Name: תנודות Band גמא הקלטה Pedunculopontine Nucleus נוירונים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: למדו שיטה לאיתור תנודות סף גבוה ותת-סף בנוירוני גרעין Pedunculopontine. השיטה מאפשרת חקר תכונות ממברנה פנימיות המשמרות תדירות ירי בתחום תנודות Band גמא.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מתקני הליבה של המרכז למדעי המוח התרגומיים הנתמכים על ידי פרס ה-NIH P20 GM103425 ו-P30 GM110702 לד"ר גרסיה-ריל. עבודה זו נתמכה גם על ידי מענקים מ-FONCYT-Agencia Nacional de Promociòn Cientìfica y Tecnològica; BID 1728 OC.AR. PICT-2012-1769 ו-UBACYT 2014-2017 #20120130101305BA (לד"ר אורבנו).

כל פרוטוקולי הניסוי אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש מאוניברסיטת ארקנסו למדעי הרפואה (# מספר פרוטוקול 3593) והם היו תמימי דעים עם ה- National Institutes of הנחיות בריאות לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה. 1. הכנת הנוזל השדרתי תקן-מלאכותי (aCSF) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת מאגר הפתרון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 700 מ&quot;ל מים מזוקקים מבחנה 1 L נקי לפני הוספת כימיקלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוך ערבוב נפח ברציפות של 500 מ&quot;ל, להוסיף 136.75 גרם של NaCl, 6.99 גרם של KCl, 2.89 גרם של MgSO 4, ו 2.83 גרם של לאא 2 PO 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים מים מזוקקים יותר להגיע נפח סופי של 1 ל לאחר דילול, את הריכוז הסופי של כל המתחם הוא 117 מ&quot;מ NaCl, 4.69 מ&quot;מ KCl, 1.2 מ&quot;מ MgSO 4, ו 1.18 מ&quot;מ לאא 2 PO 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשמור בקירור ב 4 ° C עד 2 שבועות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת מאגר הפתרון B <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 700 מ&quot;ל מים מזוקקים מבחנה 1L נקי לפני הוספת כימיקלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוך ערבוב נפח ברציפות של 500 מ&quot;ל, להוסיף 41.45 גרם של D-גלוקוז 41.84 גרם של NaHCO 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים מים מזוקקים יותר להגיע נפח סופי של 1 ל לאחר דילול, את הריכוז הסופי של כל המתחם הוא 11.5 מ&quot;מ D- גלוקוז ו -24.9 מ&quot;מ NaHCO 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשמור בקירור ב 4 ° C עד 2 שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני כל תערובת הניסוי 50 מ&quot;ל של המניה עם 50 מ&quot;ל המניה B ומביאים 1 ליטר עם מים מזוקקים כדי להשיג פתרון aCSF הריכוז הסופי ולהשאיר ב RT בעוד ברציפות מחמצנים אותו עם carbogen (95% O 2 - 5% CO 2 תערובת) לפחות 30 דקות. כן aCSF לריכוז סופי רק בתחילת כל ניסוי וזורק בסוף היום. </li></ol></li></ol> 2. הכנת הנוזל השדרתי סוכרוז-מלאכותית(סוכרוז-aCSF) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת מאגר הפתרון C <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 700 מ&quot;ל מים מזוקקים מבחנה 1 L נקי לפני הוספת כימיקלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוך ערבוב רציף 500 מ&quot;ל מים מזוקקים, להוסיף 240 גרם של סוכרוז, 6.55 גרם של 3 NaHCO, 0.671 גרם של KCl, 4.88 גרם של MgCl 2, 0.22 גר &#39;CaCl 2 ו 0.21 גרם של חומצה אסקורבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים מים מזוקקים יותר להגיע נפח סופי של 1 ל לאחר דילול, את הריכוז הסופי של כל המתחם הוא סוכרוז 701.1 מ&quot;מ, 78 מ&quot;מ 3 NaHCO, 9 מ&quot;מ KCl, 24 מ&quot;מ MgCl 2, 1.5 מ&quot;מ CaCl 2 ו -1.2 מ&quot;מ חומצה אסקורבית . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור C פתרון המניה ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני כל תערובת הניסוי 300 מ&quot;ל של 50 מ&quot;ל של C המניות עם 600 מ&quot;ל מים מזוקקים כדי להשיג את הפתרון סוכרוז-aCSF בריכוז הסופי ולהשאיר ב RT בעוד ברציפות מחמצנים אותו עם carbogen (95% O 2 - 5% CO 2 תערובת) לפחות 30 דקות. </li></ol&gt; </li></ol> 3. הכנת Slice <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כוס נקי עם 100 מ&quot;ל תמיסת סוכרוז-aCSF בקרח תוך חמצון זה עם carbogen ולתקן את ה- pH 7.4 באמצעות מד pH תוך הוספת כמה טיפות של 0.1 פתרון M NaOH (כאשר pH &lt;7.4) או 0.1 פתרון M HCl (כאשר pH&gt; 7.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את תא חיתוך של vibratome עם-aCSF סוכרוז חמצן זה. הפעל את מערכת הקירור מבוסס גליצרול מצמידה את תא החיתוך ולחכות 15 דקות כדי לאפשר לו להתקרר ל 4 - 0 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים גורי חולדה (בגילאי 9 עד 12 ממבוגר מתוזמן בהריון חולדות Sprague-Dawley) עם קטמין (70 מ&quot;ג / ק&quot;ג, IP; באמצעות &lt;50 μl נפח סופי). כאשר הגור הוא רגוע, בדוק היטב כי רפלקס הזנב קמצוץ נעדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערוף גורים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את עור ראש longitudinally מן מלפנים לאחור באמצעות סכין אזמל פלדת פחמן, ולמשוך את העור לצדדים באמצעות מלקחיים. חותכים את העצם המכסה את המוח הזזת SCissors רוחבית לחלוטין להסיר אותו כדי לחשוף את המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ואז, במהירות להסיר את המוח בעזרת מרית (להציב תחילה תחת נורת חוש הריח כדי לדחוף את המוח בעדינות מן המקורי ביותר כלפי אזורי הזנב ביותר). דחף בעדינות את המוח לתוך הנוזל השדרתי מלאכותי סוכרוז מחומצן מקורר קרח (סוכרוז-aCSF). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע חתך parasagittal על האונה הימנית (הסרה כשליש האונה), ודבק בצד הגזוז של המוח על גבי דיסק מתכתי שייקבע מגנטי לתא החיתוך של vibroslicer לחתוך חלקי sagittal 400 מיקרומטר המכילים את גרעין pedunculopontine (PPN). שמור פרוסות של HBC ב RT במשך 45 דקות לפני הקלטות תיקון- clamp כל תא. </li></ol> 4. תנודות הקלטות גמא-band ב Slices של HBC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת הפתרון תאי אשלגן גלוקונאט (High-K + פתרון) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים בקרח בכוס נקייה עם 10 מ&quot;ל מים מזוקקים. תוך ערבוב רציף להוסיף: K + -gluconate, 90.68 מ&quot;ג phosphocreatine di טריס מלח, 47.66 HEPES מ&quot;ג, 1.5 מ&quot;ג EGTA, 40.58 מ&quot;ג Mg 2+ -ATP, ו -4 מ&quot;ג Na + 2 -GTP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם ל- pH 7.3 עם KOH (100 מ&quot;מ במים מזוקקים). מוסיפים מים מזוקקים כדי להגיע נפח סופי של 20 מ&quot;ל. במידת הצורך, להתאים osmolarity עם סוכרוז (100 מ&quot;מ במים מזוקקים) להיות 280 - 290 mOsm. לאחר דילול, את הריכוז הסופי של כל המתחם הוא 124 מ&quot;מ K + -gluconate, 10 מ&quot;מ phosphocreatine di טריס מלח, 10 HEPES מ&quot;מ, 0.2 מ&quot;מ EGTA, 4 מ&quot;מ Mg 2+ -ATP, ו -0.3 מ&quot;מ Na + 2 -GTP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרונות תאיים Aliquot ב 1 מ&quot;ל צינורות ולהקפיא ב -20 ° C. השתמש aliquot אחד ליום ולשמור על 4 מעלות צלזיוס במהלך הניסויים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקלטות כל תא צמד תיקון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים פרוסות בתא טבילה ו perfuse אותם (1.5 מ&quot;ל / דקה) עם מחומצן(95% O 2 - 5% CO 2) aCSF המכיל את אנטגוניסטים לקולטן הבאים: אנטגוניסט לרצפטור NMDA סלקטיבית חומצה 2-אמינו-5-phosphonovaleric (APV, 40 מיקרומטר), תחרותי קולטן הגלוטמט AMPA / Kainate אנטגוניסט 6-cyano-7- nitroquinoxaline-2,3-Dione (CNQX, 10μM), סטריכנין אנטגוניסט לרצפטור גליצין (STR, 10 מיקרומטר), ה GABA ספציפית gabazine אנטגוניסט לקולטן (GBZ, 10 מיקרומטר), ו tetrodotoxin חוסם ערוץ נתרן (TTX, 3μM) הערה: התוצאות והדמויות, אנטגוניסטים אלה יכונו חוסמי הסינפטי כמו או SBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את טפטפות תיקון הקלטה (התנגדות 2-7 MΩ; עשוי קבועות, זמין נימי זכוכית בורוסיליקט קיר עבות המסחרי של 1.0 מ&quot;מ קוטר חיצוני 0.6 מ&quot;מ קוטר פנימי) עם פתרון גבוה K + תאי באמצעות זמינים מסחריים תופסי תיקון- פיפטה עם מסנן פתרון. הכנס את פיפטה מחזיק של המגבר שלה. למרוח קופה קטנהלחץ itive באמצעות מזרק 1 מ&quot;ל מחובר לבעל פיפטה באמצעות צינורית סיליקון מחוברת שסתום משולשת. חבר את הגב של בעל פיפטה מגבר מהדק תיקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את פיפטה הקלטה באמצעות micromanipulator מכני ליד הגרעין של HBC באמצעות המטרה 4X בשילוב לאופטיקה התערבות ההפרש לעומת זאת האינפרה-אדום הקרוב. הערה: הגרעין של HBC ניתן לצפות הגבי פרוסות אל peduncle המוח הקטן המעולה (SCP; הנצפה כמו צרור עבה של אקסונים). טפטפות הקלטה אותרו PPN pars compacta, הנמצא מיד הגב עד הסוף האחורי של peduncle. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביא פיפטה ההקלטה במגע עם הנוירון של HBC בעוד דמיין באמצעות עדשת טבילה במים 40X, במהירות להחיל יניקה שלילית כדי ליצור חותם עם התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנה חותמת מתח- clamp לפקח התנגדות פיפטה במהלך יניקה שלילית באמצעות הפרוטוקול של היצרן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר s שליליuction הוא גדל לאט ערכי התנגדות יושבים וקוראים ליד צג תיקון- clamp על קצה פיפטה להגיע 80 - 100 mOhm, במהירות לשנות את פוטנציאל ההחזקה כדי -50 mV ולשחרר את הלחץ השלילי. התחל ברציפויות החלת יניקה שלילית עד פקיעת גישת הקרום והחשמלי של נוירון מושגת בתצורת כל התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם ערכי התנגדות הגישה נמדדו על ידי התוכנה חותם מתח- הידוק 10 mOhm ומעלה, ואז להמשיך וליישם יניקה שלילית בכמויות קטנות יותר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפצות קיבול (כלומר, הארעיים איטיים ומהירים ציינו לאחר פקיעת הקרום של התא) והתנגדות סדרה במצב מתח- clamp. חלף מצב הקלטת מהדק נוכחי, ולפצות ערכי גשר במהירות (למשל, להעביר ידית מגבר או לחץ על תפריט הפיצוי האוטומטי באמצעות עכבר computer&#39;s). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח באופן רציף פוטנציאל הממברנה במנוחה של נוירון PPN מוקלט uלשיר פרוטוקול של היצרן. אם נחים משמרת פוטנציאל הממברנה לערכים depolarizing או hyperpolarizing, אז השתמשו בכמות קטנה של זרם חשמלי קבוע (עד 100 PA) כדי לשמור על הערך הסופי אופטימלי -50 mV. הערה: שמור נוירונים של HBC רק עם פוטנציאל הממברנה המנוחה יציבה (RMP) של -48 mV או יותר hyperpolarized (כלומר, RMP &lt;-48 mV). </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Profice, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurophysiological+evaluation+of+the+pedunculopontine+nucleus+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural.+Transm+%28Vienna%29%22%5BJournal%5D)">Neurophysiological evaluation of the pedunculopontine nucleus in humans.</a> J. Neural. Transm (Vienna). 118 (10), 1423-1429 (2011).</li>
<li>Steriade, M., Datta, S., Pare, D., Oakson, G., Curro Dossi, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activities+in+brain-stem+cholinergic+nuclei+related+to+tonic+activation+processes+in+thalamocortical+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal activities in brain-stem cholinergic nuclei related to tonic activation processes in thalamocortical systems.</a> J. Neurosci. 10 (8), 2541-2559 (1990).</li>
<li>Steriade, M., Dossi, R. C., Pare, D., Oakson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+oscillations+%2820-40+Hz%29+in+thalamocortical+systems+and+their+potentiation+by+mesopontine+cholinergic+nuclei+in+the+cat%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Fast oscillations (20-40 Hz) in thalamocortical systems and their potentiation by mesopontine cholinergic nuclei in the cat.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88 (10), 4396-4400 (1991).</li>
<li>Deurveilher, S., Hennevin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lesions+of+the+pedunculopontine+tegmental+nucleus+reduce+paradoxical+sleep+%28PS%29+propensity%3A+evidence+from+a+short-term+PS+deprivation+study+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Lesions of the pedunculopontine tegmental nucleus reduce paradoxical sleep (PS) propensity: evidence from a short-term PS deprivation study in rats.</a> Eur. J. Neurosci. 13 (10), 1963-1976 (2001).</li>
<li>Steriade, M., Pare, D., Datta, S., Oakson, G., Curro Dossi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+cellular+types+in+mesopontine+cholinergic+nuclei+related+to+ponto-geniculo-occipital+waves%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Different cellular types in mesopontine cholinergic nuclei related to ponto-geniculo-occipital waves.</a> J. Neurosci. 10 (8), 2560-2579 (1990).</li>
<li>Steckler, T., Inglis, W., Winn, P., Sahgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pedunculopontine+tegmental+nucleus%3A+a+role+in+cognitive+processes%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Brain+Res.+Rev%22%5BJournal%5D)">The pedunculopontine tegmental nucleus: a role in cognitive processes?</a> Brain Res. Brain Res. Rev. 19 (3), 298-318 (1994).</li>
<li>Garcia-Rill, E., Simon, C., Smith, K., Kezunovic, N., Hyde, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pedunculopontine+tegmental+nucleus%3A+from+basic+neuroscience+to+neurosurgical+applications%3A+arousal+from+slices+to+humans%3A+implications+for+DBS%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural.+Transm%22%5BJournal%5D)">The pedunculopontine tegmental nucleus: from basic neuroscience to neurosurgical applications: arousal from slices to humans: implications for DBS.</a> J. Neural. Transm. 118 (10), 1397-1407 (2011).</li>
<li>Mazzone, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantation+of+human+pedunculopontine+nucleus%3A+a+safe+and+clinically+relevant+target+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Implantation of human pedunculopontine nucleus: a safe and clinically relevant target in Parkinson's disease.</a> Neuroreport. 16 (17), 1877-1881 (2005).</li>
<li>Simon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma+band+unit+activity+and+population+responses+in+the+pedunculopontine+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Gamma band unit activity and population responses in the pedunculopontine nucleus.</a> J. Neurophysiol. 104 (1), 463-474 (2010).</li>
<li>Kezunovic, N., Urbano, F. J., Simon, C., Hyde, J., Smith, K., Garcia-Rill, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+behind+gamma+band+activity+in+pedunculopontine+nucleus+%28PPN%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanism behind gamma band activity in pedunculopontine nucleus (PPN).</a> Eur. J. Neurosci. 34 (3), 404-415 (2011).</li>
<li>Hyde, J. R., Kezunovic, N., Urbano, F. J., Garcia-Rill, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+properties+of+high+speed+calcium+oscillations+in+the+pedunculopontine+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol+%281985%29%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal properties of high speed calcium oscillations in the pedunculopontine nucleus.</a> J. Appl. Physiol (1985). 115 (9), 1402-1414 (2013).</li>
<li>Llinas, R. R., Leznik, E., Urbano, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+binding+via+cortical+coincidence+detection+of+specific+and+nonspecific+thalamocortical+inputs%3A+a+voltage-dependent+dye-imaging+study+in+mouse+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Temporal binding via cortical coincidence detection of specific and nonspecific thalamocortical inputs: a voltage-dependent dye-imaging study in mouse brain slices.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (1), 449-454 (2002).</li>
<li>Boucetta, S., Cisse, Y., Mainville, L., Morales, M., Jones, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discharge+profiles+across+the+sleep-waking+cycle+of+identified+cholinergic%2C+gabaergic%2C+and+glutamatergic+neurons+in+the+pontomesencephalic+tegmentum+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Discharge profiles across the sleep-waking cycle of identified cholinergic, gabaergic, and glutamatergic neurons in the pontomesencephalic tegmentum of the rat.</a> J. Neurosci. 34 (13), 4708-4727 (2014).</li>
<li>Datta, S., Siwek, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+activity+patterns+of+pedunculopontine+tegmentum+neurons+across+the+sleep-wake+cycle+in+the+freely+moving+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Single cell activity patterns of pedunculopontine tegmentum neurons across the sleep-wake cycle in the freely moving rats.</a> J. Neurosci. Res. 70 (4), 79-82 (2002).</li>
<li>Datta, S., Siwek, D. F., Stack, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+cholinergic+and+non-cholinergic+neurons+in+the+pons+expressing+phosphorylated+cyclic+adenosine+monophosphate+response+element-binding+protein+as+a+function+of+rapid+eye+movement+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identification of cholinergic and non-cholinergic neurons in the pons expressing phosphorylated cyclic adenosine monophosphate response element-binding protein as a function of rapid eye movement sleep.</a> Neuroscience. 163 (1), 397-414 (2009).</li>
<li>Kayama, Y., Ohta, M., Jodo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Firing+of+%27possibly%27+cholinergic+neurons+in+the+rat+laterodorsal+tegmental+nucleus+during+sleep+and+wakefulness%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Firing of 'possibly' cholinergic neurons in the rat laterodorsal tegmental nucleus during sleep and wakefulness.</a> Brain Res. 569 (2), 210-220 (1992).</li>
<li>Sakai, K., El Mansari, M., Jouvet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+by+carbachol+microinjections+of+presumptive+cholinergic+PGO-on+neurons+in+freely+moving+cats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition by carbachol microinjections of presumptive cholinergic PGO-on neurons in freely moving cats.</a> Brain Res. 527 (2), 213-223 (1990).</li>
<li>Lindsley, D. B., Bowden, J. W., Magoun, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+upon+the+EEG+of+acute+injury+to+the+brainstem+activating+system%5BTitle%5D)+AND+%22Electroenceph.+Clin.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Effect upon the EEG of acute injury to the brainstem activating system.</a> Electroenceph. Clin. Neurophysiol. 1 (4), 475-486 (1949).</li>
<li>Moruzzi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sleep-waking+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Ergeb.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The sleep-waking cycle.</a> Ergeb. Physiol. 64, 1-165 (1972).</li>
<li>Moruzzi, G., Magoun, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+stem+reticular+formation+and+activation+of+the+EEG%5BTitle%5D)+AND+%22Electroenceph.+Clin.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Brain stem reticular formation and activation of the EEG.</a> Electroenceph. Clin. Neurophysiol. 1 (4), 455-473 (1949).</li>
<li>Steriade, M., Constantinescu, E., Apostol, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlations+between+alterations+of+the+cortical+transaminase+activity+and+EEG+patterns+of+sleep+and+wakefulness+induced+by+brainstem+transections%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Correlations between alterations of the cortical transaminase activity and EEG patterns of sleep and wakefulness induced by brainstem transections.</a> Brain Res. 13 (1), 177-180 (1969).</li>
<li>Ishibashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orexin+receptor+activation+generates+gamma+band+input+to+cholinergic+and+serotonergic+arousal+system+neurons+and+drives+an+intrinsic+Ca2%2B+-dependent+resonance+in+LDT+and+PPT+cholinergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+Neurol%22%5BJournal%5D)">Orexin receptor activation generates gamma band input to cholinergic and serotonergic arousal system neurons and drives an intrinsic Ca2+ -dependent resonance in LDT and PPT cholinergic neurons.</a> Frontiers Neurol. 6, e120(2015).</li>
<li>Brown, R. E., Winston, S., Basheer, R., Thakkar, M. M., McCarley, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+characterization+of+neurons+in+the+dorsolateral+pontine+REM+sleep+induction+zone+of+the+rat%3A+intrinsic+membrane+properties+and+responses+to+carbachol+and+orexins%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological characterization of neurons in the dorsolateral pontine REM sleep induction zone of the rat: intrinsic membrane properties and responses to carbachol and orexins.</a> Neuroscience. 143 (3), 739-755 (2006).</li>
<li>Goetz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+role+of+the+pedunculopontine+nucleus+and+mesencephalic+reticular+formation+in+locomotion+in+non-human+primates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">On the role of the pedunculopontine nucleus and mesencephalic reticular formation in locomotion in non-human primates.</a> J. Neurosci. 36 (18), 4917-4929 (2016).</li>
<li>Fraix, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pedunculopontine+nucleus+area+oscillations+during+stance%2C+stepping+and+freezing+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Pedunculopontine nucleus area oscillations during stance, stepping and freezing in Parkinson's disease.</a> PLOS ONE. 8 (12), e83919(2013).</li>
<li>Luster, B., Hyde, J., D'Onofrio, S., Urbano, F. J., Garcia-Rill, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+behind+gamma+band+activity+in+the+pedunculopontine+nucleus+%28PPN%29%5BTitle%5D)+AND+%22Abstr+Soc+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms behind gamma band activity in the pedunculopontine nucleus (PPN).</a> Abstr Soc Neurosci. 38, 257.20(2014).</li>
<li>Luster, B., D'Onofrio, S., Urbano, F. J., Garcia-Rill, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-threshold+Ca2%2B+channels+behind+gamma+band+activity+in+the+pedunculopontine+nucleus+%28PPN%29%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rep%22%5BJournal%5D)">High-threshold Ca2+ channels behind gamma band activity in the pedunculopontine nucleus (PPN).</a> Physiol. Rep. 3 (6), e12431(2015).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

יש PPN נוירונים נכסים מהותיים המאפשרים להם לירות פוטנציאל פעולה בתדרי להקה בטא / גמא במהלך הקלטות vivo ב מחיות שהן ערות או במהלך שנת רע&quot;מ, אבל לא בזמן שנת גל איטי 2,3,5,13-17. חוקרים אחרים הראו transections גזע המוח כי יותר רמות קדמיות מאשר PPN מופחת תדרי גמא במהלך הקלטות EEG. עם זאת, כאשר נגעים בגזע המוח אחוריים שבו גרעין זה ממוקם, הגירוי הישיר של HBC מותר הביטוי של פעילות גמא קליפת מוח על EEG 2,3,5,18-21. הלהקה גמא פעילות עצבית דווחה העכבר של ...

גרעין של HBC כלול אנטומית של tegmentum mesencephalic הזנב. PPN הוא מרכיב מרכזי של RAS 1. PPN משתתף בשמירה על מדינות מופעלות התנהגותיות (כלומר, להעיר, רע&quot;מ) 2. גירוי חשמלי של PPN in vivo המושרה תנודה מהירה (20 - 40 Hz) ב EEG קליפת המוח 3, בעוד נגעים של HBC הבילטרלי עכברוש צומצמו או בוטלו רע&quot;מ 4. בעוד שרוב הנוירונים של HBC לירות פוטנציאל פעולה ב בטא / תדר גמא-band (20 - 80 הרץ), כמה נוירונים מוצגים שיעורים נמוכים של ירי ספונטני (&lt;10 Hz) 5. יתר על כן, של HBC נראה מעורב בהיבטים אחרים של התנהגות כגון מוטיבציה ותשומת לב 6. בתדירות גבוהה ישיר (40 - 60 Hz) 7 גירוי חשמלי של הגרעין של HBC בחיות decerebrate יכול לקדם תנועה. בשנים האחרונות, גירוי מוחי עמוק (DBS) של HBC כבר המשמשת לטיפול בחולים הסובלים הלוך ושובהפרעות מ מעורבים גירעונות הילוך כגון מחלת פרקינסון (PD) 8. דיווחים קודמים הראו כי כמעט כל הנוירונים של HBC יכולים לפטר פוטנציאל פעולה בתדר להקת גמא כאשר depolarized באמצעות 9 פולסים נוכחיים רבועים. בגלל ההפעלה דרסטי של תעלות אשלגן מתח מגודרת במהלך depolarizations פולסים מרובע עד או תחת -25 mV. כתוצאה מכך, אין תנודות גמא חזקות נצפו לאחר חסימת דור פוטנציאל פעולה באמצעות tetrodotoxin 10. במאמץ לעקוף בעיה כזאת, 1 - 2 שניות ארוכות depolarizing רמפות נוכחיות היו בשימוש. רמפות depolarized פוטנציאל הממברנה בהדרגה נח ערכים של עד 0 mV, בעוד inactivating חלקית תעלות אשלגן מתח מגודרת. תנודות קרום להקת גמא נקה ניכרו בתוך חלון תלות מתח ערוצי סידן סף גבוה (כלומר, בין -25 mV ו -0 mV) 10. לסיכום, להקת גמא פעילויותיוty נצפתה בנוירונים של HBC 9, ושניהם P / Q- ו- N-סוג מתח מגודר ערוצי סידן צריכות להיות מופעל כדי ליצור תנודות להקת גמא ב PPN 10. בסדרת מחקרים קבעו את המיקום של תעלות סידן סף גבוה בנוירונים HBC. הזרקת השילוב של צבעים, דימות פלואורסצנטי ratiometric הראתה ארעי סידן דרך תעלות סידן מתח מגודר אשר מופעלות דנדריטים שונים כאשר depolarized באמצעות רמפות נוכחיות 11. נכסים מהותיים של נוירונים של HBC הוצעו כדי לאפשר הפעלה בו זמנית של תאים אלה בזמן הערות ושנת REM, ובכך גרימת פעילות עצבית תנודתית בתדירות גבוהה בין RAS ולולאות thalamocortical. אינטראקציה כזו לכת ארוכה נחשבת תומכת במדינת מוח מסוגלת להעריך את העולם באופן מהימן סביבנו על בסיס מתמשך 12. כאן אנו מתארים את הניסויתנאים אל צורך ליצור ולתחזק תנודת להקה גמא בתאים של HBC במבחנה. פרוטוקול זה לא תואר בעבר, ויעזור מספר הקבוצות ללמוד תכונות הממברנה פנימיות בתיווך פעילות להקת גמא ב אזורי מוח אחרים. יתר על כן, צעדים נוכחיים עשויים להוביל למסקנה המוטעית כי פעילות להקת גמא לא יכולה להיוצר בתאים אלה.

<table><tbody><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S8501</td><td>C12H22O11, משקל מולקולרי = 342.30</td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td>NaHCO3, משקל מולקולרי = 84.01</td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td>KCl, משקל מולקולרי = 74.55</td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד Hexahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td>MgCl2 &middot; 6H2O, משקל מולקולרי =&nbsp; 203.30</td></tr><tr><td>סידן כלוריד דיהידראט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C3881</td><td>CaCl2 &middot; 2H2O, משקל מולקולרי = 147.02</td></tr><tr><td>D-(+)-גלוקוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G5767</td><td>C6H12O6, משקל מולקולרי = 180.16</td></tr><tr><td>L-חומצה אסקורבית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5960</td><td>C6H8O6, משקל מולקולרי = 176.12</td></tr><tr><td>נתרן</td> כלורי <td>Acros Organics</td><td>327300025</td><td>NaCl, משקל מולקולרי =&nbsp; 58.44</td></tr><tr><td>אשלגן גלוקונאט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G4500</td><td>C6H11KO7, משקל מולקולרי =&nbsp; 234.25</td></tr><tr><td>מלח פוספוקריאטין די(טריס)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P1937</td><td>C4H10N3O5P &middot; 2C4H11NO3, משקל מולקולרי =&nbsp; 453.38</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>C8H18N2O4S, משקל מולקולרי = 238.30</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E0396</td><td>[-CH2OCH2CH2N(CH2CO2H)2]2, משקל מולקולרי = 380.40</td></tr><tr><td>מלח מגנזיום אדנוזין 5'-triphosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td>&nbsp; C10H16N5O13P3 &middot; xMg2+, משקל מולקולרי = 507.18</td></tr><tr><td>גואנוזין 5'-טריפוספט נתרן מלח הידרט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G8877</td><td>C10H16N5O14P3 &middot; xNa+, משקל מולקולרי = 523.18</td></tr><tr><td>טטרודוטוקסין ציטראט</td><td>Alomone Labs</td><td>T-550</td><td>C11H17N3O8, משקל מולקולרי = 319.27</td></tr><tr><td>&nbsp; DL-2-אמינו-5-חומצה פוספונובלרית</td><td>סיגמא-אולדריץ</td>' <td>A5282</td><td>&nbsp; C5H12NO5P, משקל מולקולרי = 197.13</td></tr><tr><td>CNQX מלח דיסודיום הידרט&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C239</td><td>C9H2N4Na2O4 &middot; xH2O, משקל מולקולרי = 276.12</td></tr><tr><td>Strychnine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0532</td><td>C21H22N2 O2, משקל מולקולרי = 334.41</td></tr><tr><td>מקמילמין הידרוכלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M9020</td><td>&nbsp; C11H21N &middot; HCl, משקל מולקולרי = 203.75</td></tr><tr><td>גבזין (SR-95531)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S106</td><td>C15H18BrN3O3, משקל מולקולרי = 368.23</td></tr><tr><td>קטמין הידרוכלוריד</td><td>מיילן</td><td>67457-001-00</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>Nikon</td><td>Eclipse E600FN</td><td></td></tr><tr><td>מכשירי סאטר מיקרומניפולטור</td><td></td><td>ROE-200</td><td></td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור</td><td>סאטר מכשירים</td><td>MPC-200</td><td></td></tr><tr><td>מגבר</td><td>התקנים מולקולריים</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>ממיר A/D</td><td>התקנים מולקולריים</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>מחמם</td><td>וורנר אינסטרומנטס</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>משאבת</td><td>קול-פארמר</td><td>Masterflex L/S 7519-20</td><td></td></tr><tr><td>מחסנית משאבה</td><td>Cole-Parmer</td><td>Masterflex 7519-85</td><td></td></tr><tr><td>חולץ פיפטות</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>מצלמה</td><td>Q-Imaging</td><td>RET-200R-F-M-12-C</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica Biosystems</td><td>&nbsp; Leica VT1200 S</td><td></td></tr><tr><td>מערכת קירור</td><td>מכשירי ויברטום</td><td>900R</td><td></td></tr><tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>Nikon</td><td>Eclipse E600FN</td><td></td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור</td><td>Sutter Instruments</td><td>ROE-200</td><td></td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור</td><td>Sutter Instruments</td><td>MPC-200</td><td></td></tr><tr><td>מגבר</td><td>מכשירים מולקולריים</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>ממיר A/D</td><td>התקנים מולקולריים</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>מחמם</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>משאבת</td><td>Cole-Parmer</td><td>Masterflex L/S 7519-20</td><td></td></tr><tr><td>מחסנית משאבה</td><td>Cole-Parmer</td><td>Masterflex 7519-85</td><td></td></tr><tr><td>חולץ פיפטה</td><td>סאטר מכשירים</td><td>מצלמת P-97</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Q-Imaging</td><td>RET-200R-F-M-12-C</td><td></td></tr></tbody></table>

תנודות band גמא הקלטה pedunculopontine nucleus נוירונים

Recording Gamma Band Oscillations in Pedunculopontine Nucleus Neurons

Efferents Synaptic מן PPN ידועים לווסת את הפעילות העצבית של כמה אזורים התלמוס intralaminar (למשל, centrolateral / parafascicular; גרעין Cl / PF). הפעלתי גם את HBC או גרעיני Cl / Pf in vivo תואר לנצל את השפעתה על העוררות של חית תוספת בפעילות להקת גמא ב אלקטרואנצפלוגרם קליפת המוח (EEG). המנגנונים התאיים עבור הדור של תנודות להקת גמא ב רשתי מערכת הפעלה (RAS) נוירונים זהים לאלה שנמצאו ליצור תנודות להקה גמא בגרעיני מוחות אחרים. במהלך הקלטה נוכחיים מהדקים של נוירונים של HBC (מ פרוסות parasagittal מן 9 - 25 יום בן חולדות), שימוש depolarizing צעדים מרובעים מופעל במהירות תעלות אשלגן מתח תלוי שמנעו נוירונים של HBC מלהיות depolarized מעבר -25 mV. הזרקת 1 - 2 שניות ארוכות depolarizing רמפות נוכחיות depolarized בהדרגת הקרום של HBC מיל הפוטנציאלטינג ערכי כלפי 0 mV. עם זאת, פולסים מרובעים depolarizing הזרקה שנוצרו תנודות גמא-band של פוטנציאל הממברנה שהראו להיות קטן משרעת לעומת התנודות שנוצרו על ידי רמפות. כל הניסויים בוצעו בנוכחות תעלות נתרן מתח מגודרת וחוסמים קולטניים הסינפטי מהר. הוכח כי הפעלת ערוצי סידן תלוי מתח גבוה-סף ביסוד פעילות תנודתית גמא-band בנוירונים HBC. התערבויות מתודולוגיים תרופתיות ספציפיות מתוארות כאן, מתן הכלים הדרושים כדי לעודד ו לקיים PPN תנודת להקת גמא התת במבחנה.

בתחילה, תנודות גמא היו עוררות באמצעות פולסים נוכחי רבוע. הקלטת מהדק הנוכחית של נוירונים של HBC בנוכחות חוסמי הסינפטי TTX הייתה פיקוח רציף על מנת להבטיח כי פוטנציאל הממברנה נח נשמר יציבות ב ~ -50 mV (איור 1 א). שני פולסים נוכחיים שניים ארוכים מרובעים הוזרקו intracellularly ידי מהדק תיקון המגבר דרך פיפטה ההקלטה, הגדלת המשרעת שלהם בין 200 PA 600 PA (איור 1 א). פוטנציאל ממברנה היה depolarized לרמות מתח קרוב ל -20 mV כא...

גרעין pedunculopontine (PPN) ממוקם בגזע המוח ונוירונים שלה מופעלים מקסימאלי בזמן ערות לבין תנועות עיניים מהירות (REM) מצבי השינה המוח. עבודה זו מתארת ​​את הגישה הניסויית לרשום תנודת קרום התת להקה גמא במבחנה בנוירונים HBC.

תנודות Band גמא הקלטה Pedunculopontine Nucleus נוירונים

Synaptic efferents from the PPN are known to modulate the neuronal activity of several intralaminar thalamic regions (e.g., the ...

המטרה הכללית של הדגמה זו היא לתאר שיטה לזיהוי תנודות מעל הסף (high threshold) ותנודות תת-ספיות (subthreshold) בנוירונים פדונקולופונטיים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות בנוגע לאופן שבו תאים שומרים על תדירות הפריקה שלהם, למשל. כיצד אוכלוסיות של תאים שומרות על תדירות הפריקה שלהן?אנו יודעים שמעגלים אינם יכולים לתחזק תנודות של פס גמא או 40 עד 60 פעמים לשנייה. לכן, נדרשות תכונות ממברנה אינטרינסיות כדי לתחזק תדר יריה מסוג זה. את הפרוצדורה ידגימו סוזן מהאפי וד"ר סטסיה ד'אנופריו.להכנת aCSF סטנדרטי, הכינו תחילה תמיסות מלאי A ו-B ושמרו אותן בקירור בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך עד שבועיים. לפני כל ניסוי, ערבבו 50 milliliters של מלאי A עם 50 milliliters של מלאי B. לאחר מכן, השלימו את התערובת לנפח של ליטר אחד באמצעות מים מזוקקים וחמצננו אותה באמצעות קרבוגן בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפחות. העבירו לכלי ביקר לערבוב וחמצון.לאחר ההבעבוע, הוסיפו את סידן כלוריד. לאחר מכן, הכינו sucrose aCSF באמצעות הכנת תמיסת מלאי C. לפני כל ניסוי, ערבבו 300 milliliters של מלאי C עם 600 milliliters של מים מזוקקים וחמצננו אותה עם קרבוגן בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפחות. לאחר מכן, העבירו 100 milliliters של תמיסת sucrose aCSF לכלי כימי נקי, הניחו אותה על קרח והמשיכו בחמצנונה באמצעות קרבוגן.כעת, מלאו תא חיתוך של ויברטום (vibratome) ב-aCSF עם סוכרוז ושמרו עליו מחומצן. הפעילו את מערכת הקירור מבוססת הגליצרין המחוברת לתא החיתוך והמתינו 15 דקות כדי לאפשר לו להתקרר לכ-4°C. לאחר מכן, הוציאו את מוח הגור על ידי הנחת ספטולה מתחת לפחית הריח (olfactory bulb) ודחיפה עדינה שלה מהאזור הרוסטרלי ביותר לעבר האזור הקודאלי ביותר.לאחר מכן, העבירו את המוח אל sucrose aCSF מחומצן ומקורר בקרח. בצעו חיתוך פארא-סגיטלי (parasagittal) בחצי הכדור הימני כדי להסיר כ-1/3 מחצי הכדור. לאחר מכן, הדביקו את הצד החתוך של המוח אל הדיסק המתכתי.לאחר מכן, קבעו את הדיסק המתכתי לתא החיתוך של הוויברטום (vibratome) וחתכו פלטים סגיטליים בעובי 400 מיקרון המכילים את ה-PPN. השאירו את פלטי ה-PPN בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות לפני ביצוע הקלטת whole-cell patch clamp. בהליך זה, העבירו פלח לתא הטבילה, הניחו מעליו רשת כדי להחזיק את הפלח למטה, ובצעו פרפוזיה בקצב של 1.5 milliliters per minute עם aCSF מחמצן המכיל את האנטגוניסט הנבחר לרצפטור.על מנת לבודד תכונות ממברנה פנימיות, יש לחסום את התמסורת הסינפטית המהירה סביב התא וכן לחסום את היכולת לייצר פוטנציאלי פעולה; לכן, יש להשתמש בחוסמי סינפסות ובטטרודוטוקסין, או TTX, כדי לחסום פוטנציאלי פעולה. באופן זה, התא שבו מבצעים את ה patched הוא זה שמייצר את התכונות הללו, ולא קלט סינפטי הוא האחראי להן, וזהו הנושא הנלמד כאן: תכונת ממברנה פנימית. לאחר מכן, מלאו את פיפטת ההקלטה בתמיסה תוך-תאית בעלת ריכוז גבוה של אשלגן.הכנס את הפיפטה למחזיק בראש הבמה (headstage holder). לאחר מכן, הפעל לחץ חיובי קטן באמצעות מזרק של 1 ml המחובר למחזיק הפיפטה. באמצעות עדשה של 4x יחד עם אופטיקה של ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC) באינפרא-אדום קרוב, אתר את גרעין ה-PPN, שנמצא דורסלית לרגל השסעית העליונה של המוח הקטן (superior cerebellar peduncle).הורד לאט את פיפט ההקלטה אל גרעין ה-PPN באמצעות מיקרו-מניפולטור מכני. לאחר מכן, מקם את פיפט ההקלטה ב-PPN pars compacta, הנמצאת מיד דורסלית לקצה האחורי של ה-peduncle. באמצעות עדשת טבילה במים של 40x, הבא את פיפט ההקלטה למגע עם נוירון ה-PPN, והחל במהירות שאיבה שלילית כדי ליצור אטימה (seal) עם התא.השתמש בתוכנת voltage clamp seal כדי לנטר את התנגדות הפיפטה במהלך שאיבה שלילית. לאחר מכן, הגדל באיטיות את הלחץ השלילי. כאשר ערך התנגדות הפיפטה מגיע ל-80 עד 100 megaohms, שנה במהירות את פוטנציאל ההחזקה ל-50 millivolts ושחרר את הלחץ השלילי.הפעיל לחץ שלילי באופן רציף עד לקריעת ממבנה התא ולהשגת גישה חשמלית בתצורת wholesale. לפני השאיבה, ההתנגדות נמוכה, ובמקרה זה, 2.5 megaohms. עם הפעלת השאיבה, אמפליטודת הפסיעה פוחתת לקראת שלב ההחזקה.כאשר נוצר האיטום, שימו לב שההתנגדות עולה ל-167 megaohms. עם שאיבה נוספת, נוצר gigaseal. ההתנגדות עולה לזמן קצר ל-1.2 gigaohms לפני השגת גישה מלאה.נטר באופן רציף את פוטנציאל הממברנה במצב מנוחה של נוירון ה-PPN המוקלט. אם פוטנציאל הממברנה במצב מנוחה זז לעבר ערכי דפולריזציה או היפר-פולריזציה, החל זרם ישיר בכמות קטנה כדי לשמור על פוטנציאל אופטימלי של 50 millivolts. הסיבה לשימוש בשיפועי זרם (current ramps) היא כדי שנוכל לבצע דפולריזציה איטית של הממברנה מבלי להפעיל תעלות פוטשיום, אשר מונעות דפולריזציה של הממברנה לרמה גבוהה מספיק כדי להגיע לסף של תעלות הסידן בעלות הסף הגבוה שאנו חוקרים.מוצגים כאן פוטנציאלי ממברנה מייצגים המגיבים למדרגות ריבועיות דפולריזנטיות באורך של שתי שניות, של זרם עולה שהוזרק תוך-תאי דרך פיפט ההקלטה בנוכחות חוסמי סינפסות ו-TTX. איור זה מציג ספקטרום הספק של תנודות הממברנה שהשרו על ידי מדרגות הזרם המצוינות בשלוש הקלטות. התדרים שהושרו היו כולם בעלי הספק נמוך ותדר נמוך.איור זה מציג רמפות זרם של 200, 400 ו-700 picoamps ואת התגובות של הממברנה. שימו לב כי הממברנה דפולריזית מספיק כדי להגיע ל-30 millivolts, שבהם תעלות סידן בעלות סף גבוה מתחילות להיפתח, כפי שמופיע בהקלטה הכחולה, ולרמה של 10 millivolt שבה אמפליטודת התנודה שלהן היא מקסימלית, כפי שמופיע בהקלטה האדומה. גרף זה מציג ספקטרום הספק של תנודות הממברנה שהושרות על ידי רמפות הזרם בשלוש ההקלטות התואמות.התדרים שהושרו על ידי שיפוע של 400 picoamp היו בטווח הבטא, ואלו שהושרו על ידי שיפוע של 700 picoamp היו בטווח הגמא. ברגע שהטכניקה נלמדת היטב, ניתן לבצעה בערך בשעה אחת או פחות. בזמן ביצוע ההקלטה, חשוב מאוד לוודא שישנו איטום הדוק וכי הפיצוי על הקיבול (capacity compensation) וההתנגדות טורית (series resistance) מנוטרים היטב כדי להבטיח שלא חלו שינויים משמעותיים במהלך הליך ההקלטה.לאחר שבידלתם את התנודות הללו, תוכלו לבצע בדיקה כדי לקבוע אם הן אכן מתווכות על ידי תעלות סידן מסוג N או מסוג P/Q. ניתן להשתמש ב-conotoxin כדי לחסום תנודות של תעלות מסוג N וב-agatoxin כדי לחסום תנודות של תעלות מסוג P/Q. עם פיתוח טכניקה זו, הפך הדבר לקל הרבה יותר להוכיח כי תעלות סידן בעלות סף גבוה היו אכן תלויות להיווצרות תנודות ממברנה פנימיות, וזו הייתה פריצת דרך בתחום חקר השינה לקבוע כי המערכת המעירה הרשתית (reticular activating system) מסוגלת למעשה להפיק תנודות בתדר גמא באופן עצמאי.

recording-gamma-band-oscillations-in-pedunculopontine-nucleus-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

פעילות עצבית במערכות לעתים קרובות מחייב הפרשות סינכרוני פוטנציאל פעולה מתא עצב בתוך אוכלוסייה מסוימת. לדוגמה, פולסים של הורמון גונדוטרופין משחררים (GnRH) סביר לדרוש פעילות מתואמת בין הנוירונים GnRH. אנו מציגים גישה מתודולוגית שלנו אמין קבלת הקלטות אלקטרו סימולטני של נוירונים GnRH מופץ diffusely.

Dual סומטיים הקלטות מ-שחרור גונדוטרופין (GnRH) הורמון נוירונים מזוהה על ידי חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ב Slices ההיפותלמוס

הסרטון מדגים את השיטה להקלטת תנודות גמא-פס בנוירוני PPN. באמצעות אזור מוח קשת עם חוסמים סינפטיים ב- aCSF, הוא משתמש בפעימות זרם חיובי באמצעות פיפטת טלאי כדי לפתוח תעלות סידן, וגורם לפעילות תת-סף חיונית לערות.

הקלטת תנודות פס גמא מתאי עצב של גרעין פדונקולופונטין בפרוסת מוח

סרטון זה מדגים את ההליך המפורט להכנת חולדה מורדמת להקלטות אלקטרופיזיולוגיות של פעילות מוחית מאתרים מרובים. הקרקפת מנותחת כדי לגשת לגולגולת, וחורים נקדחים במקומות מדויקים כדי להתקין ולאבטח אלקטרודות. אלקטרודות מיקרו-חוט טונגסטן מוכנסות לאחר מכן למיקום היעד כדי להקליט את הנתונים.

In Vivo רישומים אלקטרופיזיולוגיים של פעילויות מוחיות מאתרים מרובים בחולדות

סרטון זה מדגים את התהליך של גרימת תנודות גמא CA1 מקומיות בפרוסת מוח של עכבר היפוקמפוס CA1 באמצעות סימולציות טטניות. שיטה זו חשובה להבנת פעילות הרשת העצבית.

יצירת תנודות גמא מקומיות של Cornu Ammonis 1 (CA1) באמצעות גירויים טטניים בפרוסת מוח בהיפוקמפוס

הפיתוח האחרון של כלים מדעי המוח המשלבים גנטיקה ואופטיקה, המכונה "optogenetics", מאפשר שליטה על פעילות מעגלים עצבית ברמה חסרת תקדים של רזולוציה מרחב ובזמן. כאן אנו מספקים פרוטוקול לשילוב בהקלטה vivo עם המניפולציה optogenetic של תת קבוצות גנטית מוגדרות של תאי עצב בקליפת המוח פירמידה וsubicular הקדם חזיתית.

שיטה לנאמנות גבוהה בקרת optogenetic של פרט פירמידת נוירונים<em&gt; בvivo</em

תנודות הן מאפייני רשת בסיסיים והם מווסתים על ידי מחלה ותרופות. לומד תנודות המוח פרוסה מאפשר אפיון של רשתות מבודדות בתנאים מבוקרים. פרוטוקולים ניתנים להכנת פרוסות מוח חריפות ללעורר תנודות γ CA1.

דור של תנודות γ CA1 מקומיות על ידי גירוי Tetanic

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להקלטת קצבית רשת עצבית theta ו תנודות גמא מ הכנה בהיפוקמפוס שלם מבודד. אנו מתארים את השלבים ניסיוני מן החילוץ של ההיפוקמפוס לפרטים של שדה, יחידית תא שלם קליפת הקלטות מהדק, כמו גם צעדה optogenetic של קצב theta.

כוונון להקת הטטה בהיפוקמפוס<em&gt; במבחנה</em&gt; מתודולוגיות להקלטת מכרסמת מבודדת מעגל ספוטוהיפוקמפוס

במחקר זה, מתודולוגיה מוצג על איך לבצע באתר מרובה in vivo הקלטות אלקטרו מכיון hyperdirect תחת הרדמה urethane.

חַד<em&gt; בויבו</em&gt; הקלטות אלקטרו של הפוטנציאל שדה מקומי פעילות מרובת יחידות מן מסלול Hyperdirect ב חולדות הרדמה

פרוטוקול זה מתאר את ההקלטה של פוטנציאל שדה מקומי עם רב shank סיליקון ליניארי רגשים. המרה של האותות באמצעות ניתוח צפיפות המקור הנוכחי מאפשר השחזור של הפעילות החשמלית המקומית בהיפוקמפוס העכבר. בטכניקה זו, תנודות המוח מוגבל יכול להילמד במעבר בחופשיות עכברים.

הקלטה במרחב מוגבל תנודות בהיפוקמפוס מתנהגים באופן עכברים

פרוטוקול זה מציג שיטה להדמיית פעילות אוכלוסיה עצבית עם רזולוציה של תא יחיד במינים לא מהונדסים של חוליות באמצעות צבעים רגישים למתח ספיגה ומערך פוטודיודות. גישה זו מאפשרת זרימת עבודה מהירה, שבה ניתן לבצע הדמיה וניתוח במהלך יום אחד.

הדמיה אופטית מבוססת פוטודיודה להקלטת דינמיקה ברשת עם רזולוציית נוירון יחיד בבלתי חוליות לא מהונדסים

כאן, אנו מציגים שני פרוטוקולים לרישום מיקרו-אלקטרוקורטיקוגרפיה בצפיפות גבוהה (μEcoG) בחולדות ועכברים, כולל שיטות כירורגיות, השתלה והקלטה. הקלטות μECoG מבוצעות בשילוב עם הקלטת פוליטרודה למינרית בקליפת המוח השמיעתית של החולדה או עם מניפולציה אופטוגנטית של פעילות עצבית בקליפת המוח הסומטוסנסורית של העכבר.

חקירות רב-ממדיות של עיבוד קליפת המוח על ידי שילוב פוליטרודים למינאריים ואופטוגנטיקה עם מיקרו אלקטרוקורטיקוגרפיה במכרסמים

למדו שיטה לאיתור תנודות סף גבוה ותת-סף בנוירוני גרעין Pedunculopontine. השיטה מאפשרת חקר תכונות ממברנה פנימיות המשמרות תדירות ירי בתחום תנודות Band גמא.

תנודות Band גמא הקלטה Pedunculopontine Nucleus נוירונים

גלה סרטונים נוספים