לומד את התפקיד של מכתשיים מקרופאגים סרטן שד גרור

המטרה הכוללת של ניסויים אלה היא לקבוע את תפקידם של מקרופאגים מכתשית ריאתית בגרורות סרטניות באמצעות מודל סינגנאי של סרטן השד. שיטה זו יכולה לענות על כמה משאלות המפתח בתחומי אימונולוגיה של גידולים וגרורות סרטניות, כגון מדוע ריאות הן אחת המטרות השכיחות ביותר הן גרורות סרטן פתוגניות. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שהיא משתמשת במודל סרטן שד מבוסס מאוד עם שיטה ספציפית מאוד של מיקרופאג'ים מכתשית ריאתית.

מי שתדגים את ההליך הזה תהיה סוריה קומארי ודרבו, עמיתת מחקר במעבדה שלי. ביום הזרקת תאי הגידול, יש להניח תחילה עכבר מגולח ומורדם על משטח ניתוח. לאחר מכן, שאפו פעם אחת 10 עד תאי הגידול החמישי ב-100 מיקרוליטר של PBS למזרק אינסולין של נקודת אפס של חמישה מיליליטר המצויד במחט בגודל 29.

לאחר מכן השתמש באגודל ובאצבע המורה כדי להרים את העור ליד הפטמה השנייה והשלישית, והכנס את המחט מתחת לעור לתוך כרית השומן של החלב ממש מתחת לפטמה השלישית. הזרקה איטית תת עורית של התאים ליצירת בועה מתחת לעור, והחזרת בעל החיים לכלוב עם ניטור עד להתאוששות מלאה. ארבעה עד חמישה ימים לאחר החיסון, כדי למדוד את הגידולים, יש למשש את אתר הגידול ולהשתמש בקליפר כדי להשתמש בקוטר הגדול והקטן ביותר של הגידולים כדי לקבוע את נפח הגידול.

כדי לדמות את תאי 41GFP המוזרקים, הנח את העכבר המורדם על במה ניתנת להזזה בתוך ההדמיה, ודמה את אתר הגידול במיקרוסקופ פלואורסצנטי. בארון בטיחות ביולוגית של זרימת אוויר למינרים, שישה ימים לאחר הזרקת תאי הגידול, מערבל את הליפוזומים כדי לפזר את החלקיקים באופן שווה, ולשאוב 60 מיקרוליטר מהתרחיף לקצה פיפטה סטרילי. הניחו את הקצה ליד הנחיר של החיה המורדמת שחוסנה בגידול, ושחררו לאט חמישה מיקרוליטרים מתמיסת הליפוזום, מה שמאפשר לעכבר לשאוף את הטיפה.

זה קריטי לתת את תמיסת הליפוזום לאט תוך שמירה על רמת ההרדמה המתאימה כדי לאפשר לבעל החיים לנשום באופן סדיר במהלך הלידה. לאחר מתן כל 60 המיקרוליטרים, אפשר לעכבר להתאושש לחלוטין, והחזיר את החיה לכלוב שלה. כדי לספור ולדרג את הגרורות על פני הריאה, הנח את הריאות מתחת למיקרוסקופ דיסקציה וממקד את המטרה עד לקבלת תצוגה ברורה של פני הריאה.

לאחר מכן ספרו ידנית את המטזות בצד הקדמי והאחורי של שתי הריאות, ודמו את הגידולים במיקרוסקופיה פלואורסצנטית. לאחר ספירה והדמיה של הגרורות, השתמש במספריים ובמלקחיים כירורגיים כדי לטחון את הריאה ולהעביר את חלקי הרקמה לצינור חרוטי של 15 מיליליטר המכיל שלושה מיליליטר של מאגר עיכול. בדוק את השברים על שייקר מסתובב באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות, ולאחר מכן טרטר את התרחיץ כדי לנתק את הרקמה.

לאחר מכן, סנן את מתלה הרקמות דרך מסננת של 40 מיקרון כדי להסיר גושים, לחץ על החלקים הגדולים יותר דרך המסננת בעזרת בוכנת מזרק לפי הצורך. כאשר הושגה תרחיף של תא בודד, אסוף את התאים על ידי צנטריפוגה וליזה את כדוריות הדם האדומות עם מאגר ACK למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את הגלולה פעמיים בשמונה מיליליטר RPMI.

לאחר הצנטריפוגה השנייה, אנו משעים את התאים בשלושה מיליליטר של מדיום RPMI שלם לספירה, ומסובבים שוב את התאים. כעת יש לדלל את התאים לאחד פי 10 עד שישי תאים לכל 100 מיקרוליטר של ריכוז מאגר פקס, ולהעביר 100 מיקרוליטר של תאים לבארות בודדות של צלחת V עם 96 בארות. אוספים את התאים בתחתית הבארות על ידי צנטריפוגה, ואז הופכים את הצלחת כדי לתת למאגר להתנקז החוצה.

חסום את התאים עם 100 מיקרוליטר של בלוק CD16 CD32 FC למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס, וצנטריפוז שוב את הצלחת. לאחר מכן הפוך את הצלחת כדי להסיר את הסופרנטנט, כפי שהודגם זה עתה, והוסף את קוקטייל הנוגדנים המעניין לבארות המתאימות. לאחר 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס, גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה, ולאחר מכן שטיפה עם 200 מיקרוליטר של מאגר פקס.

לאחר מכן השעו מחדש את הכדורים ב-200 מיקרוליטר PBS טרי וצבעו את הדגימות בצבע כדאיות למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. בתום הדגירה יש לשטוף את התאים בעוד 200 מיקרוליטר PBS, ולקבע את הדגימות ב-100 מיקרוליטר של אחוז אחד פרפורמלדהיד לאחסון בארבע מעלות צלזיוס. מיד לפני ניתוחם, העבירו את מתלי התאים לצינורות ציטומטריית זרימה פוליפרופלן.

הזרקת תאי גידול 4T1GFP לתוך כרית השומן של החלב מובילה להיווצרות גידולי עכברים המסכמים את ההתפשטות הגרורתית של סרטן השד האנושי, כפי שמעידים הגרורות הנוצרות במהירות שנצפו בתוך הריאות. הטרנספקציה היציבה של תאי 4T1 עם GFP מקלה על מעקב אחר תאי גידול גרורות וכימות העומס הגרורתי. הסטולוגיה שגרתית, בשילוב עם אלגוריתמים של פתולוגיה דיגיטלית, מספקים גם כלי טוב לכימות ואימות גרורות.

יתר על כן, ניתוח ציקומטרי זרימה רב-צבעונית מאפשר אפיון אפילו של אוכלוסיות תאים נדירות, כגון CD11b שלילי, CD11c F80 מקרופאגים אלבאולרים חיוביים. ניתן לאשר את דלדולם, biclotrenate על ידי היעדר תאים חיוביים CD11c F480 אלה בריאות המנותקות של בעלי חיים שטופלו בליפוזום. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להזריק תאי גידול לכרית השומן של החלב, לעקוב אחר צמיחת הגידול והגרורות, ולרוקן מקרופאגים מכתשית, ולהכין תאי ריאה לניתוח ציקומטרי זרימה.