במודל רשתית חריפה להערכת תרופות הפרת מכשול רשתית דם פוטנציאל הטיפול

מערכת בעלות נמוכה, קלה לשימוש וחזק הוא הוקם כדי להעריך טיפולים פוטנציאל שיכול לשפר הפרת מחסום דם ברשתית המושרית על ידי היסטמין. דליפת כלי דם, הפעלת תא מולר ואת ההמשכיות של תהליכים עצביים מנוצלות כדי להעריך את תגובת הניזק והיפוכו עם תרופה פוטנציאלית, A4 lipoxin.

המטרה הכוללת של מערכת מודל רשתית ex vivo זו היא לסנן תרופות, המשפרות את פריצת המחסום העצבי בדם. שיטה זו יכולה לענות על כמה שאלות מפתח בתחום של מחלות ניווניות עצביות, כמו למשל מהם האירועים המוקדמים, וכיצד אנו יכולים לסנן תרופות שיכולות לסייע בטיפול בחולים אלה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא בעלות נמוכה, קלה לשימוש, מהירה וניתנת להתאמה.

בדרך כלל אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהשגת נתונים אמינים וניתנים לשחזור תלויה בכישורים הטכניים ליצירת דגימות טובות. ראשית, משתמשים כאן ברשתית חזירים, המתקבלת ממקור מסחרי. לאחר הרכישה מהמקור, יש לשמור את גלגלי העיניים בארבע מעלות, או על קרח, ולעבד אותם בהקדם האפשרי.

התחל את הדיסקציה במכסה המנוע של תרבית רקמות על ידי חיתוך סביב העדשה כדי לפתוח את מכסה העין. לאחר מכן בעזרת מברשת, הסר בעדינות את ההומור הזגוגי, מבלי למשוך את הרשתית. השתמש במברשת כדי לנתק בעדינות את הרשתית מהקצה החתוך, כדי לחשוף את הדיסק האופטי.

נתק את עצב הראייה בעזרת סכין גילוח ושחרר את הרשתית. מעבירים את הרשתית לצלחת פטרי ושוטפים בזהירות את הרשתית פעם אחת באמצעות HBSS קר. הניחו את הדגימה ב-HBSS על קרח.

לאחר מכן, השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך את הרשתית לשניים בצורה סימטרית. כאשר נדרשים טיפולים, מטפלים במחצית אחת של הרשתית, ואילו בחצי השני של אותה רשתית יש לעבד כדי לקבוע את קו הבסיס ולתקן את הווריאציות של בעלי החיים. העבירו בעדינות את הדגימות לצלחת בת שש בארות המכילה שלושה מיליליטר מדיום ייצוב לבאר.

יש לאזן את הרשתית למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור כאשר האטמוספירה מכילה 5% פחמן דו חמצני. לאחר הדגירה יש לשאוב בזהירות את מדיום הייצוב, ולהוסיף שלושה מיליליטר מדיום המכיל היסטמין ו- LXA4 לכל באר. דגרו את הדגימות למשך שעה נוספת.

לאחר שטיפה עם PBS סטרילי חם, הוסיפו שלושה מיליליטר של 4% PFA לכל באר ודגרו למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שחלף זמן הדגירה, שאפו במהירות את ה-PFA ושטפו את הדגימות פעם אחת עם PBS. הוסיפו 10% סוכרוז לבארות ודגרו במשך שעתיים עד ארבע שעות בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, החליפו את הסוכרוז של 10% בסוכרוז של 30% ודגרו למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן מערבבים חלק אחד של מדיום הקפאה מסחרי עם שני חלקים 20% סוכרוז, כדי להפוך את מדיום ההקפאה העובד. השאירו בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה או יותר עד שבועות האוויר נעלמות.

למחרת, החלף את הסוכרוז של 30% במדיום מקפיא עובד, ואפשר לו להתייצב במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שיווי המשקל, חתוך כל רשתית למלבנים של שלושה מילימטר על חמישה מילימטרים, ולאחר מכן הקפיאו את פרוסות הרשתית על ידי הנחתן במדיום הקפאה, הכלול בגליל של נייר אלומיניום. ודא שפרוסות הרשתית אנכיות כדי לספק חתך רוחב של הרשתית בעת החיתוך, והקפיא אותן בחנקן נוזלי.

חתכו כל בלוק על קריוסטט לפרוסות של 14 מיקרון, והרכיבו את החלקים על שקופיות זכוכית. אחסן את השקופיות בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש. התחל צביעה חיסונית על ידי שטיפת החלקים עם מאגר פוספט סוכרוז 5%, או SPB.

לאחר מכן חסום את אתרי הקישור הלא ספציפיים, על ידי דגירה של החלקים וחסימת המאגר למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן דגרו על החלקים עם הנוגדן הראשוני המתאים למשך שעה. לאחר שחלפה השעה, שאפו את התמיסה ושטפו את החלקים שלוש פעמים ב-5% SPB.

לאחר מכן דגרו את החלקים עם הנוגדנים המשניים המתאימים למשך שעה, כשהם מוגנים מפני אור. לאחר שטיפת החלקים שלוש פעמים עם 5% SPB, הכינו את הדגימות למיקרוסקופיה על ידי הרכבתן במדיום המכיל DAPI, וכיסוי בהחלקות כיסוי. לבסוף, צלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.

כדי למדוד את רוחב התהליך, השתמש בכלי זכוכית מגדלת כדי לבחור אזור במקטע שבו התהליכים נבלעים, כגון השכבה הגרעינית החיצונית. לאחר מכן בחר שדה אופטי שבו תהליכים כאלה נראים ורציפים. לחץ על כלי הניתוח בתפריט הראשי ולאחר מכן לחץ על הגדר קנה מידה בתפריט המשנה, כדי להגדיר את סרגל קנה המידה בהתאם להגדרה המיקרוסקופית.

בחר את פונקציית הקו בתפריט הראשי וצייר קו לאורך התהליך. לחץ על נתח בתפריט הראשי ולאחר מכן לחץ על מדידה בתפריט המשנה כדי לבצע את המדידה. כדי לנתח את המשכיות התהליך, חזור לתפריט הראשי והשתמש בפונקציית המצולע כדי לבחור את שכבת הפרספקס הפנימית כאזור העניין.

מדוד את האזור על-ידי לחיצה על נתח ולאחר מכן מדוד. לחץ על תהליך, סינון ולאחר מכן וריאנטים, כדי לשפר את הקצוות בתמונה על-ידי החלפת כל פיקסל במשתנה השכונתי שלו. לאחר מכן התאם באופן אוטומטי את החדות והבהירות על-ידי לחיצה על תמונה, התאמה, בהירות וניגודיות ולאחר מכן אוטומטי בתפריט המשנה.

לאחר מכן ספור את השורות. בתמונות אלה, תגובתיות חיסונית של IGG נראית באדום. בקבוצות ביקורת, IGG מוגבל בתוך כלי הדם.

בקבוצת ההיסטמין, IGG מזוהה מחוץ לכלי הדם, שם הוא יוצר ענני דליפה המסומנים על ידי עיגולים מנוקדים. בקבוצות שטופלו ב-LXA4, IGG שוב מוגבל בתוך כלי הדם. תוספת נוספת של LXA4 מצילה את תפקוד כלי הדם המושרה על ידי היסטמין.

היסטוגרמה זו מציגה את אחוז כלי הדם הדולפים בין הקבוצות שנבדקו. בתמונות אלה מוצג צביעה חיסונית ל-GFAP, שמכתים תאי מולר. צביעה חיובית מתקבלת בתהליכים של תאי מולר, על פני הרשתית וסביב כלי הדם.

מוצג רוחב תהליכי תא מולר, מכל הקבוצות. טיפול בהיסטמין, או LXA4 בלבד, הפחית את רוחב התהליך. אך כאשר שני הריאגנטים יושמו יחד, רוחב התהליך ניצל.

בתמונות אלה מוצג צביעה חיסונית עבור MAP2. נצפתה צביעה חיובית מהתהליכים וגופי התאים של תאי גנגליון. מוצגת הצפיפות של תהליכי תאי גנגליון חיוביים מתמשכים של MAP2 מכל הקבוצות.

טיפול בהיסטמין מקטין את המשכיות התהליכים הדנדריטיים, בעוד של-LXA4 אין השפעות משמעותיות. לאחר שליטה, ניתן לבצע ניסוי זה תוך שלושה עד חמישה ימים, אם הוא מבוצע כראוי, עם חמש דקות לכל רשתית לדיסקציה, שש דקות לטיפול, ולאחר מכן חתך, צביעה חיסונית וניתוח. בעת ניסיון הליך זה, חשוב להשתמש ברקמות טריות ובבקרות מתאימות.

בעקבות הליך זה, ניתן להוסיף שיטות אחרות כגון הדמיה חיה, כדי לעקוב אחר שינויים בזמן אמת ברמות הסידן ותכונות המיטוכונדריה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש במודל תרבית רשתית חריפה ex vivo זה, כדי ליצור תפקוד לקוי של BRB, להעריך את הנזק ולסנן תרופות פוטנציאליות. תודה רבה על הצפייה וכל טוב עם הניסויים שלך.