ספירלת גנגליון Neuron explant תרבות Electrophysiology על מערכי אלקטרודה רבות

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים כיצד לתרבית ולתעד פעילות אלקטרופיזיולוגית של נוירונים שמיעתיים על מערכי מרובי אלקטרודות. שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בתחום חקר השמיעה, כגון אפיון התכונה האלקטרופיזיולוגית של נוירוני השמיעה והגירוי על ידי אזורי האלקטרודות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת הקלטה בו זמנית לא פולשנית חוץ-תאית של הפעילות העצבית של מספר רב של נוירונים שמיעתיים.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על הטיפול. למעשה, הם יכולים לשמש ליישום ממשק האלקטרו-נוירון של התותבות שלך כמו שתל שבלול כדי להחזיר את השמיעה אצל מטופלים חירשים. כדי להתחיל בהליך זה, הכינו את תמיסת ציפוי ה-ECM על ידי הפשרת תערובת ה-ECM על קרח.

לאחר מכן יש לדלל את תערובת ה-ECM במדיום תרבית בסיסי ביחס של אחד ל-10, ולאחסן אותה על קרח. עבור MEAs חדשים במכסה זרימה למינרית, טבלו אותם ב-70% אתנול למשך 30 שניות. לאחר מכן, שטפו אותם במים מזוקקים למשך 30 שניות.

לאחר מכן הניחו ל-MEA להתייבש במשך 30 דקות. כדי לצפות את ה-MEAs, פיפטה 50 מיקרוליטר של תמיסת ציפוי מעל ה-MEA עם קצה פיפטה קר של 200 מיקרוליטר. לאחר מכן אפשר ל-MEA לעבור במשך 30 דקות עד שעה בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, הסר את תמיסת הציפוי. הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום תרבית בתוספת 10% FBS וחמישה ננוגרם למיליליטר BDNF והשאיר אותו בטמפרטורת החדר עד לציפוי הרקמה. לאחר מכן, מניחים את צלחת הפטרי המכילה את ה-MEA המצופים בצלחת פטרי גדולה ומוסיפים צלחת פטרי קטנה המכילה PBS ללחות.

בהליך זה, יש לעקר את ראש הגור עם 70% אתנול. לאחר מכן חתוך את החיבור בין העור לגולגולת לאורך הקו הסגיטלי. לאחר מכן, חותכים את הגולגולת בצורה סגיטלית ומסירים את המוח.

לאחר מכן, חותכים את העצמות הטמפורליות מהגולגולת ומניחים אותן בצלחת פטרי המכילה HBSS סטרילי קר כקרח. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, נתחו את בולה התוף באמצעות זוג מלקחיים עדינים ובודדו את האוזן הפנימית. לאחר מכן, הסר את עצם השבלול.

לאחר מכן, הסר את הרצועה הספירלית ואת ה-SV יחד על ידי החזקת החלק הבסיסי של הגנגליון הספירלי וה-SV בעזרת מלקחיים ושחרור איטי של ה-SV מהבסיס לקודקוד. הפרד את האיבר של קורטי מהגנגליון הספירלי במודיולוס על ידי החזקת החלק הבסיסי של הגנגליון הספירלי והאיבר של קורטי בעזרת מלקחיים ושחרור איטי של איבר קורטי מהבסיס לקודקוד. לאחר מכן, חותכים את הצמחייה הרוחבית מהגנגליון הספירלי באמצעות מלקחיים או מספריים או סכינים עדינים של מיקרו-דיסקציה.

כעת העבירו את הגנגליון הספירלי ואת האיבר של קורטי ל-MEA. לאחר מכן, הניחו את ה-SG על אזור האלקטרודה ועל האיבר של קורטי במרחק של כחמישה מילימטרים מאזור האלקטרודה. הנח את האקספלנטים ואת איבר קורטי על ה-MEA תוך הימנעות מנזק לרקמה.

לאחר מכן, הניחו את ה-MEA בזהירות בחממה ובתרבית ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2. למחרת, בדוק ויזואלית את השתלים לאיתור חיבורם ל-MEAs. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום תרבית המכיל 10% FBS ו-BDNF מדי יום במשך חמישה ימים רצופים.

ביום השישי, הוסיפו שני מיליליטר של מדיום תרבית המכיל 10% FBS וחמישה ננוגרם למיליליטר BDNF ותרבו את הרקמה למשך 13 ימים נוספים. לאחר 18 יום של תרבית קולקטיבית, יש לשטוף את תרבית MEA בתמיסה החוץ-תאית שהוכנה קודם לכן בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, יבש את המגעים של שבב ה-MEA עם חתיכת רקמה והרכיב את ה-MEA על מחזיק ה-MEA.

לבסוף, התקן את ה-MEA במערך ההקלטה. לאחר מכן, הוסיפו 300 מיקרוליטר מהתמיסה החוץ-תאית והמתינו 10 דקות כדי לאפשר למערכת להתייצב לפני ההקלטה. כעת, רשום את הפעילות הספונטנית למשך שתי דקות מכל האלקטרודות וזהה את האלקטרודות הפעילות.

לאחר מכן, זהו את האלקטרודות המגיבות לגירוי. כדי לא לכלול את חפץ הגירוי, גירוי מאותה אלקטרודה 10 פעמים. אם התרבית מגיבה לפחות שמונה מתוך 10 פעמים, ניתן להניח זאת כתגובה חיובית בעת גירוי המושרה על ידי אלקטרודה.

כדי לזהות רעש רקע, יש למרוח TTX על התרבית בריכוז של מיקרומולר אחד כדי לחסום את תעלות הנתרן המגודרות במתח ולאחר מכן להקליט למשך שתי דקות. להלן עקבות ההקלטות המקוריות של שש מתוך 63 אלקטרודות המראות פעילות ספונטנית וזוהי תרשים הרסטר של שש האלקטרודות לאחר זיהוי ספייק. כל עמודה מייצגת פוטנציאל פעולה אחד.

תרשים רסטר זה כולל את כל האלקטרודות הפעילות. הפעילויות מוקלטות מ-63 אלקטרודות למשך שתי דקות. איור זה ממחיש כי גירוי דו-פאזי עם משך כולל של 80 מיקרו-שניות ומשרעת של 80 מיקרו אמפר שימש לגירוי תרבית מאלקטרודה אחת.

דוגמה מייצגת זו של עקבות נתונים גולמיים מציגה את פוטנציאל הפעולה, והכל ללא תגובות לאחר גירוי. והנה תרבית הגנגליון הספירלי על ה-MEAs המוכתמת במערכת החיסון עבור הסמן העצבי, TUJ, בסוף הניסוי כדי להמחיש את הכיסוי העצבי של אזור האלקטרודה. האלקטרודה המשמשת לגירוי מסומנת בירוק והאלקטרודות המגיבות מסומנות באדום.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 50 דקות אם היא מבוצעת כראוי. למרות ששיטות אלו יכולות לספק תובנה לגבי אלקטרופיזיולוגיה של נוירוני גנגליון ספירליים, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות כגון תרביות מוח או חוט שדרה. לאחר הפיתוח, טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום מדעי החומרים והננוטכנולוגיה, שינוי מהיר של משטח הכתם של אלקטרודות של הקלטה וגירוי עצבי.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתרבית ולתעד פעילות אלקטרופיזיולוגית, על ידי סידור צמח נוירונים על מערכי מרובי אלקטרודות.