Name: A-תכולה גבוהה במבחנה פלטפורמת Discovery הלבלב איילט β-cell שכפול (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: חקור שיטת סקרנינג תוכן גבוה לזיהוי מולקולות קטנות המעודדות שכפול תאי β באיי הלבלב. שיטה זו מאפשרת ניתוח אוטומטי של נתוני שכפול תאים ומאיצה מחקר בביולוגיית תאי β ובתרפיות רגנרטיביות לסוכרת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIDDK DK098143 ו-DK101530 מה-NIH (JPA), מכון המחקר לבריאות הילד בספקטרום של סטנפורד (CHRI) ו-SPARK (UL1 TR001085, JPA).

<ol><li>Butler, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-cell+deficit+and+increased+beta-cell+apoptosis+in+humans+with+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes.</a> Diabetes. 52 (1), 102-110 (2003).</li>
<li>Kloppel, G., Lohr, M., Habich, K., Oberholzer, M., Heitz, P. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+pathology+and+the+pathogenesis+of+type+1+and+type+2+diabetes+mellitus+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Surv+Synth+Pathol+Res%22%5BJournal%5D)">Islet pathology and the pathogenesis of type 1 and type 2 diabetes mellitus revisited.</a> Surv Synth Pathol Res. 4 (2), 110-125 (1985).</li>
<li>Harlan, D. M., Kenyon, N. S., Korsgren, O., Roep, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+advances+and+travails+in+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Current advances and travails in islet transplantation.</a> Diabetes. 58 (10), 2175-2184 (2009).</li>
<li>Nath, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outcomes+of+pancreas+transplants+for+patients+with+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transplant%22%5BJournal%5D)">Outcomes of pancreas transplants for patients with type 2 diabetes mellitus.</a> Clin Transplant. 19 (6), 792-797 (2005).</li>
<li>Nichols, R. J., New, C., Annes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+tissue+sources+for+new+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Adult tissue sources for new beta cells.</a> Transl Res. 163 (4), 418-431 (2014).</li>
<li>Pagliuca, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+human+pancreatic+beta+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro.</a> Cell. 159 (2), 428-439 (2014).</li>
<li>Kushner, J. A., MacDonald, P. E., Atkinson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+to+insulin+secreting+cells%3A+two+steps+forward+and+now+a+time+to+pause%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stem cells to insulin secreting cells: two steps forward and now a time to pause.</a> Cell Stem Cell. 15 (5), 535-536 (2014).</li>
<li>Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+pancreatic+beta-cells+are+formed+by+self-duplication+rather+than+stem-cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation.</a> Nature. 429 (6987), 41-46 (2004).</li>
<li>Meier, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-cell+replication+is+the+primary+mechanism+subserving+the+postnatal+expansion+of+beta-cell+mass+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Beta-cell replication is the primary mechanism subserving the postnatal expansion of beta-cell mass in humans.</a> Diabetes. 57 (6), 1584-1594 (2008).</li>
<li>Chick, W. L., Lauris, V., Flewelling, J. H., Andrews, K. A., Woodruff, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+glucose+on+beta+cells+in+pancreatic+monolayer+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Effects of glucose on beta cells in pancreatic monolayer cultures.</a> Endocrinology. 92 (1), 212-218 (1973).</li>
<li>Brelje, T. C., Sorenson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+prolactin+versus+growth+hormone+on+islet+B-cell+proliferation+in+vitro%3A+implications+for+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Role of prolactin versus growth hormone on islet B-cell proliferation in vitro: implications for pregnancy.</a> Endocrinology. 128 (1), 45-57 (1991).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDGF+signalling+controls+age-dependent+proliferation+in+pancreatic+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PDGF signalling controls age-dependent proliferation in pancreatic beta-cells.</a> Nature. 478 (7369), 349-355 (2011).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+synthase+kinase-3+and+mammalian+target+of+rapamycin+pathways+contribute+to+DNA+synthesis%2C+cell+cycle+progression%2C+and+proliferation+in+human+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Glycogen synthase kinase-3 and mammalian target of rapamycin pathways contribute to DNA synthesis, cell cycle progression, and proliferation in human islets.</a> Diabetes. 58 (3), 663-672 (2009).</li>
<li>Metukuri, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChREBP+mediates+glucose-stimulated+pancreatic+beta-cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">ChREBP mediates glucose-stimulated pancreatic beta-cell proliferation.</a> Diabetes. 61 (8), 2004-2015 (2012).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+chemical+screen+reveals+that+harmine-mediated+inhibition+of+DYRK1A+increases+human+pancreatic+beta+cell+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">A high-throughput chemical screen reveals that harmine-mediated inhibition of DYRK1A increases human pancreatic beta cell replication.</a> Nat Med. 21 (4), 383-388 (2015).</li>
<li>Schisler, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+human+and+rat+islet+beta-cell+proliferation+with+retention+of+function+by+the+homeodomain+transcription+factor+Nkx6.1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Stimulation of human and rat islet beta-cell proliferation with retention of function by the homeodomain transcription factor Nkx6.1.</a> Mol Cell Biol. 28 (10), 3465-3476 (2008).</li>
<li>Fueger, P. T., Hernandez, A. M., Chen, Y. C., Colvin, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+replication+and+beta+cell+function+in+adenovirally-transduced+isolated+rodent+islets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assessing replication and beta cell function in adenovirally-transduced isolated rodent islets.</a> J Vis Exp. (64), (2012).</li>
<li>Walpita, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+islet+cell+culture+system+for+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">A human islet cell culture system for high-throughput screening.</a> J Biomol Screen. 17 (4), 509-518 (2012).</li>
<li>Miyazaki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+pancreatic+beta+cell+line+that+retains+glucose-inducible+insulin+secretion%3A+special+reference+to+expression+of+glucose+transporter+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Establishment of a pancreatic beta cell line that retains glucose-inducible insulin secretion: special reference to expression of glucose transporter isoforms.</a> Endocrinology. 127 (1), 126-132 (1990).</li>
<li>Song, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+and+inactivation+of+glycogen+synthase+kinase+3beta+%28GSK3beta%29+by+dual-specificity+tyrosine+phosphorylation-regulated+kinase+1A+%28Dyrk1A%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation and inactivation of glycogen synthase kinase 3beta (GSK3beta) by dual-specificity tyrosine phosphorylation-regulated kinase 1A (Dyrk1A).</a> J Biol Chem. 290 (4), 2321-2333 (2015).</li>
<li>Hohmeier, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+INS-1-derived+cell+lines+with+robust+ATP-sensitive+K%2B+channel-dependent+and+-independent+glucose-stimulated+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K+ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion.</a> Diabetes. 49 (3), 424-430 (2000).</li>
<li>Cozar-Castellano, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+from+the+first+comprehensive+molecular+characterization+of+cell+cycle+control+in+rodent+insulinoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Lessons from the first comprehensive molecular characterization of cell cycle control in rodent insulinoma cell lines.</a> Diabetes. 57 (11), 3056-3068 (2008).</li>
<li>Efrat, S., Fusco-DeMane, D., Lemberg, H., aL Emran, O., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+transformation+of+a+pancreatic+beta-cell+line+derived+from+transgenic+mice+expressing+a+tetracycline-regulated+oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Conditional transformation of a pancreatic beta-cell line derived from transgenic mice expressing a tetracycline-regulated oncogene.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (8), 3576-3580 (1995).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+small-molecule+inducers+of+pancreatic+beta-cell+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of small-molecule inducers of pancreatic beta-cell expansion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (5), 1427-1432 (2009).</li>
<li>Annes, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenosine+kinase+inhibition+selectively+promotes+rodent+and+porcine+islet+beta-cell+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Adenosine kinase inhibition selectively promotes rodent and porcine islet beta-cell replication.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (10), 3915-3920 (2012).</li>
<li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repurposing+cAMP-modulating+medications+to+promote+beta-cell+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Repurposing cAMP-modulating medications to promote beta-cell replication.</a> Mol Endocrinol. 28 (10), 1682-1697 (2014).</li>
<li>Chen, C. A., Carolan, P. J., Annes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+screening+for+secreted+proteins+that+modulate+glucose+handling+identifies+interleukin-6+family+members+as+potent+hypoglycemic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo screening for secreted proteins that modulate glucose handling identifies interleukin-6 family members as potent hypoglycemic agents.</a> PLoS One. 7 (9), e44600(2012).</li>
<li>Izumi, K., Hirao, Y., Hopp, L., Oyasu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+induction+of+ornithine+decarboxylase+in+urinary+bladder+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro induction of ornithine decarboxylase in urinary bladder carcinoma cells.</a> Cancer Res. 41 (2), 405-409 (1981).</li>
<li>Serup, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+homeodomain+protein+IPF-1%2FSTF-1+is+expressed+in+a+subset+of+islet+cells+and+promotes+rat+insulin+1+gene+expression+dependent+on+an+intact+E1+helix-loop-helix+factor+binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">The homeodomain protein IPF-1/STF-1 is expressed in a subset of islet cells and promotes rat insulin 1 gene expression dependent on an intact E1 helix-loop-helix factor binding site.</a> Biochem J. 310, (Pt 3) 997-1003 (1995).</li>
<li>Szabat, M., Luciani, D. S., Piret, J. M., Johnson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+adult+beta-cells+revealed+using+a+Pdx1%2Finsulin+dual-reporter+lentivirus%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Maturation of adult beta-cells revealed using a Pdx1/insulin dual-reporter lentivirus.</a> Endocrinology. 150 (4), 1627-1635 (2009).</li>
<li>Rieck, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+hepatocyte+nuclear+factor-4alpha+initiates+cell+cycle+entry%2C+but+is+not+sufficient+to+promote+beta-cell+expansion+in+human+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Overexpression of hepatocyte nuclear factor-4alpha initiates cell cycle entry, but is not sufficient to promote beta-cell expansion in human islets.</a> Mol Endocrinol. 26 (9), 1590-1602 (2012).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+mellitus--advances+and+challenges+in+human+beta-cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Diabetes mellitus--advances and challenges in human beta-cell proliferation.</a> Nat Rev Endocrinol. 11 (4), 201-212 (2015).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

שיטות ניסיוניות ללימוד המסלולים המולקולריים השולטים צמיחת β-cell והתחדשות הן כלים חשובים לחוקרי סוכרת. בזאת, פלטפורמת הקרנה מבוססת עכברוש-איון לזהות ולאפיין לגירוי-מולקולה הקטנה של שכפול β-cell מוצג. בעוד רוב ההיבטים של פרוטוקול זה מבוצעים בקלות על ידי חוקרים מנוסים, כמה צעדים דורשים טכניקה מסוימת. ראשית, במהלך הבידוד איון, cannulation של-צינור המרה מבלי לשבש את שלמותה דורש תרגול. אסטרטגיה מועילה היא מינימאלי כדי...

סוכרת כוללת אוסף של הפרעות שיתוף הסוף-נקודה המשותפת של הומאוסטזיס הגלוקוז שבש. למרות מנגנוני פתוגניים של תת סוכרת הם ברורים, הם חולקים תוצאה של מסת β-cell ירד, כלומר, אובדן כושר אינסולין ייצור 1,2. נכון להיום, אסטרטגיות טיפול בסוכרת לסמוך על ממשל כרוני של אינסולין אקסוגני, גירוי תרופתי של ייצור אינסולין או שיפור רגישות לאינסולין, ולעתים נדיר, השתלת איי לבלב או 3,4 לבלב כולו. למרבה הצער, הצלחת יישום אסטרטגיה זו היא קצרת מועד ו / או לא מצליח לשחזר את הפונקציה מספיק של אינסולין אנדוגני. למרות התועלת של מפתחי שיטה לעורר התחדשות β-cell, אין גישה כזו. כתוצאה מכך, מטרת מחקר הסוכר עיקרית היא לפתח שיטות כדי ליצור תאי β חדשים או להרחיב המוני β-cell אנדוגני 5 </sup&gt;. למרות התחדשות β-cell ממקורות מתחדשים כמו תאי גזע עובריים היא מתקדמת, חששות בטיחות ויעילות להפוך את המרדף של אסטרטגיות חלופיות, כולל הרחבת β-תאים בוגרים, בעדיפות 6,7. חשוב לציין כי מקור השולט של תאי-β חדש in vivo הוא-תאי β קיימים ולא ובתאים מיוחדים 8,9. למרות β-תאים נראה שיש יכולת שכפולה מוגבלת, עלייה קטנה במסת β-cell (~ 30%) עשויים להיות מספיק כדי לשחזר הומאוסטזיס הגלוקוז אצל חולי סוכרת רבה. יתר על כן, בגירוי תרופתי באתרו של המוני β-cell אסטרטגיית טיפול זול וניתן להרחבה פוטנציאלי. בזאת שיטה גבוה הקרנת תוכן לזיהוי ואפיון מולקולות קטנות המעודדות צמיחת β-cell מוצגת. מגוון שיטות במבחנה ניסיונית עשוי לשמש לזיהוי מוצרי גן ו / או מולקולות that לקדם שכפול β-תא ראשוני. מאמצים מוקדמים למדידת שטף שכפול תאי β בשימוש תרבות pancreata מכרסמים עוברים או תרבויות איון מבודד ללא פגע למדוד [3 ח] התאגדות thymidine, התאגדות BrdU או גופי mitotic בתוך האוכלוסייה מוכתמת אלדהיד-thionine או אינסולין בתגובה לתנאי טיפול ספציפי 10, 11. גישות במבחנה אלה הגירסות וקרובות יש ממנו מספר מגבלות. ליקויים בולטים כוללים (1) שימוש בתאי עובר אשר, בניגוד β-תאים בוגרים, להציג קצב שכפול β-תאי בסיס גבוה והם צמיחה מוסדרת באופן מובהק 12; (2) אופי סובייקטיבי שפיטה הנסיין תלויות אירועים שכפולים β-cell; (3) את העבודה וזמן הטבע אינטנסיבי של ספירת הנסיין תלוי אירועים שכפולים β-cell מפגר תפוקה ניסיון; (4) שימוש התאגדות / כתם / מראה גרעיני לזהות שכפול אפילוts וכתם ציטופלסמית שאינה חופף לזהות β-תאים מובילים misattribution של אירועים שכפולים שאינו β-cell בסמוך בטאו תאים. לאחרונה β-תאים ראשוניים בוגרים שמשו להעריך את ההשפעה של transgene יתר הביטוי כמו גם טיפול מוצר או תרכובת גן על שכפול β-cell 13-16. עם זאת, מחקרים אלה גם יש לסמוך על ספירת סובייקטיבית של אירועים שכפול, cytoplasmic staining- או שאינו ספציפי שיטות לזיהוי β-cell ו / או צעדים עתירי עבודה כי להגביל את התפוקה, למשל, ציפוי שקופית היטב פרט של תאים או איון שלם הטבעת פרפין ועיבוד 17. יש לציין, מתודולוגיה הקרנה שכפולה β-תאים אנושיים מבוסס תמונה, דומה לזו המוצגת כאן, כבר פורסמה 18; עם זאת, שימוש מוצלח של assay זה לא הודגם ושימוש איי אדם להקרנה עיקרית לא יכול להיות רחב FEAsible. אסטרטגיה חלופית לזיהוי חומרים לקידום שכפול היא להעריך אינדוקציה הצמיחה של קווי β-cell. מאמצים ראשוניים המשמשים β-cell-קווי טרנספורמציה כגון min6 תאים או INS 832/13-תאי 14,19-21. עם זאת,-שורות תאים אלה להפגין צמיחה רסן לשאת מעט דמיון β-תאים מובחנים היטב 22. כתוצאה מכך, יכולת צמיחת אינדוקציה היא מינימאלית, של רלוונטיות ברורות ולפעמים קשה לשחזר. אסטרטגיה משופרת להקרנה מבוססת שורת תאים מנצלת &quot;טרנספורמציה הפיך&quot; תאים הנמצאים עצירת גדילה בהעדר טטרציקלין (דוקסיציקלין) ביטוי אנטיגן התלוי SV40 T 23,24. עם זאת, לא ברור אם תאים אלה לחזור למצב &quot;נורמלי&quot; β-דמוי תא עם הסרת דוקסיציקלין. למרבה הצער, שימוש בתאים אלה הניב תרכובות מקדמת גדילה כללית כי לא נראה שיש שתועלת מיידית24. באופן כללי, השימוש-שורות תאים ללמוד ויסות צמיחה של תאים מסוג מוצגים פעילות שכפולה ספונטנית מינימאלית עשוי להיות תחולה מוגבלת. פלטפורמת ההקרנה שהכפולה β-cell המוצגת כאן מנצלת עכברוש העיקרי בוגרים β-תאים לשמר ברגולציה של צמיחת vivo במידת ההאפשר, תרבויות תאי איון של רכב תא מסוג מעורב כדי לאפשר זיהוי של פעילויות לקידום צמיחה מוגבלת שושלת, רבה &quot;טוב עיצוב על מנת למקסם את תפוקת ניתוח אוטומטי לחסל הטיה ולהקל תפוקה. שימוש מוצלח של פלטפורמה זו אפשר זיהוי של מספר תרכובות המקדמות שכפול β-cell 25,26. בנוסף, assay שמש במשך מחקרי יחסי מבנה-פעילות וניסויי epistasis כימיים לספק תובנות מכניסטית לתוך תקנה המולקולרי של שכפול β-cell. הפלטפורמה הציג הותאמה בהצלחה FOr lentiviral RNAi מבוסס חקירת שכפול β-cell מסלולי 25. מגבלות של assay כוללות מוגבלות מדרגיות (שימוש של תאים ראשוניים), שימוש מכרסם ולא-תאי איון אדם (אם כי assay יכול להיות מותאם עבור מחקרי איון אדם), הוצאות הקשורות הדמיה מבוססת נוגדן ושימוש איון עיקרי, השימוש איים מפוזרים (אדריכלות איון שבש) כדי להקל על רכישה ותלות תמונה אוטומטיות על הזמינות של מיקרוסקופ אוטומטית עם רכישת תמונה ויכולת ניתוח. למרות מתודולוגיה הקרנה הקלילה in vivo לזיהוי מוצרי גנים או תרכובות מעודדי התחדשות β-cell באתרו תהיה אידיאלית, פלטפורמת דוגמת אינה זמינה עדיין 27. כתוצאה מכך, הפלטפורמה תארה מתאימה חוקר מעוניין לחקור את רוב ההיבטים של שכפול β-cell.

<table><tbody><tr><td>250 גרם זכר Sprague Dawly Rat</td><td>Charles River</td><td>Stain # 400</td><td></td></tr><tr><td>12 ס"מ שיניים tisuue מלקחיים</td><td>Fine Science Tools</td><td>11021-12</td><td></td></tr><tr><td>11.5 ס"מ מספריים עדינים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>מספריים כירורגיים 14.5 ס"מ</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>14001-14 16</td><td></td></tr><tr><td>ס"מ מלקחיים מעוקלים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>11003-16</td><td></td></tr><tr><td>12 ס"מ hepostat מעוגל</td><td>Fine Science Tools</td><td>13011-12</td><td></td></tr><tr><td>ידית אזמל 12 ס"מ</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>מסננת רקמות-30 רשת</td><td>Bellco Glass</td><td>1985-85000</td><td></td></tr><tr><td>Cizyme RI, 375,000 יחידות CDA</td><td>VitaCyte</td><td>005-1030</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח מאוזן של הנקס (Ca++ ו-Mg++)</td><td>Gibco</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>קטמין הידרוכלוריד (200 מ"ג/20 מ"ל)</td><td>JHP Pharmaceuticals</td><td>NDC# 42023-113-10</td><td>להכנת קוקטייל הרדמה&nbsp;</td></tr><tr><td>קסילזין (5 גרם/50 מ"ל)</td><td>LLOYD</td><td>NADA# 139-236</td><td>להכנת קוקטייל הרדמה&nbsp;</td></tr><tr><td>Histopaque 1077</td><td>Sigma</td><td>H-1077</td><td>להכנת Histopaque 1100</td></tr><tr><td>Histopaque 1119</td><td>Sigma</td><td>H-1119</td><td>להכנת Histopaque 1100</td></tr><tr><td>סרום עגל ניובורן 500 מ"ל</td><td>Hyclone</td><td>SH30118.03</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח מאוזנת של הנקס</td><td>Hyclone</td><td>SH30268.01</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Glucose בינוני/נמוך&nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30021.01</td><td></td></tr><tr><td>פתרון פונקציונליות/כדאיות&nbsp;</td><td>מדיה-טק</td><td>99-768-CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 מדיה&nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30096.01</td><td>לייצור בינוני ממוזג</td></tr><tr><td>804G קרצינומה של שלפוחית השתן של חולדות קו תאים</td><td>זמין על פי בקשה</td><td></td> להכנת סרום <td></td></tr><tr><td>בקר עוברי בינוני ממוזג, מוסמך</td><td>Gibco</td><td>26160</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax-I</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין (5,000 IU/ml/Strptomycin (5 מ"ג/מ"ל)&nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>1670049</td><td></td></tr><tr><td>פורממיד 500 מ"ל</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP227-500</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת חשיפת אנטיגן 250 מ"ל (pH 6.0)</td> <td>Vector Laboratories</td><td>H-3300</td><td>לייצור 0.15 M תמיסת נתרן סיטראט</td></tr><tr><td>דקסטרוז,</td><td>כימיקלים נטולי</td> מים <td>EMD DX0145-1</td><td>לייצור תמיסת גלוקוז 1 M</td></tr><tr><td>סרום חמור נומל (אבקה)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-100ML</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן Ki67 אנטי אנושי</td><td>לעכבר BD Biosciences</td><td>556003</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן PDX-1 אנטי אנושי עיזים</td><td>R& D Systems</td><td>AF2419</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד אינסולין שרקן פוליקלונלי</td><td>Dako</td><td>2016-08</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן אנטי גלוקגון ארנב פוליקלונלי</td><td>Dako</td><td>2014-06</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן ארנב פוליקלונלי אנטי-סומטוסטטין</td><td>Dako</td><td>2011-08</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן אנטי-וימנטין עוף פוליקלונלי</td><td>abcam</td><td>ab24525</td><td></td></tr><tr><td>מצומד ביוטין-SPחמור נגד עכברים IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-065-150</td><td></td></tr><tr><td>StreptAvidin, אלכס פלור 488 מצומד&nbsp;</td>,<td>Invitrogen</td><td>S32354</td><td></td></tr><tr><td>חמור מצומד רודמין נגד עיזים IgG&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-025-147</td><td></td></tr><tr><td>חמור מצומד רודמין נגד חזיר ניסיונות IgG&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>706-025-148</td><td></td></tr><tr><td>חמור מצומד רודמין נגד ארנב IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-025-152</td><td></td></tr><tr><td>Cy 5-מצומד חמור נגד חזיר ניסיונות IgG&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>706-175-148</td><td></td></tr><tr><td>Cy 5-מצומד חמור נגד עיזים IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-175-147</td><td></td></tr><tr><td>Cy 5-מצומד חמור נגד ארנב IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-175-152</td><td></td></tr><tr><td>Cy 5-מצומד חמור נגד עוף IgG</td><td>ג'קסון ImmunoResearch</td><td>703-175-155</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Millipore</td><td>S7113</td><td></td></tr><tr><td>מאגר ריאגנטים חד פעמי 25 מ"ל</td><td>Sorenson BioScience</td><td>39900</td><td></td></tr><tr><td>384 באר, שחור/שקוף, צלחת מטופלת בתרבית רקמות</td><td>BD Falcon</td><td>353962</td><td></td></tr><tr><td>96 באר, שחור/שקוף, צלחת מטופלת בתרבית רקמות</td><td>Costar</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>פיפטור רב ערוצי</td><td>Costar</td><td>4880</td><td></td></tr><tr><td>שואב ואקום 12 ערוצים</td><td>Drummond</td><td>3-000-096</td><td></td></tr><tr><td>מגרד תאים</td><td>פלקון</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים איזוטמפ דגם 2223&nbsp;</td>מכשיר סינון בעל תוכן גבוה <td>של פישר סיינטיפיק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>: ArrayScan VTI</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a-תכולה גבוהה<em&gt; במבחנה</em&gt; פלטפורמת discovery הלבלב איילט β-cell שכפול

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

אובדן תאי β המייצרים אינסולין הוא מאפיין מרכזי של סוכרת. בעוד שמגוון טיפולים חלופיים פוטנציאליים נחקרים, הרחבת β תאי הלבלב המייצרים אינסולין אנדוגניים נותרה אסטרטגיה אטרקטיבית. לתאי β יש פעילות התחדשות ספונטנית מוגבלת; כתוצאה מכך, מאמץ מחקרי מכריע הוא לפתח הבנה מדויקת של המסלולים המולקולריים המגבילים את צמיחת תאי β ולזהות תרופות המסוגלות להתגבר על מעצורים אלה. כאן מוצגת שיטת סינון תאים ראשוניים אוטומטית מבוססת תמונה גבוהה לזיהוי מולקולות קטנות המקדמות שכפול תאים β. מתגברים על כמה מגבלות של מתודולוגיות קודמות. ראשית, שימוש בתאי איים ראשוניים במקום בקו תאים אימורטליזציה ממקסם את שימור מגבלות הגדילה in vivo. שנית, שימוש בתרביות תאי איים בהרכב מעורב ולא בקו β תאים מאפשר זיהוי של ממריצי גדילה מוגבלים בשושלת וכלליים כאחד. שלישית, הטכניקה הופכת את השימוש באיים ראשוניים, משאב מגביל, למעשי באמצעות שימוש בפורמט של 384 בארות. רביעית, שונות ניסויית מזיקה הקשורה לאיכות תרבית איים לא יציבה מתגברת באמצעות אופטימיזציה של פרמטרים של בידוד, פיזור, ציפוי ותרבות. חמישית, הקשיים במדידה מדויקת ועקבית של קצב השכפול הבסיסי הנמוך של תאים אנדוקריניים באי מתגברים על ידי פרמטרים אופטימליים של צביעה חיסונית, רכישת נתונים אוטומטית וניתוח נתונים; אוטומציה משפרת בו זמנית את התפוקה ומגבילה את הטיית הנסיין. מגבלות בולטות של בדיקה זו הן השימוש בתרביות איים מפוזרות המשבשות את ארכיטקטורת האיים, השימוש במכרסמים ולא באיים אנושיים והמגבלות האינהרנטיות של תפוקה ועלות הקשורות לשימוש בתאים ראשוניים. חשוב לציין, האסטרטגיה מותאמת בקלות למחקרי שכפול איים אנושיים. בדיקה זו מתאימה היטב לחקירת ההשפעה המיטוגנית של חומרים על תאי β והמנגנונים המולקולריים המווסתים את צמיחת תאי β.

כדי להעריך β-cell או שכפול תאי α, פרוטוקול assay בארבעת צבעים נדרשים. ראשית, אובייקטים מזוהים על ידי מכתים DAPI (ערוץ 1, 386 ננומטר). לאחר מכן, β-תאי (אירוע 1) נספרים: יצירות כי שיתוף להביע PDX-1 + (ערוץ 2, 650 ננומטר) ואינסולין פרי-גרעיני (ערוץ 3, 549 ננומטר). בהמשך לכך, תאי β משכפלים (אירוע 2) נספרים: בטא-תאי (אירוע 1) כי שיתוף מפורשת Ki-67 (ערוץ 4, 485 ננומטר) (איור 3). אחוז משכפלים β-תאי מחושב: (אירוע 2 / אירוע 1) x ...

אתגרים קריטיים לתחום מחקר הסוכר מעוניינים להבין את המנגנונים המולקולריים מווסת שכפול β-cell איון לפתח שיטות מגרה התחדשות תאי β. בזאת שיטה גבוהה ההקרנה תוכן לזהות ולהעריך את הפעילות β-cell לקידום שכפול של מולקולות קטנות מוצג.

A-תכולה גבוהה<em&gt; במבחנה</em&gt; פלטפורמת Discovery הלבלב איילט β-cell שכפול

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion ...

המטרה הכללית של פלטפורמת סריקה זו בעלת התוכן הגבוה לשכפול תאי בטא, היא להקל על חקירת המסלולים המולקולריים המגבילים את צמיחת תאי הבטא. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות חשובות בתחום הביולוגיה של תאי בטא, כגון זיהוי אחד ממולקולות האיתות והמסלולים המרכזיים השולטים בהתחדשות תאי בטא.היתרונות המרכזיים של טכניקה זו הם שהיא מאפשרת הגדלה של תפוקת ריפוי התאים להערכה ספציפית וניתוח נתונים אוטומטי של שכפול תאי איים ראשוניים. לשימוש בטכניקה זו יש פוטנציאל להתרחב לעבר פיתוח טיפול רגנרטיבי לסוכרת, מחלה עם עלות בריאותית וכלכלית משמעותית לחברה שלנו.התחילו בשימוש במזרק של 10 מיליליטר המטוען בתמיסה מעיקלית לעיכול הלבלב ומצויד במחט במידה 22, כדי לבצע קנולציה של צינור המרה המשותף בנקודת החיבור של צינור המרה מהכיס וצינור המרה מהכבד, או מיד לאחרה (בכיוון הדיסטלי). תוך תמיכה בצינור המרה המשותף באמצעות ידית סכין ניתוח, הגזירים באיטיות 10 מיליליטר מהתמיסה. לאחר מתן כל הקולגנאז, השתמשו בפינצטה מעוקלת ובמספריים כדי להפריד את הלבלב המנופח מהמעי הגס היורד, מהמעיים, מהקיבה ומהטחול.לאחר מכן, העבירו עד שני לבלבים למבחנה של 50 milliliter על קרח, המכילה חמישה milliliter של תמיסת עיכול לבלב. כאשר כל הלבלבים נאספו, הניחו את מבחנות העיכול במקלח מים בטמפרטורה של 37 degree Celsius למשך 15 דקות, תוך써 ערבוב עדין בכל שלו

a-high-content-vitro-pancreatic-islet-cell-replication-discovery

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

כאן, אנו מתארים שיטה לבידוד, תרבות ומניפולציה של לבלב העוברי של עכבר. זה מייצג...

מערכת ל<em&gt; Vivo לשעבר</em&gt; Culturing של לבלב עוברי

מנסה לאמוד בתפקוד β-תאי מבחנה באמצעות עכבר איים מבודדים לנגרהנס הוא מרכיב חשוב במחקר של הפתופיזיולוגיה סוכרת ותרופות. בעוד רבים יישומים במורד הזרם זמינים, פרוטוקול זה מתאר במפורש המדידה של monophosphate אדנוזין המחזורי תאיים (cAMP) כפרמטר חיוני קביעת פונקצית β-תאים.

שיטה לבידוד עכבר הלבלב איילט וקביעת תאית cAMP

פרוטוקול לבודד, אשכולות תאי איון התרבות, ותמונה (ICCS) שמקורם בתאי לבלב עובריים אנושיים מתואר. השיטה מפרטת את הצעדים הדרושים כדי ליצור ICCS מרקמות, תרבות כמו monolayers או בהשעיה כאגרגטים, ותמונה לסמנים של התפשטות וגורל החלטות תא לבלב.

בידוד, תרבות והדמיה של צבירי תאים עוברי האנושי לבלב

שיטת התרבות תלת ממדים שתוארה בפרוטוקול זה משחזרת פיתוח לבלב מאבות מפוזרים עוברי לבלב של עכבר, כולל הרחבתן משמעותית, בידול והמורפוגנזה לתוך איבר מסועף. שיטה זו ניתנת להדמיה, התערבות ומניפולציה תפקודיות של הנישה.

במבחנה הלבלב Organogenesis ממפוזר אבות עכבר עובריים

מבחני מושבה במבחנה כדי לזהות עצמית והתחדשות והבחנה של ובתאים מבודדים לבלב בעכברים בוגר הם המציאו. מבחנים אלה, אבות לבלב להצמיח מושבות תאים בחלל 3 ממדים במדיום methylcellulose המכיל מוצק למחצה. פרוטוקולים לטיפול תאים בודדים ואפיון של מושבות בודדות מתוארים.

מבחני מושבת Vitro לאפיון ובתאי Tri-עצמה מבודדת מלבלב Murine למבוגרים

Ex-vivo הלבלב איון מחקרים חשובים לחקר הסוכרת. קיימות טכניקות ללמוד איונים בתרבית באדריכלות תלת-ממדי מקורי שלהם הן זמן רב, לא יעיל, הנמצאים בשימוש לעיתים רחוקות. עבודה זו מתאר שיטה חדשה, פשוט ויעיל ליצירת באיכות גבוהה פרפין מקטעי איונים תרבותי שלם.

הלבלב איון הטבעה למקטעי פרפין

אנו מתארים שיטה בידודו של תאים האנדוקרינית הלבלב עובריים, neonatal ופוסט ואחריו רצפי RNA בתא יחיד. שיטה זו מאפשרת ניתוח של השושלת האנדוקרינית הלבלב פיתוח, תא dynamics הטרוגניות, transcriptomic.

Transcriptomic תא בודד ניתוחים של תאים בלבלב האנדוקרינית העכבר

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לייצר באיכות גבוהה, בקנה מידה גדול של נתונים הטרנססקריפט של תאים בודדים מבודדים איונים הלבלב האנושי באמצעות droplet-מבוססי microfluidic בודד מיקרופלוג של תא RNA רצף הטכנולוגיה.

תא בודד RNA רצף וניתוח של איי הלבלב האנושי

מאמר זה מציג פרוטוקול להתמיינות מכוונת וניתוח פונקציונלי של תאים דמויי תאי β. אנו מתארים תנאי תרבית אופטימליים ומעברים עבור תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים לפני יצירת תאי לבלב מייצרי אינסולין. ההתמיינות בת ששת השלבים מתקדמת מיצירת אנדודרם סופית לתאים פונקציונליים דמויי תאי β המפרישים אינסולין בתגובה לגלוקוז.

פרוטוקול אופטימלי ליצירת תאים תפקודיים מפרישי אינסולין בלבלב מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

השתלה של איים מבודדים הוצע להיות טיפול פוטנציאלי עבור סוכרת מסוג 1. כאן אנו מתארים שיטה לבודד איים מהעכבר pancreata ואת השתלת אותם למרחב subcapsular של הכליה.

שיטה בידוד איילט Murine והשתלות כליה Subcapsular

חקור שיטת סקרנינג תוכן גבוה לזיהוי מולקולות קטנות המעודדות שכפול תאי β באיי הלבלב. שיטה זו מאפשרת ניתוח אוטומטי של נתוני שכפול תאים ומאיצה מחקר בביולוגיית תאי β ובתרפיות רגנרטיביות לסוכרת.

A-תכולה גבוהה

גלה סרטונים נוספים