulating העובש, דפוס לוקליזציה של FtsZ-YPet משתנה באופן דרמטי; חוטי סליל FtsZ-YPet הראשונים מתגלגלים לאורך hypha ולאחר מכן, אירוע סינכרוני פתאומי, כמעט, סלילים אלה להתגבש סולם צלצולי YPet FtsZ פזור. תחת תנאי הניסוי המתואר כאן, מופץ באופן שווה אלה סולמות FtsZ-YPet להימשך כ -2 שעות. לבסוף, מחיצה נביגה להיות ניכר הניגוד התערבות ההפרש (DIC) תמונות (איור 4D) ולבסוף נבגים חדשים מתפרסמים. הפרוטוקול הבא המתאר את עיבוד התמונה באמצעות תוכנת פיג&#39;י קובעה<html> TEP-אחר-צעד הסבר כיצד להפיק סרט לפרסום מהסדרת הזמן לשגות רכש (סרט 1). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53863/53863fig3.jpg" /> איור 3: תמונות Snapshot מתוך סדרת מיקרוסקופ פלואורסצנטי זמן לשגות נציג ס venezuelae הפיק שכותרתו fluorescently FtsZ (ירוק) DivIVA (אדום) מוצגים הם מסגרות נבחרות תמונות ממוזגות (פנל עליון: RFP-YFP-DIC, פנל תחתון: DIC). לדמיין את מחזור חי Streptomyces כולל נביטה, צמיחת צמח ו נביגה. תמונות נלקחו סרט 1. זמן נמצא hr: דקות. ברי סולם = 5 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53863/53863fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> ד / 53,863 / 53863fig4.jpg &quot;/&gt; איור 4: נציג תוצאות עבור סדרה הזמן לשגות מוצלחת של מחזור חי Streptomyces (א) לוקליזציה של DivIVA-mCherry.. מוצגים הם תמונות של שתי נקודות בפעם הבאות מסרט 1 עם תמונות ממוזגות של RFP וערוצי דסק&quot;ש. DivIVA-mCherry מסמן אתרי סניף hyphal חדשים (ראש חץ מלא) ו localizes בקצה hyphal לכוון צמיחה קוטבית (ראש חץ פתוח). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר (ב) לוקליזציה FtsZ-YPet במהלך הצמיחה וגטטיבי (ראש חץ). FtsZ-YPet יוצר יחיד מבנים דמוי טבעת (פנל עליון) כי לא להצר (DIC, פנל תחתון). (C) FtsZ-YPet (ירוק) לוקליזציה במהלך septation נביגה. מוקדי DivIVA-mCherry מוצגים באדום, עם זמן שחלף המתואר להלן (HR: דקות). סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר. (ד) מקביל תמונות דסק&quot;ש של עובש sporulating מ (C) מראה את הטופסation של תאי prespore עם septa נביגה הגלוי (בתמונה משמאל), אשר בסופו של דבר להבשיל לכדי שרשרת של נבגים (בתמונה מימין). זמן הוא hr: דקות. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53863/53863fig4large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="מסגרת מסרט 1" src="/files/ftp_upload/53863/53863mov1.jpg" /> סרט 1: סדרת מיקרוסקופ פלואורסצנטי זמן לשגות של Streptomyces venezuelae מחזור החיים הסרט מורכב תמונות RFP-YFP הממוזגת (משמאל) ואת התערבות ההפרש לעומת המקביל (DIC) תמונות (מימין).. DivIVA-mCherry מוצג YPet-FtsZ האדום בירוק. מרווח הזמן בין יחיד מסגרות הוא 40 דקות. בר סולם = 10 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53863/movie1.mov" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה תי</a>סרט של.

Streptomyces מאופיינים במחזור חיים מורכב שהיה מאתגר מבחינה ניסויית למחקר באמצעים ביולוגיים של תאים. כאן אנו מציגים פרוטוקול לביצוע מיקרוסקופ פלואורסצנטי של מחזור החיים השלם על ידי גידול Streptomyces venezuelae במכשיר מיקרופלואידי.

זמן לשגות הדמיה הקרינה של השלם<em&gt; S. venezuelae</em&gt; מחזור החיים באמצעות מכשיר microfluidic

Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול מיקרוסקופיית ה-time-lapse הפלואורסצנטית היא לספק שיטה לחקר תהליכים ביולוגיים בתאים העומדים בבסיס הפיתוח והדיפרנציאציה התאית בחיידק Filamentous sporulating, Streptomyces venezuelae. השיטה המתוארת מהווה פלטפורמה מצוינת לחקר תהליכים ביולוגיים תאיים המרכזיים במחזור החיים של Streptomyces, כולל לוקליזציה דינמית של חלבונים, צמיחה מקוטבת וספטציה במהלך הספורולציה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא ש-Streptomyces venezuelae עובר ספורולציה בנוזל, מה שמאפשר לגדל את התאים במכשיר מיקרופלואידי ולנטר מיקרוסקופית את מחזור החיים המלא.שיטה זו מדגימה את הפוטנציאל העצום של Streptomyces venezuelae כמערכת פיתוח חדשה עבור הסוג, כיוון שהיא מאפשרת דימוי של תאים חיים במהלך ההבחנה של מיצליום רב-מרכזים לשרשראות של נבגים. ראשית, יש להוסיף ל-30 milliliters של מצע גידול מועשר 10 microliters של נבגים מזן ה-S.venezuela שמעוניינים לדמות. לצורך גדילה וספורולציה עקביות של התאים, השתמשו בבקבוק עם מחיצות (baffled flask) או בבקבוק המכיל קפיץ כדי לאפשר אוורור מספיק.בצעו תרבית של התאים למשך 35 עד 40 שעות בטמפרטורה של 30 degrees Celsius ובמהירות של 250 RPM. כאשר התרבית מוכנה, ניתן יהיה לראות את מקטעי המיצליום והנבגים באמצעות מיקרוסקופיית ניגודיות פאזה (phase contrast) בהרכבה נוזלית. סנטריפוגו מיליליטר אחד מהתרבית בסנטריפוגת שולחנית ב-400 times G למשך דקה אחת כדי להשקיע את המיצליום ואת מקטעי התאים הגדולים יותר.לאחר מכן, העבירו כ-300 microliters של הנוזל העליון המכיל תרחיף של נבגים לשפופרת 1.5 millimeter חדשה והניחו את השפופרת על קרח. שמרו את שאר תוצר המוצא לשימוש בשלב מאוחר יותר. לאחר מכן, דללו את הנבגים ביחס של 1:20 בתוספת מצע גידול, ושמרו את הנבגים המדוללים על קרח עד למועד השימוש בהם.שפכו את שארית מצע הגידול לכלי כימי (beaker) של 50 מיליליטר, לאחר מכן שאבו 10 מיליליטר באמצעות מזרק והשתמשו במסנן מזרק סטרילי של 22 מיקרומטר כדי לבצע סטריליזציה בסינון לשארית מצע הגידול. זאת על מנת להשיג מצע גידול מועשר משומש (spent supplemented growth medium) נקי מנבגים ומקטעי מיצליום. שמרו את מצע הגידול המועשר והמשומש המסונן למשך מספר ימים בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס במידה ויש לבצע ניסויים נוספים תחת תנאי גידול דומים.ניתן להשתמש בכל פלטה מיקרופלואידית עבור עד ארבעה ניסויים עצמאיים. כדי למנוע זיהום של תאי הזרימה שאינם בשימוש, ודאו שאתם משתמשים בתמיסות ובתנאי עבודה סטריליים בעת הקמת הניסוי. התחילו בהסרת תמיסת השילוח מהפלטה המיקרופלואידית.לאחר מכן, שטפו את הבארות באמצעות מצע גידול סטרילי מועשר. לאחר השטיפה, הוסיפו 300 µL של מצע גידול מועשר לכניסה של בארה אחת, ו-300 µL של מצע גידול מועשר משומש לבארות שתיים עד שש. לאחר מכן, טענו 40 µL של נבגים מדוללים לבארה שמונה של נתיב A ואטמו את המניפולטור לפלטה בהתאם להוראות היצרן.הפעילו את התוכנה לבקרת המיקרופלואידיקה ובחרו את סוג הפלטה המתאים. הגדירו תוכנית זרימה להזרמת מדיום מבארות הכניסה אחת עד חמש בלחץ של six psi למשך שתי דקות לכל בארה, וזאת כדי להכין (prime) את תעלת הזרימה ואת תא התרבית. לאחר מכן, הגדירו זרימה של מדיום גידול מועשר בלחץ של six psi לבאר כניסה אחת למשך שש שעות.פעולה זו תאפשר הנבטה וצמיחה וגטטיבית. הגדירו את התוכנית כך שאחרי שש שעות היא תעבור למצע גידול מועשר משומש ותזרים אותו לבארים שתיים עד חמש בלחץ של 6 psi למשך שאר הניסוי. חממו מראש את תא הסביבה ל-30 °C.לאחר מכן, הפעל את המיקרוסקופ ואת התוכנה לבקרת המיקרוסקופ. התקן עדשה שמןית עם מספר מפתח גבוה (high numerical aperture) ואשר שהמסננים והמראות הדיאגרמטיות המתאימים לרכישת תמונות בניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC), יחד עם המסננים לתמונות של חלבוני היתוך פלואורסצנטיים צהובים ואדומים, נמצאים במקומם. הנח טיפת שמן טבילה על העדשה וכן על התחתית של חלון הדימוי בלוח המיקרופלואידי.הצמד בזהירות את המכשיר המיקרופלואידי האטום על במה של המיקרוסקופ ההפוך ואבטח אותו במקומו. השתמש בסימני המיקום המוטמעים כדי להביא את חלון הדמיה של תא התרבית המיקרופלואידי למיקוד. התמקד בחלק השמאלי ביותר של תא הזרימה הראשון המסומן באות A, ולאחר מכן הזז את הבמה למלכודת בגודל חמש, המתאימה לגובה מלכודת של 7 micrometers.בתוכנת המיקרופלואידיקה, הגדירו את המערכת כך שתטען תאים מבאר הכניסה השמינית בלחץ של 4 psi למשך 15 שניות. לאחר הרצת התהליך, בדקו את צפיפות התאים בתא התרבית על ידי הזזת הבמה לאורך חלון ההדמיה. אם לא נלכדו נבגים, חזרו על שלב טעינת התאים או לחלופין, הגבירו את לחץ ו/או זמן הטעינה עד להשגת צפיפות התאים הרצויה של נבג אחד עד 10 נבגים לכל חלון הדמיה.יש להקפיד על מניעת העמסה יתרה של תא התרבית. לאחר מכן, הפעילו את תוכנית הזרימה שהוכנה מראש בתוכנת הבקרה, והמתינו שעה אחת לאיזון תרמי של הפלטה המיקרופלואידית עלבמת המיקרוסקופ לפני תחילת רכישת התמונות. בתוכנת הבקרה של המיקרוסקופ, הגדירו רכישה רב-ממדית לצילום תמונות מרובות במיקומים שונים של הבמה לאורך זמן, על ידי הגדרת תיקייה לשמירה אוטומטית של קובצי התמונה.בשלב הבא, עברו להגדרות התאורה והזינו את הגדרות התאורה האופטימליות שנקבעו מראש עבור כל מבנה ספציפי. לאחר מכן, הגדירו סדרת זמן לרכישת תמונות בכל 40 דקות למשך 24 שעות. כדי לקבוע את מיקומי הבמה ולהגדיר את הפוקוס האוטומטי, סרקו את תא התרבית ושמרו את מיקומי הבמה עבור כל נקודת דימוי רלוונטית.יש לוודא כי המיקומים של הבמה בשלב הבודד מרוחקים מספיק זה מזה כדי למזער פוטו-bleaching (הלבנה פוטוכימית) ורעילות פוטוכימית. לאחר אימות קואורדינטות ה-Z של מיקומי הבמה שנבחרו, הפעילו את המיקוד האוטומטי (autofocus) של החומרה. לאחר מכן, התחילו את ניסוי ה-time-lapse בתוכנת הבקרה של המיקרוסקופ.עצרו את רכישת התמונות לאחר 24 עד 30 שעות, או כאשר ההיפים באזור העניין התמיינו לנבגים. לאחר מכן, הפסיקו את תוכנית הזרימה בתוכנה ופרקו את המכשיר המיקרופלואידי. הכינו את הפלטה המיקרופלואידית ששימשה לניסוי לאחסון לטווח קצר על ידי הסרת שאריות המצע מבארות הכניסה, מבאר הפסולת ומבאר טעינת התאים.לאחר מכן, מלאו את הבארות ששימשו בנתיב A ואת הבארות בנתיבים שלא נעשה בהם שימוש ב-PBS סטרילי. לבסוף, אטמו את הפלטה בעזרת סרט Parafilm כדי למנוע התייבשות. ואחסנו את הפלטה בטמפרטורה של 4 °C.דימוי מוצלח של תאים חיים לאורך כל מחזור החיים של *S.venezuela* מספק סדרה של תצפיות רציפות בזמן, הכוללת את שלבי הפיתוח המרכזיים של נבט, גדילה וגיטטרה (sporulation). במהלך הנבט או הגדילה, DivIVA-mCherry מצטבר באופן בלעדי בקצות ההיפים הגדלים או מסמן נקודות פיצול של היפים שנוצרו לאחרונה. לעומת זאת, FtsZ-YPet יוצר מבנים דמויי טבעת בודדים במרווחים לא סדירים במיצליום הגדל.מבנים אלה מספקים את הפיגום עבור סינתזה של דפנות רוחביות וגיטטיביות לא-בנאיות, המובילה להיווצרות של מדורי היפות מקושרים. בהיפות בשלב הספורולציה, תבנית הלוקליזציה של FtsZ-YPet משתנה באופן דרמטי. ראשית, פילמנטים הלייקליים של FtsZ-YPet נעים לאורך ההיפה, ואז, באירוע פתאומי וכמעט סינכרוני, סלילים אלו מתאחדים לסולם של טבעות FtsZ-YPet במרווחים קבועים.לבסוף, מחיצות הספורולציה (sporulation septa) הופכות גלויות בתמונות ה-differential interference contrast ובסופו של דבר, הנבגים החדשים משתחררים. טכניקה זו מספקת פרוטוקול חסון לביצוע דימוי של תאים חיים לאורך כל מחזור החיים של ה-Streptomyces. המערכת המיקרופלואידית היא קלה לשימוש.הוא מציע גמישות ניסויית ומאפשר ניטור ארוך טווח. מערך ניסויי זה מהווה גם נקודת התחלה מצוינת לחקירת אירועי התפתחות ספציפיים בתגובה לתנאי תרבית משתנים, או לשימוש בצבעים פלואורסצנטיים לצורך ניטור סינתזה של peptidoglycan או ויזואליזציה של ארגון הכרומוזומים.

fluorescence-time-lapse-imaging-complete-s-venezuelae-life-cycle

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

Mesoscopic הקרינה טומוגרפיה פועלת מעבר לגבולות חדירה של מיקרוסקופיה רקמות חתך פלואורסצנטי. הטכניקה מבוססת על תאורה השלכה רב ותיאור תחבורה פוטון. אנו להדגים ב-vivo כל הגוף 3D להדמיה של המורפוגנזה ה-GFP-לבטא דיסקים דמותי האגף...

Mesoscopic Fluorescence טומוגרפיה עבור In-vivo הדמיה של פיתוח תסיסנית</em

הדמיה ג elegans עוברים באמצעות מיקרוסקופ Epifluorescent ותוכנות קוד פתוח

מכשיר microfluidic פשוט פותח כדי לבצע הרדמה...

התקני microfluidic פשוטים עבור<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של<em&gt; ג elegans</em&gt;,<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ודג זברה

מקור: Schlimpert, S. et al. הדמיית זמן-lapse פלואורסצנטית של מחזור החיים השלם של S. venezuelae באמצעות מכשיר מיקרופלואידי. J. Vis. Exp. (2016)סרטון זה מדגים הדמיית זמן-lapse פלואורסצנטית של מחזור החיים המלא של החיידק Streptomyces venezuelae באמצעות מכשיר מיקרופלואידי כדי להמחיש נביטה, צמיחת קורים ונבגים בזמן אמת.

הדמיית זמן-lapse פלואורסצנטית של מחזור החיים של Streptomyces venezuelae

מקור: Winkle, C. C., et al. שימוש במתודולוגיות משולבות להגדרת תפקיד אספקת קרום הפלזמה במהלך הסתעפות אקסון ומורפוגנזה עצבית. J. Vis. Exp. (2016)סרטון זה מדגים מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת (TIRF) להמחשת אירועים אקסוציטיים בנוירונים בקליפת המוח. סמן חלבון פלואורסצנטי ירוק רגיש ל-pH (GFP) זוהר עם איחוי שלפוחית, עם עירור TIRF סלקטיבי הלוכד אקסוציטוזיס קרום-פרוקסימלי בהדמיית זמן-lapse.

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת להדמיה של אירועים אקזוציטיים 

המטרה של פרוטוקול זה היא להדגים כיצד לפקח דינמיקת fluorescently- מתויג חלבון על משטחי תא צמח עם מיקרוסקופיה epifluorescence זווית משתנה, מראה מהבהב נקודות של PATROL1 מתויג GFP, חלבון סחר קרום, בקליפת התא של המתחם הפיוניות ב thaliana ארבידופסיס.

הדמיה של Dynamics שטח תא הצמח עם זווית משתנה epifluorescence מיקרוסקופית בזמן אמת

הדמית morphogenesis של עוברי חרק עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי מבוסס אור גיליון הפכה מדינה של האמנות. פרוטוקול זה מתאר ומשווה שלוש טכניקות הרכבה מתאימות עובר Tribolium castaneum, מציג שני קווים מהונדסים רומן מחוייט גם מתאים הדמיה חיה, דן בקרות איכות חיוניות ומציין מגבלות ניסוי נוכחיות.

גיליון מבוסס אור מיקרוסקופ פלואורסצנטי של חיים או קבוע מוכתמת<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; עובר

הבנת תפקידה של תהליכים חיוניים של חיידקים הוא מאתגר. קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ עם צבעי במטרה יכול לספק תובנות מפתח לתוך התא מיקרוביאלי התקדמות וצמיחה של מחזור התא. כאן, Agrobacterium tumefaciens משמש חיידק דגם כדי לסמן שיטות הדמיה תא חי פלואורסנציה לאפיון תהליכים חיוניים.

חיים התא מיקרוסקופ פלורסצנטיות לבחון תהליכים חיוניים במהלך צמיחת תאים מיקרוביאלי

מוצג כאן פרוטוקול המתאר ניטור של מחזור החיים המלא של חיידק טורף Bdellovibrio bacteriovorus באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצני זמן לשגות בשילוב עם כרית agarose ומנות הדמיה תא.

הדמיה חיה של מחזור החיים של החיידק טורף Bdellovibrio bacteriovorus באמצעות מיקרוסקופית פלואורסצני זמן לשגות

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מבוססת יריעות אור היא הכלי בעל הערך הרב ביותר בביולוגיה התפתחותית. נושא מרכזי במחקרים השוואתיים הוא שונות הסביבה. הפרוטוקול שלנו מתאר מסגרת ניסיונית להדמיה חיה בו זמנית של דגימות מרובות, ולכן מטפל בנושא זה באופן פעיל.

הדמיה חיה בו זמנית של עוברי חרקים מרובים במיקרוסקופים פלואורסצנטיים מבוססי גיליון אור קאמרית לדוגמה

למד מיקרוסקופיית פלואורסצנציה בזמן אמת לחקירת מחזור החיים של Streptomyces venezuelae באמצעות מכשיר microfluidic. שיטה זו מאפשרת תצפית ישירה על התמיינות תאים ותהליכי ספורולציה בחיידקים פילמנטיים.

זמן לשגות הדמיה הקרינה של השלם

גלה סרטונים נוספים