מדידות מרחבים של זלוף, לחצו נוזלי ביניים ו ליפוזומים צבירה בגידולים מוצקים

המטרה הכללית של ניסוי זה היא לקשר בין הצטברות של ננו-טיפולים בתוך הגידול לבין תכונות הסביבה המיקרוסקופית של הגידול, כולל מיקרו-סירקולציית הגידול והלחץ התוך-רקמתי המוגבר, או IFP. שיטה זו מאפשרת לנו לענות על שאלות חשובות בנוגע לננו-תרופות. שאלות כגון: מה גורם לספיגה הטרוגנית של ננו-חלקיקים בתוך גידול?

היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת מיפוי מרחבי משותף של תכונות מיקרו-סביבת הגידול וההתפלגות הפנים-גידולית של ננו-חלקיקים. לאחר אישור רמת ההרדמה המתאימה באמצעות topenge, יש למרוח פומדה על עיני העכבר ולהדביק את גפיו של בעל החיים במצב שכיבה על הבטן על לוח פלסטיק דק. לאחר מכן, יש להחדיר קטטר מותאם במידה 27-gauge המחובר לקטע של 20 סנטימטרים של צינור PE10 לווריד הזנב הלטרלי (הצידי) ולהבטיח את הצינור באמצעות מספר חתיכות סרט הדבקה.

כעת, מלאו מזרק של 1 מיליליטר עם לפחות 200 µL של ליפוזומים לטומוגרפיה ממוחשבת (CT), ומזרק נוסף של 1 מיליליטר עם לפחות 150 µL של תערובת של iohexol חופשי עם סליין ביחס של 9:1 לפי נפח. הניחו את המזרק עם הליפוזומים ל-CT במזרק חשמלי (syringe pump) וחברו את הקטטר למזרק, כאשר קצב ההזרקה מוגדר ל-600 µL לדקה, שווה ל-10 µL לשנייה. לאחר מכן, הניחו את העכבר על מיטת סורק ה-micro CT והשתמשו במערכת מיקום הלייזר כדי לדייק את מיקום הגידול, כך שיהיה באותה אוריינטציה בקירוב בכל סריקה.

בשימוש בתוכנת קונסולת סורק ה-CT עבור כל פרוטוקול דימות רלוונטי, בחרו ב-bright dark מהתפריט הנפתח ולחצו על כפתור הסריקה כדי להתחיל את הכיול ולאתחל את המערכת. כדי לקבל micro CT אנטומי נפחי של הגידול לפני הזרקת חומר ניגוד, בדקו תחילה את מחוון תוכנת קונסולת סורק ה-CT כדי לוודא שמנגנוני הבטיחות של סורק ה-CT שוחררו. לאחר מכן, בחרו בסריקה המשתמשת באנרגיית קרני רנטגן של 80 kilovolts, זרם שפופרת של 70 milliamps ולוכדת 1,000 היטלי תמונה.

לאחר מכן, התחילו את הסריקה. עם סיום הסריקה, הגדירו את המשאבה להזרקת כ-150 µL של תמיסת הליפוזומים ולחצו על כפתור ההפעלה כדי להזריק את הבולוס של ליפוזומי CT בריכוז של 55 mg יוד ל-mL של תמיסה. שטפו ידנית את הקתטר עם 50 µL של סליין כדי להבטיח שכל כמות חומר הליפוזומים הוזרקה ושהקתטר התנקה.

לאחר 10 דקות, בצעו סריקה אנטומית שנייה של הגידול, כפי שהודגם כעת. כדי לבצע DCE-CT, הכניסו מזרק עם תמיסת iohexol חופשית למשאבת המזרקים והגדירו את המשאבה להזרקת 100 µL של iohexol באותו קצב הזרקה. נפחי הזרקה אלו גבוהים מהסטנדרט של 200 µL, אך בעלי החיים מנוטרים במהלך ההתאוששות ולא נצפו תופעות לוואי.

לאחר מכן, בלוח הבקרה של סורק ה-CT, בחרו בסריקה דינמית של חמש דקות תוך שימוש באנרגיית רנטגן של 80 kilovolts ובזרם שפופרה של 90 milliamps, כפי שהודגם זה עתה, אשר לוכדת 416 היטל תמונה בכל שנייה אחת במהלך 30 השניות הראשונות, ולאחריהן 416 היטל תמונה בכל 10 שניות. לכדו חמש שניות של נתוני DCE-CT, ולאחר מכן הפעילו את משאבת ההזרקה. בסיום הסריקה, בצעו סריקת micro CT אנטומית נפחית שלישית.

לאחר 48-70 שעות,וצרו תמונות CT אנטומיות של הליפוזומים תוך שימוש בהגדרות הנפחיות שהודגמו כעת. כדי למדוד את ה-IFP, הדביקו את בעל החיים על פלטפורמת רובוט ה-CT IFP כך שהגידול יהיה מקובע ונגיש למערכת רובוט ה-CT IFP. בצעו סריקת micro CT אנטומית כפי שהודגם כעת.

לאחר מכן, טען את נתוני טרום-החדרת המחט לתוכנת יישור הרובוט של CT IFP וכוון את החלון והרמה (window and level) כדי להדמיה של הגידול. לחץ על שפת הגידול בכל תמונה, ולאחר מכן בחר מיקום שני על השפה בצד הסמוך של הגידול. התוכנה תחשב סדרה של מיקומים לאורך קו לינארי בין שתי הנקודות.

לאחר מכן, בחרו מהרשימה את קואורדינטות X, Y ו-Z עבור סדרה של חמש עד שמונה מיקומים במרווחים שווים. לאחר מכן, שטפו את מחט מערכת ה-IFP בתמיסת סלין-הפרין והזינו את מיקומי המחט הראשונים שנקבעו מראש לחלונויות הקואורדינטות X, Y, Z של תוכנת הבקרה של רובוט ה-CT IFP. לחצו על כפתור ה-go כדי להזיז את הרובוט למיקום הרצוי.

לאחר מכן, עבור כל מיקום מחט בתורו, לחצו על כפתור השחלת המחט כדי להחדיר את המחט לרקמה. לחצו ושחררו את צינור ה-PE20 כדי לוודא זרימת נוזלים תקינה בין מחט ה-IFP לרקמה, ואמרו כי מדידת ה-IFP עולה וחוזרת לערך שלפני הלחיצה בתוכנת רכישת ה-IFP. לבסוף, בצעו סריקת CT אנטומית כאשר המחט מושחלה, ולחצו על כפתור נסיגת המחט בסיום הסריקה כדי להוציא את המחט מהרקמה.

בחירת אזור עניין (ROI) בתוך הגידול מניבה עקומת זמן/עצמה שניתן להשתמש בה כדי להפיק הערכות כמותיות של פרמטרים המודינמיים נבחרים בגידול. חלוקת נפח הגידול למספר אזורי עניין שווים בגודלם מאפשרת כימות של ההתפלגות המרחבית של פרמטרים אלו בתוך נפח הגידול. ניתן להבחין גם בהתפלגות הביולוגית של הליפוזומי CT ב-48 שעות לאחר ההזרקה.

כפי שצוין, החומר עדיין זורם במערכת הדם, כאשר נצפתה ספיגה משמעותית בטחול ובכבד. ההצטברות של ליפוזומי CT אלו בתוך הגידול היא הטרוגנית, עם הצטברות דומיננטית פריפריאלית בהשוואה למרכז רקמת הגידול. ניתן לזהות בבירור את המחט באמצעות micro CT ברזולוציה גבוהה, מה שמאפשר מיקום מרחבי של מדידות ה-IFP בתוך נפח הגידול.

מדידה הממוקמת במרחב באופן משותף (co-localized) של הפרופוזיה (profusion) ושל שבר נפח הפלזמה מדגימה מתאם משמעותי עם הצטברות תוך-גידולית של ליפוזומי CT בגידולים תת-עוריים. יתרה מכך, ההתפלגות הרדיאלית של ה-IFP נמצאת במתאם עם המדידות ההמודינמיות האחרות, מה שמרמז על קשר מרחבי/זמני מורכב בין המיקרו-סירקולציה של הגידול, ה-IFP וההצטברות התוך-גידולית של הליפוזומים. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לקבע את בעל החיים על מיטת הסורק, כדי להבטיח תנועה מינימלית של הגידול בין מדידות ה-IFP.

להשלכות של עבודה זו יש השפעה על פיתוח טיפולים חדשים. הובלה של ננו-חלקיקים היא שלב ראשון מרכזי בבניית טיפולים יעילים המבוססים על ננו-רפואה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להחזיק בהבנה טובה של האופן שבו ניתן למפות מרחבית את לחץ הנוזל הבין-תאי בגידול, את מיקרו-סירקולציית הגידול ואת התפלגות הננו-חלקיקים.