סינתזה ואפיון של prodrug אספירין-fumarate המעכבת תאי גזע סרטניים פעילות השד NFκB

המטרות הכלליות של הליך זה הן להדגים כיצד מסונתזת התרופה האנטי דלקתית אספירין-פומרט GTCpFE, וכיצד היא משפרת את פעילות תאי הגזע האנטי-NFkappaB והאנטי-סרטניים בתאי סרטן השד. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הטיפולים בסרטן על ידי הצגת כיצד אנו יכולים לייעד מחדש או אפילו לשפר תרופות אנטי דלקתיות כדי למקד תאי גזע של סרטן השד העמידים לטיפול. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנו משתמשים בגישה הרב-תחומית כדי להשיג ולאפיין את הפרו-תרופה המשופרת אספירין-פומראט.

מי שתדגים את הסינתזה של הפרו-תרופה אספירין-פומרט GTCpFE תהיה לורוהמה דלגדו-ריברה, סטודנטית לתואר שני במעבדתו של ד"ר גרגורי תאצ'ר. ואילו הפעילות האנטי-NFkappaB של GTCpFE בתאי סרטן השד תודגם על ידי גרגנה ג'ורג'יבה, חוקרת סטודנטית לרוקחות במעבדתו של ד"ר ג'ונה פרסור. בעזרת מזרק בוכנה מפלסטיק מודדים 0.81 מיליליטר מתנול ומערבבים אותו ב -10 מיליליטר מים בבקבוק תחתון עגול.

מצננים את התערובת המתקבלת לאפס מעלות צלזיוס על ידי הנחת הבקבוק באמבט מי קרח. הוסף 2.48 מיליגרם של אלכוהול 4-הידרוקסיבנזיל לתערובת התגובה. מערבבים עד שהתמיסה צלולה.

לאחר מכן, הכינו תמיסה של O-acetylsalicyloyl chloride בטולואן נטול מים על ידי המסת המומס בממס בבקבוק נפרד. בעזרת מזרק בוכנה מפלסטיק מוסיפים תמיסה זו לתערובת האלכוהול 4-הידרוקסיבנזיל ומשאירים את התגובה תוך ערבוב באפס מעלות צלזיוס. עקוב אחר התגובה באמצעות כרומטוגרפיה של שכבה דקה, או TLC, כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

לאחר השלמת התגובה, הסר את אמבט מי הקרח ואפשר לתגובה לערבב בטמפרטורת החדר למשך 20 שעות. מסננים את המשקעים באמצעות משפך בוכנר עם דיסק מטושטש בעל נקבוביות בינונית. לאחר מכן, הניחו את המוצק בבקבוקון נצנוץ והשאירו את התרכובת בוואקום למשך הלילה בחומר ייבוש בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, אטמו בקבוק תחתון עגול מיובש היטב בעזרת מחיצה ונקבו אותו בעזרת מחט המחוברת למערכת משאבת ואקום. נפחו בלון באמצעות גז ארגון וחברו אותו למזרק פלסטיק בעזרת מחט. הכנס את המחט המחוברת לבלון הארגון דרך המחיצה האוטמת את הבקבוק התחתון העגול והסר את המחט המחוברת למשאבת הוואקום.

לאחר מכן, הוסף 4-הידרוקסימתיל-פניל אסטר, של חומצה 2-אצטילוקסיבנזואית, 4-דימתילאמינופירידין וטרימתילאמין, לבקבוק נפרד. ממיסים את הכימיקלים בחמישה מיליליטר של טטרהידרופוראן נטול מים. בעזרת מזרק פלסטיק המחובר למחט, הוסף את התמיסה לבקבוק התחתון העגול האטום.

מצננים את התערובת לאפס מעלות צלזיוס על ידי הנחת הבקבוק באמבט מי קרח. לתערובת הקודמת מוסיפים תמיסה של אתיל פומרויל כלוריד וטטרהידרופוראן נטול מים בטיפה לאורך תקופה של 10 דקות. מערבבים את התערובת המתקבלת במשך שעתיים עד ארבע שעות ומנטרים את התגובה על ידי TLC כמתואר בפרוטוקול.

חלץ את תערובת התגובה על ידי הוספתה למשפך הפרדה יחד עם 100 מיליליטר אתיל אצטט ו -50 מיליליטר מי מלח. מכסה את המשפך ונער אותו במרץ. הטה את המשפך לצד המכסה, פתח לאט את השסתום כדי לאפשר לאוויר לברוח.

לאחר השלמת המיצוי, הסר את השלב המימי וחזור על החילוץ פעמיים נוספות. לאחר הסרת השלב הימי, יבש את התערובת על ידי הוספת נתרן גופרתי לשלב האורגני עד שהמוצק לא יתגבש בעת ערבוב כלי הזכוכית. בעזרת משפך בוכנר אחר עם דיסק מצומצם, מסננים את התערובת לבקבוק תחתון עגול כדי להסיר את הנתרן הגופרתי.

לאחר מכן, התאדו לייבוש באמצעות מאייד סיבובי כשהטמפרטורה מוגדרת על 40 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הכינו עמוד עם סיליקה ג'ל ושלב הממס המתאים. לאחר הוספת התרכובת, הוסף שכבה של נתרן גופרתי כדי להגן על העמודה בעת הוספת הממס.

בזמן שהעמודה פועלת, עקוב אחר הפליטה על ידי TLC. זהה כל מבחנה אחרת כשהם נאספים מהעמודה. כאשר המוצר המעניין מדולל, מערבבים את כל הדגימות המכילות מוצר טהור לבקבוק גדול עם תחתית עגולה.

יבש את המוצרים באמצעות מאייד סיבובי כאשר טמפרטורת האמבטיה מוגדרת על 40 מעלות צלזיוס. בצע תרבית תאים והעביר את התאים עם DNA לבדיקת מדווח לוציפראז אלמנט התגובה NFkappaB כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן ממיסים תמיסות מלאי תרופות של GTCpFE או תרופות אספירין בדימתיל סולפוקסיד בריכוז פי 1000.

לאחר 16 שעות של טרנספקציה ומיקרוליטר אחד של רכב או פתרונות מלאי תרופות שונים לכל באר. לאחר הוספת התרופות יש לדגור על התאים למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. כדי להפעיל את מסלול NFkappaB, בציטוקין הפרו-דלקתי, TNFalpha, לכל באר לריכוז סופי של 10 ננוגרם למיליליטר.

כלול גם בקרת TNFalpha בלבד. לאחר דגירה של התאים במשך ארבע שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, יש לשאוב את המדיום. אחסן את התאים במינוס 80 מעלות צלזיוס.

מדוד לוציפראז באמצעות מערכת בדיקת מדווח לוציפראז בהתאם להוראות היצרן. כדי לבצע את בדיקת הממוספרה, הכינו תחילה את מדיום הממוספרה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן הכינו תאים בודדים מקו התאים MDA-MB-231 על ידי עיכול טריפסין של תרביות חד-שכבתיות וסינון דרך מסננות רשת.

לאחר ספירה ידנית של התאים המנותקים הבודדים, צלחו אותם ב-96 לוחות חיבור נמוכים במיוחד בצפיפות של 400 תאים לבאר. לאחר מכן הניחו את התאים בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, הוסף ריכוזים שונים של GTCpFE לנפח סופי של 100 מיקרוליטר.

בצע כל טיפול בשלוש עותקים. לאחר שבעה ימים של תרבית באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, רכשו תמונות באמצעות תוכנת הדמיה באמצעות מיקרוסקופ הפוך. ספור ידנית את מספר הממוספרות בקוטר של יותר מ-75 מיקרון.

כדי למדוד את האימונופנוטיפ הגבוה של CD44, CD24 נמוך של תאי גזע סרטניים, טריפסוניזציה של תאי MDA-MB-231 עם 0.25% טריפסין למשך חמש דקות ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר ספירת התאים באמצעות המוציטומטר, זרעו את התאים בשלושה מיליון תאים למנה ב-10 מיליליטר של מדיום כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן הוסיפו רכב או GTCpFE לתאים ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות.

לאחר הדגירה יש לטריפסיני את התאים ולהפיץ מיליון תאים טריפסינים בצינורות פוליסטירן של חמישה מיליליטר. הצינורות צריכים להכיל שני מיליליטר של מאגר HBSS 1x בתוספת 2% FBS ולהיות מסומנים כבדיקה או בקרה. כדי לצבוע עבור סמן פני השטח CD44 ו-CD24, סובב את התאים כלפי מטה, שאב את המאגר, ואז הוסף 20 מיקרוליטר מכל נוגדן מצומד ו-80 מיקרוליטר של מאגר HBSS למבחנות לנפח סופי של 100 מיקרוליטר.

לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר מאותו מאגר לצינורות הבקרה. כלול גם נוגדן מצומד CD44 APC ונוגדני CD24 PE קונטולים מוכתמים בודדים או בקרות איזוטיפ חיסוני ITG. דגרו על התאים בחושך בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

סובב את התאים במשך חמש דקות ב -400 פעמים גרם והרכיב אותם מחדש ב -200 מיקרוליטר של חיץ. שמור את התאים על קרח ובחושך. כעת ניתן לבצע ניתוח FACS.

GTCpFE מעכב את פעילות הלוציפראז NFkappaB-RE ואת הביטוי של גני המטרה של NFkappaB, כגון מולקולת הידבקות בין-תאית 1, Chemokine C-C Motif Ligand 2 וגורם נמק גידול בתאי סרטן שד MCF-7. הריכוז המעכב המחושב ב-50% משתי נקודות הקצה הוא כ-20 מיקרו-מולרי GTCpFE. לשם השוואה, 200 אספירין מיקרו-מולרי אינו מראה פעילות מעכבת בתאי סרטן השד.

זה מצביע על כך שאסטרטגיית הפרו-תרופות של הוספת Fumarate pharmacore לאספירין משפרת משמעותית את פעילותו נגד NFkappaB. GTCpFE מעכב היווצרות ממוספירה של תאי סרטן שד MDA-MB-231 באופן תלוי מינון. בדומה לעיכוב מסלול NFkappaB בתרביות דבקות, ערך ה-IC50 להיווצרות ממוספרה הוא כ-20 מיקרו-מולר.

כמו כן נמדדה אוכלוסיית התאים המבטאים את האימונופנוטיפ הגבוה CD44, CD24 נמוך שהוא סמן פני השטח של תאי גזע סרטניים בסרטן השד. הקדמת GTCpFE הביאה לדלדול משמעותי של האוכלוסייה הגבוהה CD44 ו-CD24 הנמוכה בתאי MDA-MB-231. יחד תוצאות אלה מבססות את יכולתו של GTCpFE למקד ביעילות תאי גזע של סרטן השד.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד העיצוב והסינתזה בפרו-תרופה אספירין פומראט וכיצד לאפיין את פעילות תאי הגזע האנטי-NFkappaB והאנטי-סרטניים שלה על תאי סרטן השד. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר אספירין לא הצליח לעכב את מסלול NFkappaB בתאי סרטן השד כפי שדווח בעבר בספרות. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול בתאי גזע אנטי-סרטניים, מכיוון שהראינו שעל ידי התמקדות במסלולים פרו-דלקתיים מרובים אנו יכולים למעשה למגר ביעילות תאי גזע של סרטן השד.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה כיצד לתכנן ולסנתז ולאפיין חומרים אנטי דלקתיים בסרטן השד, ניתן ליישם זאת על ממאירויות אחרות שבהן מסלולים פרו-דלקתיים מרובים פעילים ותורמים לפתולוגיה של המחלה. לאחר הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות כגון בדיקת אלדפלואור וגידול in vivo על מנת להעריך את השפעת התרופה על תאי גזע של סרטן השד. הטכניקה יכולה לסלול את הדרך לחוקרים בטיפולי סרטן לחקור תכנון פרו-תרופתי של חומרים אנטי דלקתיים.

GTCpFE עשוי לשמש כאב טיפוס לפיתוח חומרים אנטי דלקתיים חדשים מבוססי פומרט ואספירין. וזה יכול להיות גם הבסיס לסוג חדש של חומרים אנטי-סרטניים בתאי גזע.