Name: במודל רשתית חריפה להערכת תרופות הפרת מכשול רשתית דם פוטנציאל הטיפול (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: למדו להשתמש במודל רשתית חריפה אקס ויוו לבדיקת תרופות להפרת מכשול רשתית הדם. השיטה מבוססת על רשתיות חזיר ומאפשרת הערכת נזק ושיקום באמצעות lipoxin A4 במחקרי נוירודגנרציה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bringhurst Meats (ברלין, ניו ג'רזי) זוכה להכרה על עזרתם האמיתית באספקת גלגלי העיניים של החזירים.

כל הפרוטוקולים בוצעו בהתאם למדיניות של ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדית השתמשתי ישימה. 1. הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן תקשורת הייצוב עם 75% בינוניים הנשר השונה של Dulbecco (DMEM), 25% תמיסת המלח המאוזן &quot;הנקס (HBSS). מערבבים היטב, aliquot ולאחסן ב -20 ° C עד השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את בופר פוספט (PBS) לעקר ידי מעוקר. אחסן את הפתרון בטמפרטורת החדר. מומלץ לחמם את PBS על 37 ° C לפני הניסוי (5 מ&quot;ל לכל טוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 10%, 20% ו -30% סוכרוז PBS. לסנן את כל הפתרונים בנפרד מעל 0.22 מיקרומטר מסננים נפרדים עבור עיקור. שמור פתרונות על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון מניות היסטמין ב PBS לריכוז של 90 מ&quot;מ. לעקר את הפתרון על ידי סינון על מסנן 0.22 מיקרומטר. Aliquot ולשמור הפתרון ב -80 מעלות צלזיוס. הימנע מחזורים להקפיא-ו-הפשרה מרובות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך paraformaldehyde 4% טרי (PFA) ב- PBS לפני הניסוי. מניחים אותו על קרח. זהירות: שמור PFA במנדף וללבוש ציוד מגן מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשרה בינוני הייצוב (20 מיליליטר לכל רשתית). להוסיף פניצילין, סטרפטומיצין לריכוז סופי של 100 U / ml. חלק חם של המדיום (15 מ&quot;ל לכל רשתית) ל -37 מעלות צלזיוס חממה לפני הניסוי. השאירו את שאר המדיום על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את HBSS (10 מ&quot;ל לכל הרשתית) על קרח. </li></ol> 2. רשתית תרבות Organotypic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת דגימות במנדף בתרבית רקמה. פתח את עיינית בחתך סביב העדשה. בעזרת מברשת, להסיר את ההומור זגוגי בעדינות מבלי משיכת הרשתית. בעדינות לנתק את הרשתית מהקצה לחתוך עם מברשת לחשוף את בדיסק האופטי. חמור עצב הראייה בתער ולשחרר את הרשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הרשתית לתוך צלחת פטרי ובזהירות לשטוף הרשתית פעם באמצעות HBSS קר. הנח את הדוגמה HBSS על iלִספִירַת הַנוֹצרִים. לנתח כמה הרשתיות החוצה לפי הצורך על ידי חזרה על שלב 2.1 ו על שלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הרשתית לשניים באופן סימטרי עם תער. בעדינות להעביר דגימות לצלחת 6-היטב עם 3 מ&quot;ל של התקשורת ייצוב לכל טוב. אפשר איזון למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור עם האווירה המכילה 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את ריאגנטים הבאים במהלך הדגירה על שלב 2.3: לדלל את הפתרון המניות היסטמין לריכוז הרצוי (450 מיקרומטר) במדיום חמים. ממיסים LXA4 (מאוחסן תחת ארגון) לתוך המדיום לריכוז סופי של 250 ng / ml. הערה: כאשר מודדים את השפעת LXA4, מחצית מן הרשתית יחיד משמש היסטמין לבד, בעוד החצי השני משמש היסטמין עם LXA4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את המדיום ייצוב בזהירות ולהוסיף המדיום מוכן היטב כל (3 מ&quot;ל לכל טוב). דגירת הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. באינקובטור עם האווירה המכילה 2 5% CO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים אתדגימות פעם חם, PBS סטרילית. </li></ol> 3. להכין את דגימות Immunostaining <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב PBS מהצלחות. להוסיף 4% PFA (3 מ&quot;ל לכל טוב) ו דגירה של 15 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות לשאוב PFA. שוטפים את דגימות פעם באמצעות PBS. העברת דגימות 10% סוכרוז (5 מ&quot;ל לכל טוב) ו דגירה של 2 עד 4 שעות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת דגימות סוכרוז 30% (5 מ&quot;ל לכל טוב) ו דגירה לילה ב 4 מעלות צלזיוס. מערבב חלק אחד של מדיום ההקפאה המסחרי עם שני חלקים של סוכרוז 20% על מנת להפוך את מדיום ההקפאה עובד. תשאיר את זה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה או יותר עד באוויר בועות להיעלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת דגימות המדיום מקפיא עובד ולאפשר איזון במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. חתוך כל רשתית למלבנים (בערך 3 מ&quot;מ על 5 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר בזהירות את דגימות לתוך התקשורת מקפיא עובד הכלול מיכל גלילי (כ -1 ס&quot;מ רדיוס x 2 ס&quot;מ גובה) devised מרדיד אלומיניום. ודא פרוסות רשתית הם אנכיים (אוריינטציה לספק חתך של הרשתית על חתך) ולהקפיא אותם בחנקן נוזלי. שמור את אבני ב -80 ° C עד השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיף כל בלוק על cryostat ל -14 מיקרומטר פרוסות עבות ו הר בסעיפים בשקופיות זכוכית. אחסן את השקופיות ב -80 ° C עד השימוש. </li></ol> 4. Immunostaining <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את החלקים עם חיץ פוספט סוכרוז 5% (SPB, סוכרוז 5% ב PBS, pH 7.4) פעם. חסום את אתרי הקישור הלא ספציפית על ידי דוגרים סעיפים בחסימת המאגר (5% SPB עם 10% נסיוב עז נורמלי 0.5% Triton X-100) במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הסעיפים (בשקופיות) עם הנוגדן הראשוני המתאים (GFAP או MAP2, מדולל ב 1: 500 בחסימת מאגר) במשך שעה 1. לשאוב את הפתרון. לשטוף שלוש פעמים ב 5% SPB. עבור מכתים את IgG אנדוגני, לדלג על שלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה החלקה עם SECON המקבילנוגדנים dary (Cyanine3 / FITC IgG אנטי עכבר חמור מצומדות / נגד ארנב, מדולל ב 1: 800 במאגר חסימה) במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את החלקים ביסודיות עם 5% SPB שלוש פעמים. להכין את דגימות במיקרוסקופ על ידי מקבע אותם ב הרכבה בינונית המכיל DAPI והתכסות coverslips. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ לייזר confocal, ללכוד תמונות באמצעות עדשה 20X תחת פרמטרים זהים כגון עוצמת הלייזר, ערך רווח, להתעכב זמן, וכו &#39;בין הקבוצות. הגדר את אורכי גל עירור / פליטה עבור הערוץ הכחול (כדי לזהות DAPI) כמו 408/447 ננומטר, עבור במסלול האדום (כדי לזהות Cyanine3) כמו 561/785 ננומטר עבור המסלול הירוק (כדי לזהות FITC) כמו 488/525 ננומטר . </li></ol> ניתוח תמונה 5. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת אחוז כלי דם דולפים על פי הקריטריונים הבאים 12: כלול רק כלי דם עם גרעיני תא האנדותל בתוך מטוס סעיף במניין; לשקול דולפי כלי דם אם הוא מראה AGradient של immunostaining סביב הספינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבוע את רמת הביטוי, לבחור אזורים של עניין ולמדוד את הערך האפור הממוצע באמצעות תוכנת ניתוח תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למדוד את הרוחב של התהליך, לבחור שטח של המקטע שבו התהליכים מובחנים (השכבה החיצונית גרעינית, ONL, למשל). לאחר מכן בחר שדה אופטי שבו תהליכים אלו גלויים ורציפים. הגדר את סרגל קנה המידה בהתאם להגדרה המיקרוסקופית, למתוח קו על פני התהליך ולבצע את המדידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח את ההמשכיות של תהליך, באזורים נבחרים של עניין, להחיל את המסנן נקרא השונות אשר משפר את הקצוות של התמונה על ידי החלפת כל פיקסל עם השונות בשכונה שלה, באופן אוטומטי את הניגודיות והבהירות, לספור את השורות לנרמל את הספירה על ידי אֵזוֹר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב משמעויות סטטיסטיות באמצעות -test t של סטודנט שני זנב. *, P &lt;0.05; **, P &lt;0.01; ***, P &lt;0.001. Pהרבה תוצאה כמו ממוצע ± SEM. </li></ol>

<ol><li>Cunha-Vaz, J., Bernardes, R., Lobo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-retinal+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Blood-retinal barrier.</a> J Ophthalmol. 21, 3(2011).</li>
<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-neural+barrier%3A+intercellular+communication+at+glio-vascular+interface%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem+Molec+Biol%22%5BJournal%5D)">Blood-neural barrier: intercellular communication at glio-vascular interface.</a> J Biochem Molec Biol. 39, 339-345 (2006).</li>
<li>Kumagai, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+transport+in+brain+and+retina%3A+implications+in+the+management+and+complications+of+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Metab+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Glucose transport in brain and retina: implications in the management and complications of diabetes.</a> Diabetes Metab Res Rev. 15, 261-273 (1999).</li>
<li>Runkle, E. A., Antonetti, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-retinal+barrier%3A+structure+and+functional+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molec+Biol%22%5BJournal%5D)">The blood-retinal barrier: structure and functional significance.</a> Methods Molec Biol. 686, Clifton, N.J. 133-148 (2011).</li>
<li>Takata, K., Hirano, H., Kasahara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+of+glucose+across+the+blood-tissue+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Transport of glucose across the blood-tissue barriers.</a> Int Rev Cytol. 172, 1-53 (1997).</li>
<li>Goncalves, A., Ambrosio, A. F., Fernandes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+claudins+in+blood-tissue+barriers+under+physiological+and+pathological+states%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Barriers%22%5BJournal%5D)">Regulation of claudins in blood-tissue barriers under physiological and pathological states.</a> Tissue Barriers. 1, 24782(2013).</li>
<li>Patton, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+image+analysis%3A+concepts%2C+applications+and+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Ret+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal image analysis: concepts, applications and potential.</a> Prog Ret Eye Res. 25, 99-127 (2006).</li>
<li>Di Marco, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+dysfunction+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer%27s+disease--A+review+of+endothelium-mediated+mechanisms+and+ensuing+vicious+circles%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Vascular dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease--A review of endothelium-mediated mechanisms and ensuing vicious circles.</a> Neurobiol Dis. 82, 593-606 (2015).</li>
<li>Nagele, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-reactive+autoantibodies+prevalent+in+human+sera+increase+intraneuronal+amyloid-beta%281-42%29+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimer%27s+Dis%3A+JAD%22%5BJournal%5D)">Brain-reactive autoantibodies prevalent in human sera increase intraneuronal amyloid-beta(1-42) deposition.</a> J Alzheimer's Dis: JAD. 25, 605-622 (2011).</li>
<li>Goldwaser, E., Acharya, N., Nagele, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrovascular+and+blood-brain+barrier+compromise%3A+A+mechanistic+link+between+vascular+disease+and+Alzheimer%27s+disease+subtypes+of+neurocognitive+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parkinsons+Dis+Alzheimer%27s+Dis%22%5BJournal%5D)">Cerebrovascular and blood-brain barrier compromise: A mechanistic link between vascular disease and Alzheimer's disease subtypes of neurocognitive disorders.</a> J Parkinsons Dis Alzheimer's Dis. 2, 10(2015).</li>
<li>Horton, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+three-photon+microscopy+of+subcortical+structures+within+an+intact+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Photonics%22%5BJournal%5D)">In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain.</a> Nat Photonics. 7, (2013).</li>
<li>Sedeyn, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histamine+Induces+Alzheimer%27s+Disease-Like+Blood+Brain+Barrier+Breach+and+Local+Cellular+Responses+in+Mouse+Brain+Organotypic+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Histamine Induces Alzheimer's Disease-Like Blood Brain Barrier Breach and Local Cellular Responses in Mouse Brain Organotypic Cultures.</a> Biomed Res Int. 2015, 937148(2015).</li>
<li>Avdeef, A., Deli, M. A., Neuhaus, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAvdeef%2C+A+%22Blood-Brain+Barrier+in+Drug+Discovery%3A+Optimizing+Brain+Exposure+of+CNS+Drugs+and+Minimizing+Brain+Side+Effects+for+Peripheral+Drugs%22">Blood-Brain Barrier in Drug Discovery: Optimizing Brain Exposure of CNS Drugs and Minimizing Brain Side Effects for Peripheral Drugs</a>. Di, L., Kerns, E. H. , John Wiley & Sons, Inc. Ch. 10 188(2014).</li>
<li>Eigenmann, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+four+immortalized+human+brain+capillary+endothelial+cell+lines%2C+hCMEC%2FD3%2C+hBMEC%2C+TY10%2C+and+BB19%2C+and+optimization+of+culture+conditions%2C+for+an+in+vitro+blood-brain+barrier+model+for+drug+permeability+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies.</a> Fluids Barriers CNS. 10, 33(2013).</li>
<li>Takeshita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+blood-brain+barrier+model+combining+shear+stress+and+endothelial+cell%2Fastrocyte+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture.</a> J Neurosci Methods. 232, 165-172 (2014).</li>
<li>Alberghina, M., Lupo, G., Anfuso, C. D., Moro, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitate+transport+through+the+blood-retina+and+blood-brain+barrier+of+rat+visual+system+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Palmitate transport through the blood-retina and blood-brain barrier of rat visual system during aging.</a> Neurosci Lett. 150, 17-20 (1993).</li>
<li>Hosoya, K., Yamamoto, A., Akanuma, S., Tachikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipophilicity+and+transporter+influence+on+blood-retinal+barrier+permeability%3A+a+comparison+with+blood-brain+barrier+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Lipophilicity and transporter influence on blood-retinal barrier permeability: a comparison with blood-brain barrier permeability.</a> Pharm Res. 27, 2715-2724 (2010).</li>
<li>Minamizono, A., Tomi, M., Hosoya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+dehydroascorbic+acid+transport+across+the+rat+blood-retinal+and+-brain+barriers+in+experimental+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Pharm+Bull%22%5BJournal%5D)">Inhibition of dehydroascorbic acid transport across the rat blood-retinal and -brain barriers in experimental diabetes.</a> Biol Pharm Bull. 29, 2148-2150 (2006).</li>
<li>Serlin, Y., Levy, J., Shalev, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+pathology+and+blood-brain+barrier+disruption+in+cognitive+and+psychiatric+complications+of+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Psychiatry+Neurol%22%5BJournal%5D)">Vascular pathology and blood-brain barrier disruption in cognitive and psychiatric complications of type 2 diabetes mellitus.</a> Cardiovasc Psychiatry Neurol. 2011, 609202(2011).</li>
<li>Kolb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+retina+works+-+Much+of+the+construction+of+an+image+takes+place+in+the+retina+itself+through+the+use+of+specialized+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Sci%22%5BJournal%5D)">How the retina works - Much of the construction of an image takes place in the retina itself through the use of specialized neural circuits.</a> Am Sci. 91, 28-35 (2003).</li>
<li>Ikram, M. K., Cheung, C. Y., Wong, T. Y., Chen, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+pathology+as+biomarker+for+cognitive+impairment+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Neurosurgery+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Retinal pathology as biomarker for cognitive impairment and Alzheimer's disease.</a> J Neurol Neurosurgery Psychiatry. 83, 917-922 (2012).</li>
<li>Tan, Z., Ge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-beta%2C+the+retina%2C+and+mouse+models+of+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Amyloid-beta, the retina, and mouse models of Alzheimer disease.</a> Am J Pathol. 176, 2055(2010).</li>
<li>Serhan, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-resolving+lipid+mediators+are+leads+for+resolution+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pro-resolving lipid mediators are leads for resolution physiology.</a> Nature. 510, 92-101 (2014).</li>
<li>Bucolo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+topical+indomethacin%2C+bromfenac+and+nepafenac+on+lipopolysaccharide-induced+ocular+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Effects of topical indomethacin, bromfenac and nepafenac on lipopolysaccharide-induced ocular inflammation.</a> J Pharm Pharmacol. 66, 954-960 (2014).</li>
<li>Edelman, J. L., Lutz, D., Castro, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corticosteroids+inhibit+VEGF-induced+vascular+leakage+in+a+rabbit+model+of+blood-retinal+and+blood-aqueous+barrier+breakdown%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Corticosteroids inhibit VEGF-induced vascular leakage in a rabbit model of blood-retinal and blood-aqueous barrier breakdown.</a> Exp Eye Res. 80, 249-258 (2005).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

בדוח זה, אנו מציגים מודל רשתית חריפה רב עוצמה ex vivo של תפקוד לקוי של BRB באמצעות רשתית החזירים. מערכת מודל זו אינה דורשת מכשירים מיוחדים וניתנת להתאמה בקלות ברוב הגדרות המעבדה. עם זאת, כדי להשיג תוצאה מוצלחת, מספר שלבים דורשים תשומת לב רבה. לאחר השגת גלגלי העיניים מהמקור, יש לשמור אותם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס או על קרח ולעבד אותם בהקדם האפשרי. כאשר מנתחים את השפעת הטיפול, יש להשתמש בשני חצאים של אותה רשתית - מחצית אחת לאיתור שינויים אך ורק עקב פרוצדורות ניסיוניות (קו בסיס) והשנייה לאיתור השפעת הטיפול. גישה...

גוף גדל והולך של ראיות תומכת בקיומו של מחסום דם ברשתית (BRB) 1-5 ואת הדמיון שלה אל מחסום דם מוח (BBB) ​​6,7. הפשרה של BBB נקשר בחוזקה סיבתי או כסמן אבחון מחלות ניווניות כרוניות כמו מחלת אלצהיימר (AD) 8,9 ו מצבים חריפים כגון הזיות 10. תובנות מכניסטית לתוך פתולוגיות ותגליות אלה עבור מטרות תרופה פוטנציאל הם הקשו בדרך כלל על ידי מורכבות נגישות מוגבלת לרשת של המוח. חלופות כגון in vivo הדמיה 11, המוח organotypic תרבות 12, בתרביות תאים ראשוניים 13,14 ומערכות שיתוף התרבות 15 נוצרו. עם זאת, רוב המודלים האלה דורשים מכשירים מיוחדים, תקופות ניסוי ארוכות או סמנים מרובים כדי לזהות תאים. דמיון פונקציונלי מבני בין BBB ו BRB וכן מתאם בין dysfunctions של שני היה לטעון 16-19. בנוסף, גישה קלה יותר, סוגי תאים מוגדרים היטב שכבתי מבנה אפשרו הרשתית היטב מאופיינת כחלון למוח. הזהויות המבניות ותפקודיות של BBB ו BRB להישאר להיות לעומת בפירוט. עם זאת, פתולוגיות רשתית, במיוחד הפרת BRB, גם נקשרו בחוזקה עם ההתקדמות של מחלות שונות, כולל סוכרת 18-19 לספירה 21,22. לכן, זה עניין להקים מערכת תפקוד BRB לא רק להתוות את המנגנון אלא גם להקרין תרופות פוטנציאליות. בדו&quot;ח זה, תפקוד לקוי פרוטוקול המאפשר BRB באמצעות תרבות ברשתית חריפה פשוט מפותח והציג. חדירות BBB מוגברות שינויים פתולוגיים דמוית לספירה הוקמו תרבות המוח organotypic מודגרות עם היסטמין, מתווך פרו-דלקתי 12. לכן, במערכת הציגה, היסטמין היה Applמטען לתרבות רשתית vivo לשעבר כדי לגרום בעיות בתפקוד BRB. רשתיות מכמה מינים, כגון musculus Mus ו Bos Taurus, נבדקו. בשל זמינויות הדמיון המסחריות שלהם רקמה אנושית, נוצלו עיני חזירים טריות לספק את הנתונים המדווחים כאן. לאחר דוגרים עם היסטמין ו / או תרופות אחרות, את הרשתיות עובדו להערכה על ידי immunostaining במשך כמה חלבונים 12, כגון אימונוגלובולין G (IgG), אחד המרכיבים העיקריים של דם; גליה fibrillary חלבון חומצי (GFAP), סמן ידוע עבור הפעלת גליה; ו-הקשורים microtubule חלבון 2 (MAP2), חלבון cytoskeletal ספציפי נוירון חיוני להרכבה microtubule. יתר על כן, במודל השכבות של הרשתית מאפשר ניתוח מפורט של התהליכים של תאי מולר ותאי גנגליון, כגון שינויי הרוחב וההמשכיות שלהם. כך מספר פרמטרים נוספים זמינים להעריך את ההשלכות שלBRB הפרה בשלב מוקדם כדי להעריך את השפעות ההיפוך של טיפולים פוטנציאליים וכן. בפרוטוקול זה, תופעות היפוך הפוטנציאל של תרופות הוקרן מוערכים משלושה היבטים: דליפה של כלי הדם (BVS), הפעלת תאי גלייה והתגובה-נזק של תאים עצביים. כמה שיטות כימותים מנוצלות, למשל, את רמת הביטוי שמוצגת על ידי עוצמת immunostaining, מדידת רוחב של תהליך ורציפות תהליכים עצביים שמוצגים על ידי מסנן שיפור. כדי להמחיש את השיטה טובה יותר וכדי לסייע לפרש את התוצאות, lipoxin A4 (LXA4), תרכובת המסונתזת באופן אנדוגני בתגובה לפציעה דלקתית הפחתה בתפקוד האנדותל 23, נבחר למטרות הדגמה.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>J.T.Baker</td><td>4072-05</td><td></td></tr><tr><td>היסטמין&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>H7125-1G</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>מדיה מקפיאה&nbsp;</td><td>משולש מדעים ביו-רפואיים</td><td>TFM-5</td><td></td></tr><tr><td>סרום עיזים רגיל&nbsp;</td><td>Rockland</td><td>D104-00-0050</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>GFAP נוגדן</td><td>Millipore</td><td>AB5804</td><td></td></tr><tr><td>MAP2 נוגדן</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB3418</td><td></td></tr><tr><td>FITC מצומד חמור נגד ארנב IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.</td><td>711-095-152</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 מצומד חמור נגד עכבר IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.</td><td>715-165-150</td><td></td></tr><tr><td>מדיום הרכבה המכיל DAPI</td><td>Vector Laboratories, Inc.</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti מיקרוסקופ</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>המכונים הלאומיים לבריאות</td><td>1.45 שניות</td><td></td></tr></tbody></table>

במודל רשתית חריפה להערכת תרופות הפרת מכשול רשתית דם פוטנציאל הטיפול

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

הוקמה מערכת מודל זולה, קלה לשימוש ועוצמתית להערכת טיפולים פוטנציאליים שיכולים לשפר את פריצת מחסום הרשתית בדם. גורם דלקתי, היסטמין, הוכח כפוגע בשלמות כלי הדם ברשתית המתורבתת באמצעות צביעה חיובית של IgG מחוץ לכלי הדם. ההשפעות של היסטמין עצמו ושל תרופות מועמדות לטיפולים פוטנציאליים, כגון ליפוקסין A4, מוערכות באמצעות שלושה פרמטרים: דליפת כלי דם באמצעות צביעה אימונולוגית IgG, הפעלת תאי מולר באמצעות צביעת GFAP ושינוי בדנדריטים עצביים באמצעות צביעה ל-MAP2. יתר על כן, הארגון השכבתי של הרשתית מאפשר ניתוח מפורט של התהליכים של תאי מולר וגנגליון, כגון שינויים ברוחב ובהמשכיות. בעוד שהנתונים המוצגים הם עם תרבית רשתית חזירים, המערכת ישימה למספר מינים. לפיכך, המודל מספק כלי אמין לחקירת ההשפעות המוקדמות של פגיעה בשלמות כלי הדם ברשתית על סוגי תאים שונים וגם להערכת תרופות מועמדות פוטנציאליות לטיפול.

אנו מציגים מערכת בעלות נמוכה, זמן יעיל וקל לשימוש להעריך טיפולים פוטנציאל שיכול להגן מפני הפרת BRB המושרה על ידי היסטמין. IgG הוא מוגבל בתוך הכלי ברשתית ביקורת (איור 1 א), אך הדלפות מתוך כלי הדם בחשיפת היסטמין (איור 1B), המאשר כי המודל הוקם בהצלחה. LXA4 נבחר כדי להדגים את ההקרנה לתרופות נגד הפרת BRB במערכת הציגה. ת...

מערכת בעלות נמוכה, קלה לשימוש וחזק הוא הוקם כדי להעריך טיפולים פוטנציאל שיכול לשפר הפרת מחסום דם ברשתית המושרית על ידי היסטמין. דליפת כלי דם, הפעלת תא מולר ואת ההמשכיות של תהליכים עצביים מנוצלות כדי להעריך את תגובת הניזק והיפוכו עם תרופה פוטנציאלית, A4 lipoxin.

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

המטרה הכוללת של מערכת מודל רשתית זו ex vivo היא לסרוק תרופות המשפרות את הפרתו של מחסום הדם-עצב. שיטה זו יכולה לענות על מספר שאלות מפתח בתחום של מחלות ניווניות עצביות, כגון מהם האירועים המוקדמים, וכיצד ניתן לסרוק תרופות שיכולות לסייע בטיפול בחולים אלו. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא זולה, קלה לשימוש, מהירה וניתנת להתאמה.בדרך כלל, אנשים שאינם מכירים את השיטה זו יתקשו בביצועה, כיוון שהשגת נתונים מהימנים וניתנים לשחזור תלויה במיומנויות טכניות להפקת דגימות איכותיות. ראשית, בניסוי זה נעשה שימוש ברשתיות של חזירים שהושגו ממקור מסחרי. לאחר ההשגה מהמקור, יש לשמור את גלגלי העין בטמפרטורה של 4 °C, או על קרח, ולעבד אותם בהקדם האפשרי.התחילו את הניתוח בתוך מנדף לתרביות רקמה על ידי חיתוך מסביב לעדשה כדי לפתוח את מכסה העין. לאחר מכן, בעזרת מברשת, הסירו בעדינות את הזגוגית, מבלי למשוך את הרשתית. השתמשו במברשת כדי להפריד בעדינות את הרשתית מהקצה החתוך, כדי לחשוף את הדיסקיה הבصرية.נתקו את העצב האופטי באמצעות תער ושחררו את הרשתית. העבירו את הרשתית לצH dish ושטפו אותה בזהירות פעם אחת באמצעות HBSS קר. הניחו את הדגימה ב-HBSS על קרח.בשלב הבא, השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך את הרשתית לחצי באופן סימטרי. כאשר נדרשים טיפולים, חצי אחד של הרשתית מקבל טיפול, בעוד שהחצי השני של אותה רשתית יעובד כדי לקבוע את קו הבסיס ולהתקן עבור שונות בין בעלי החיים. העבר בעדינות את הדגימות לפלטה עם שש בארות המכילה 3 mL של תמיסת ייצוב לכל בארה.השרו את הרשתות (retinas) למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius באינקובטור עם אטמוספירה המכילה 5% carbon dioxide. לאחר הדגירה, שאבו בזהירות את מדיום הייצוב, והוסיפו שלשה מיליליטר של מדיום המכיל histamine ו-LXA4 לכל באר. הדגרו את הדגימות למשך שעה נוספת.לאחר שטיפה ב-PBS סטרילי חם, הוסיפו שלוש מיליליטר של 4% PFA לכל באר והדגירו למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. עם סיום זמן ההדגרה, שאבו במהירות את ה-PFA ושטפו את הדגימות פעם אחת עם PBS. הוסיפו 10% sucrose לבארות והדגירו למשך שעתיים עד ארבע שעות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.לאחר מכן, החליפו את ה-10% sucrose ב-30% sucrose והדגירו למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, ערבבו חלק אחד של תווך הקפאה מסחרי עם שני חלקים של 20% sucrose, כדי להכין תווך הקפאה לעבודה. השאירו בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך לילה או למשך זמן ממושך יותר עד להיעלמות בועות האוויר.ביום למחרת, החליפו את ה-30% sucrose בתמיסת קיבוע להקפאה (working freezing medium), והמתינו חמש דקות להגעה לשיווי משקל בטמפרטורת החדר. לאחר השיווי, גזרו כל רשתית למלבנים של שלושה מילימטר על חמישה מילימטר, ולאחר מכן הקפיאו את פרוסות הרשתית על ידי הנחתן בתמיסת קיבוע להקפאה, בתוך גליל של נייר אלומיניום. ודאו שפרוסות הרשתית ניצבות כדי להבטיח חתך רוחבי של הרשתית בעת השריחה, והקפיאו אותן בחנקן נוזלי.בצעו חיתוך של כל בלוק במקריוסט לפרוסות בעובי 14 מיקרון, והעבירו את הפרוסות לשקיות זכוכית. אחסנו את השקופיות בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס עד לשימוש. התחילו את הצביעה האימונוהיסטוכימית על ידי שטיפת הפרוסות בבופר פוספט סוכרוז 5%, או SPB.לאחר מכן, חסמו את אתרי ההיקשור הבלתי-ספציפיים על ידי דגירה של החתכים עם תמיסת חסימה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, דגרו את החתכים עם הנוגדן הראשוני המתאים למשך שעה אחת. עם סיום השעה, שאבו את התמיסה ושטפו את החתכים שלוש פעמים ב-5% SPB.לאחר מכן, דגרו את החתכים עם הנוגדנים המשניים המתאימים למשך שעה אחת, תוך הגנה מהאור. לאחר שטיפת החתכים שלוש פעמים ב-5%SPB, הכינו את הדגימות למיקרוסקופיה על ידי קיבוע שלהם בתווך המכיל DAPI, וכסייתם בזכוכית כיסוי. לבסוף, צלמו תמונות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי.כדי למדוד את רוחב השלוחות, השתמשו בכלי זכוכית ההגדלה כדי לבחור אזור בחתך שבו השלוחות נמצאות, כגון השכבה הגרעינית החיצונית. לאחר מכן, בחרו שדה אופטי שבו שלוחות אלו נראות ורציפות. לחצו על כלי הניתוח (analyze) בתפריט הראשי ולאחר מכן לחצו על הגדרת קנה מידה (set scale) בתפריט המשני, כדי להגדיר את סרגל קנה המידה בהתאם להגדרות המיקרוסקופ.בחרו בפונקציית הקו (line) בתפריט הראשי ושרטטו קו לאורך התהליך. לחצו על "ניתוח" (analyze) בתפריט הראשי, ולאחר מכן לחצו על "מדידה" (measure) בתפריט המשני, כדי לבצע את המדידה. כדי לנתח את הרציפות של התהליך, חזרו לתפריט הראשי והשתמשו בפונקציית הפוליגון (polygon) כדי לבחור את השכבה הפלקסיפורמית הפנימית (inner plexiform layer) כאזור העניין.מדוד את השטח על ידי לחיצה על analyze ולאחר מכן על measure. לחץ על process, לאחר מכן על filter ואז על variants, כדי להדגיש את הקצוות בתמונה על ידי החלפת כל פיקסל בגרסה השכנה שלו. לאחר מכן, כוונן אוטומטית את הניגודיות והבהירות על ידי לחיצה על image, לאחר מכן על adjust, על brightness and contrast, ואז על auto בתפריט המשני.לאחר מכן ספרו את הקווים. בתמונות אלו, תגובתיות חיסונית של IGG נראית באדום. בקבוצות הביקורת, IGG מוגבל לכלי הדם.בקבוצת ההיסטמין, IGG מזוהה מחוץ לכלי הדם, שם הוא יוצר ענני דליפה המסומנים בעיגולים מקווקווים. בקבוצות שטופלו ב-LXA4, IGG מוגבל שוב אל תוך כלי הדם. הוספה נוספת של LXA4 מחזירה את תפקוד כלי הדם שבעקבות ההיסטמין.היסטוגרמה זו מציגה את אחוז כלי הדם הדליפים בקבוצות שנבדקו. בתמונות אלו מוצגת צביעה אימונוהיסטוכימית ל-GFAP, הצובעת תאי Muller. צביעה חיובית מתקבלת בזרועות של תאי Muller, ברחבי הרשתית ובסביבת כלי הדם.מוצג רוחבם של שלוחות תאי מילר (Muller cells) מכל הקבוצות. טיפול בהיסטמין, או ב-LXA4 לבדם, הפחית את רוחב השלוחות. עם זאת, כאשר שני הרכיבים הוחלו יחד, רוחב השלוחות שוחזר.בתמונות אלו מוצג צביעה אימונוהיסטוכימית ל-MAP2. נצפתה צביעה חיובית של שלוחות וגופי תא של תאי גנגליון. מוצגת הצפיפות של שלוחות תאי גנגליון חיוביות ורציפות ל-MAP2 מכל הקבוצות.טיפול בהיסטמין מפחית את הרציפות של בליטות דנדריטיות, בעוד של-LXA4 אין השפעות משמעותיות. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע ניסוי זה תוך שלושה עד חמישה ימים, במידה והוא מבוצע כהלכה, כאשר מוקדשים חמש דקות לכל רשתית עבור הדיסקציה, שש דקות לטיפול, ולאחר מכן חיתוך, צביעה אימונוהיסטוכימית ואנליזה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב להשתמש ברקמה טרייה ובביקורות מתאימות.בעקבות הליך זה, ניתן להוסיף שיטות אחרות, כגון דימיון חי (live imaging), כדי לעקוב בזמן אמת אחר שינויים ברמות הסידן ובמאפייני המיטוכונדריה. לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות לכם הבנה טובהB של אופן השימוש במודל זה של תרבית רשתית אקוטית ex vivo, לצורך יצירת תפקוד לקוי של ה-BRB, הערכת הנזק וסריקה של תרופות פוטנציאליות. תודה רבה על הצפייה ובהצלחה בניסוייכם.

an-acute-retinal-model-for-evaluating-blood-retinal-barrier-breach

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

יצירת הפרדות רשתית ניסיונית עם גובה לשעתק ומתמשך של ניתוק, וללא דימום subretinal, היא חשובה ללימוד הפתופיזיולוגיה של אובדן תאי קולטי אור ברשתית מחלה והערכה של התערבויות טיפוליות פוטנציאליות. כאן אנו מדווחים שיטה כזו בפירוט.

רשתית דגם ניתוק במכרסמים על ידי הזרקת subretinal של נתרן Hyaluronate

מאמר זה מתאר הליך גרימת פציעה איסכמיה-רה-פרפוזיה הרשתית על ידי לחץ תוך עיני מוגבר בעכברים. פציעת איסכמיה-רה-פרפוזיה רשתית על ידי לחץ תוך עיני מוגבר משמשת מודל פתולוגיות אנושי מתאפיין חמצן שנפרץ משלוח מזין ברשתית, המאפשר לחוקרים לבחון מנגנונים הסלולר פוטנציאל וטיפולים למחל אדם של היחידה העצבה וכלי דם ברשתית.

במודל עכבר של רשתית איסכמיה reperfusion נזק ע&quot;י העלאת רמת הלחץ התוך עיני

רטינופתיה הנגרמת על ידי חמצן (OIR) יכולה לשמש למודל מחלות רשתית איסכמיות כגון רטינופתיה של פגות ורטינופתיה סוכרתית מתפשטת ולשמש כמודל למחקרים הוכחת הרעיון בהערכת תרופות אנטי אנגיוגניות למחלות ניאו-שריריות. OIR גורם neovascularization חזק לשחזור ברשתית שניתן לכמת.

מודל רטינופתיה הנגרמת על ידי חמצן למחלות רשתית איסכמיות במכרסמים

רטינופתיה סוכרתית היא אחד הגורמים המובילים לעיוורון. היסטולוגיה, בדיקת פירוק מחסום רשתית דם, ואנגיוגרפיה פלואורסצנטית הן טכניקות בעלות ערך להבנת הפתופיזיולוגיה של הרשתית, אשר יכול לשפר עוד יותר את ההקרנה היעילה של סמים נגד רטינופתיה סוכרתית.

הערכה פתופיפיזיולוגית של רשתית במודל חולדה

פרוטוקול זה מדגים בדיקת טרנסציטוזה של תאי אנדותל במבחנה כמודל להערכת חדירות מחסום הדם-רשתית הפנימית על ידי מדידת יכולתם של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ברשתית האנושית להעביר פרוקסידאז חזרת על פני תאים בתהליכי הובלה טרנס-תאיים בתיווך caveolae.

בדיקת טרנסציטוזה של תאי אנדותל כמודל In vitro להערכת חדירות מחסום הרשתית הפנימית בדם

מחלות עיניים ניווניות המשפיעות על שכבת אפיתל פיגמנט הרשתית של העין יש מקורות מונוגניים ופוליגניים. מספר מודלים של מחלות ויישום תוכנה, LipidUNet, פותחו כדי לחקור מנגנונים של מחלות, כמו גם התערבויות טיפוליות פוטנציאליות.

שיטה מבוססת ליפידים-למידת מכונה לאפיון וכימות משקעי שומנים באמצעות אפיתל פיגמנט רשתית שמקורו ב-iPSC

פיתחנו מספר פרוטוקולים לגרימת נזק ברשתית או ניוון רשתית בראשנים מסוג Xenopus laevis . מודלים אלה מציעים את האפשרות לחקור מנגנוני התחדשות רשתית.

יצירת מודלים של פגיעות רשתית בראשנים של קסנופוס

בדיקת הגנה פותחה כדי לעקוב אחר עמידות כלי הדם ברשתית למוות מעלבונות הקשורים לסוכרת / רטינופתיה סוכרתית כגון מתח חמצוני וציטוקינים.

בדיקה לגילוי הגנה על כלי הדם ברשתית מפני מוות הקשור לסוכרת בעכברים

פרוטוקול זה מדגמן פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה ברשתית בעין עכבר על ידי השראת איסכמיה ברשתית באמצעות צינורית החדר הקדמי והעלאת הלחץ התוך עיני, ולאחר מכן נורמליזציה של לחץ תוך עיני כדי להתחיל את הרפרפוזיה.

אינדוקציה של פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה ברשתית במודל עין עכבר

מחקר זה מציג מתודולוגיה להעברת טיפולים לרשתית ולעצבי הראייה של החולדה הבוגרת. בנוסף, מוצגת שיטה ייחודית לאחזור רקמות לאיסוף מלמעלה למטה של עצב הראייה והרשתית בחולדה בוגרת.

מתן טיפולי בעיניים ושליפת רקמות מתקדמת בחולדות בוגרות

למדו להשתמש במודל רשתית חריפה אקס ויוו לבדיקת תרופות להפרת מכשול רשתית הדם. השיטה מבוססת על רשתיות חזיר ומאפשרת הערכת נזק ושיקום באמצעות lipoxin A4 במחקרי נוירודגנרציה.

במודל רשתית חריפה להערכת תרופות הפרת מכשול רשתית דם פוטנציאל הטיפול

גלה סרטונים נוספים