A-תכולה גבוהה במבחנה פלטפורמת Discovery הלבלב איילט β-cell שכפול

המטרה הכוללת של פלטפורמת סינון שכפול תאי בטא בעלת תכולה גבוהה, היא להקל על חקירת המסלולים המולקולריים המגבילים את צמיחת תאי הבטא. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות חשובות בתחום הביולוגיה של תאי בטא. כגון אחת ממולקולות האיתות והמסלולים המרכזיים השולטים בהתחדשות תאי בטא.

היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא מאפשרת להגדיל את רירית התאים לתפוקה להערכה ספציפית ולמנתח הנתונים האוטומטי של שכפול תאי אי ראשוני. לשימוש בטכניקה זו יש פוטנציאל להתרחב לפיתוח הטיפול הרגנרטיבי לסוכרת. מחלה עם מחיר בריאותי וכלכלי כבד לחברה שלנו.

התחל בשימוש בתמיסת עיכול לבלב טעונה במזרק 10 מיליליטר המצויד במחט 22 כדי לדמות את צינור המרה המשותף בצומת של צינורות הכבד הציסטיים והרגילים או רק רחוק מהם. תומך בצינור המרה המשותף עם ידית אזמל, הזריק לאט 10 מיליליטר מהתמיסה. לאחר מתן כל הקולגנאז, השתמשו במלקחיים מעוקלים ובמספריים כדי להפריד את הלבלב המנופח מהמעי הגס, המעיים, הקיבה והשדרה היורדים.

לאחר מכן הניחו עד שני לבלב בצינור של 50 מיליליטר על קרח המכיל חמישה מיליליטר תמיסת עיכול לבלב. לאחר איסוף כל הלבלב, הכניסו את צינורות העיכול לאמבטיית מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות עם מערבולת עדינה כל שלוש דקות. בתום העיכול, יש לנער במרץ את הצינורות אנכית 10 פעמים.

והוסף 10 מיליליטר של מאגרי כביסה קרה לדגימות. לנער במרץ את הצינורות חמש פעמים נוספות ולהניח אותם על קרח. לאחר מכן, מלאו את הצינורות לנפח סופי של 50 מיליליטר עם מאגר כביסה קרה והפכו את הצינורות חמש פעמים.

לאחר מכן סובבו את הטישו ושפכו את הסופרנטנטים, תוך הקפדה לא לעקור את הכדורים. השעו מחדש את תמיסת הרקמות ב-25 מיליליטר של מאגר כביסה ואחריו מערבולת עדינה. חזור על שלבי הסיבוב והמתלה מחדש פעמיים נוספות.

יוצקים את תרחיפי הרקמה דרך מסננת רקמה של 30 רשת לכוס סטרילית של 250 מיליליטר. שטפו את צינורות העיכול עם 20 מיליליטר נוספים של מאגר כביסה ושפכו את השטיפות על הרשת כדי להסיר את רקמות הלבלב והשומן הלא מעוכלות. חלקו את החומר המסונן בין שני צינורות חדשים של 50 מיליליטר וגלו את הרקמה באמצעות צנטריפוגה.

לאחר מכן שפכו את הסופרנטנט והפכו את הצינורות כדי לנקז את המאגר העודף. כדי לטהר את האיים, הוסף 20 מיליליטר של שיפוע צפיפות קור לכדורי רקמת הלבלב והזין בעדינות למעלה ולמטה חמש פעמים כדי להשעות מחדש את התוכן באופן הומוגני. לאחר מכן, כיסו לאט לאט 10 מיליליטר של HBSS לאורך הדופן של כל צינור של שיפוע, תוך הקפדה על ממשק נוזלי חד והפרדת תאי הלבלב על ידי צנטריפוגה.

השתמש בפיפט של 10 מיליליטר כדי להעביר את שכבת האי מהממשק לצינורות חרוטיים חדשים של 50 מיליליטר. לאחר מכן שטפו את האיים ב-40 עד 50 מיליליטר של מאגר כביסה שלוש פעמים. היפוך הצינורות שלהם כדי להשעות מחדש את הכדורים בין כל צנטריפוגה.

לאחר הכביסה הסופית, הכניסו את הצינורות למכסה המנוע של תרבית רקמות. שאפו את הסופרנטנט. ולהשעות מחדש את הכדורים בשישה מיליליטר של מדיום אי.

מסננים את האיים מכל צינור בבארות בודדות של שש צלחת תרבית רקמות באר. וסובב את הצלחת כדי לאסוף את האיים באמצע הבארות. העריכו את טוהר האי תחת המיקרוסקופ.

כדי לטהר עוד יותר את האיים, אספו אותם באמצעות פיפט מיליליטר אחד והעבירו לבאר הסמוכה באמצעות שישה מיליליטר של מדיום אי. חזור על מערבולת האיים, איסוף, העברה והערכה מיקרוסקופית עד להשגת טוהר של יותר מ-90 אחוז. לאחר מכן, העבירו את האיים לצלחת תרבית רקמה אחת של 10 סנטימטר המכילה 20 מיליליטר מדיום אי.

לאחר שנקטפו כל האיים, הניחו את צלחת התרבות באינקובטור תרבית רקמה למשך הלילה. לאחר מכן מצפים את הבארות של צלחת 384 באר ב -40 מיקרוליטר של 804 גרם, מדיום ממוזג לכל באר ומניחים את הצלחת בחממה למשך הלילה. למחרת, השתמש במגרד תאים כדי לנתק בעדינות את האיים.

לאחר מכן העבירו את האיים לצינור של 50 מיליליטר. אוספים את האיים על ידי צנטריפוגה. לאחר מכן שטפו אותם עם 20 מיליליטר p, b, s חמים.

צנטריפוגה למשך דקה. שאפו את הסופרנטנט. ולהשעות מחדש את הגלולה באפס נקודה שתיים, חמישה אחוז טריפסין.

דגרו על האיים במשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמצעות פיפט של מיליליטר אחד כדי לשאוב ולחלק את האיים 10 פעמים בחמש ו-10 דקות. לאחר הטריטרציה השנייה, ספרו דגימה של 20 מיקרוליטר מתאי האי הטריפסיניים. אם הרקמות מתעכלות במלואן, השעו את תאי האי הדיסוציאטיביים בארבע נקודות חמש כפול עשר לארבעה תאים לריכוז מיליליטר במדיום תפקוד האי.

לאחר מכן השתמש בשואב סעפת 12 באר כדי להסיר את מדיום המצב 804G מצלחת הבאר 384 שהוכנה בעבר. ומסננים 70 מיקרוליטר של איים לבאר לשורות c עד n בעמודות 4 עד 21. אפשר לאיים להיצמד לחממת תרבית הרקמה למשך 48 שעות.

לאחר יומיים, השתמש בשואב סעפת 12 בארות כדי להסיר בזהירות את מדיום האי והשתמש בפיפט 12 תעלות כדי להוסיף 35 מיקרוליטר של מדיום פונקציית איים לכל באר. לאחר מכן העבירו 35 מיקרוליטר משני הפתרונות המורכבים הטריים שהוכנו לכל באר. והחזירו את האיים לחממה למשך 48 שעות נוספות.

לאחר 48 שעות, תקנו, צבעו ונתחו את תרביות האיים שטופלו בתרכובת באמצעות פלטפורמת הדמיה אוטומטית בעלת תוכן גבוה. בניסוי טיפוסי, קצב השכפול של תאי בטא DAPI, PD-1 ותאי בטא חיוביים לאינסולין נקבע על ידי אחוז תאי הבטא המבטאים במשותף את Ki-67. שכפול תאי אלפא נמדד כאחוז התאים החיוביים ל-DAPI, PD שלילי, גלוקגון חיובי, Ki-67 המבטאים במשותף.

לדוגמה, בניסוי מייצג זה, Dipryridamole נצפה כמקדם שכפול של תאי בטא אך לא אלפא. ניתן להשלים טכניקה זו תוך שבעה ימים. בעקבות הליך זה ניתן לחקור תרכובות שבשכפול תאי הבטא כדי לחשוף את מנגנוני הפעולה.

טכניקה זו אפשרה לחוקרים בתחום הביולוגיה של תאי בטא לזהות גורמי איתות ומסלולים חדשים המווסתים את צמיחת תאי הבטא. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבדוק את יכולתן של מולקולות קטנות לעורר התחדשות סלקטיבית של תאי בטא.