Name: Mass היסטולוגיה לכמת מוחיים ב תסיסנית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 34 s
Description: למדו כיצד לכמת ניוון עצבי במוח Drosophila באמצעות היסטולוגיה המונית ללא צביעה ספציפית. שיטה זו ממזערת שגיאות מערכתיות על ידי עיבוד זבובי בקרה וניסוי כמדגם אחד, ומאפשרת ניתוח גורמים גנטיים וסביבתיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים ל-D.K. מקרן המחקר הרפואי של אורגון ומ-NIH/NINDS (NS047663). E.S. נתמך על ידי מענק הכשרה מה-NIH (T32AG023477).

1. תיקון הראש על כלב והטבעת פרפין הערה: כל אחד מהשלבים בתהליך הקיבוע צריך להיעשות במנדף. Methylbenzoate, ואילו לא המהווים סיכון בריאותי, יש שהריח מן המעלה הראשונה, יכול להיות מכריע אם לא מטופלים במנדף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הרדמה זבובים, לפצות 50 מ&quot;ל של תמיסת Carnoy על ידי הוספת 15 מ&quot;ל של כלורופורם 5 מ&quot;ל של חומצה אצטית קרחונית 30 מ&quot;ל של 99% אתנול (לא לערבב את כלורופורם וחומצה אצטית). יוצקים אותו במיכל זכוכית עם תחתית שטוחה, כגון צלחת crystalizing, על מנת להבטיח כי צווארונים יכול להניח שטוח מכוסים לחלוטין על ידי פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את הזבובים עם CO 2 או אתר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זבובי נושא (עד 20 עם רוב הצווארונים) בצווארם ​​לתוך הצווארונים באמצעות מלקחיים. זכור כדי ליישר את כל הראשים באותו הכיוון, כפי שניתן לראות באיור 1 א, ו להיות עדין כדי לוודא ששום הנזק עולה על הראש או העיניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כלול זבובי oculis סינוס (חיצים, איור 1 א) על עמדות אקראיות כך שההסדר של הזבובים ניתן לזהות בקלות בסעיפים. בנוסף, אם הזבובים הניסיונות יש צבע עיניים בהיר או לבן, חוט כמה זבובים עם עיניים אדומות, כגון סוג בר, ביניהם כדי להבטיח פיגמנט מספיק נוכחת להכתים את השקופית. רשמו את סדר הזבובים על גיליון פרוטוקול יחד עם מספר צווארון אם משתמשים בכמות גדולה ממנת צווארון אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צווארון כבר סיימתי, למקם אותו פתרון Carnoy המוכן תמורת 3.5 - 4 h. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dump את הפתרון Carnoy לתוך הגליל לרשות המתאימה ולהתחיל שוטף אתנול. ודא לשפוך לאט כדי לא להפריע את המיקום של הצווארונים בתוך המכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הצווארונים למשך 30 דקות באתנול 99% פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את צווארונים באתנול 100% במשך 1 שעה. הקפד להחליף את הכביסות בזמן כדי למנוע overdehydration. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את צווארוני methylbenzoateO / N ב RT. חותם את המיכל עם parafilm כדי למנוע אידוי של methylbenzoate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצק את methylbenozate לתוך המכל הפנוי הנאה במנדף. להוסיף תערובת בעבר הכנה של 1: 1 נקודת התכה נמוכה (56 - 57 ° C) פרפין שעווה methylbenzoate. מנקודה זו ואילך, הצווארונים צריכים להישמר באינקובטור ב 65 מעלות צלזיוס כדי לוודא כי פרפין אינו להקשיח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את תערובת methylbenozate פרפין לתוך המכל הפנוי הנכון, ויוצקי פראפין טהור מותך, שמור על 65 מעלות צלזיוס, על הצווארונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה את פרפין לאחר 30 דקות וחזרו לפחות 5 פעמים זה. לפחות 6 - 8 שוטף צריכה להתבצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הכביסות הושלמו, למקם את הצווארונים לתוך מגש קוביות קרח גומי עם חריצים בערך בגודל של הצווארונים. יוצקים פרפין מותך מעליהם עד מכוסה לחלוטין ולאפשר לו להקשיח O / N (מנסה למנוע בועות אוויר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את אבני פרפין contaiנינג הקולרים ממגש קוביית קרח. הפרד את בלוק פרפין מן הצווארון באמצעות סכין גילוח, בעדינות לנתק איתם את הצווארון. הראשי יהיה בבלוק פרפין ואילו הגופים יישארו הצווארון. אבני יכולים להישמר בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנקות את צווארונים, להשרות אותם סוכן deparafinization על 65 מעלות צלזיוס להסיר את פרפין, נקי עם קרצוף אור, ולשטוף באתנול לפני שימוש חוזר. </li></ol> 2. חתך השמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחמם צלחת חימום עד 50 מעלות צלזיוס. מניח את מחזיקי אובייקט (או בלוקי הרכבת מתכת) ו סכיני גילוח על הצלחת ולתת להם להתחמם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם לכיוון הרצוי עבור חתך, לצרף את בלוק פרפין או עם הראשים כלפי הצד (סעיפים אופקיים) או כלפי מעלה (סעיפים חזיתית) כדי לחסום הרכבה מחוממת (בקצרה המסת הבלוק בצד המגע). הסר את הבלוק מן צלחת החימום ולאפשר לו להתקרר במשך לפחות 10 מייליםn על מנת להבטיח כי פרפין הוא קשוח מספיק עבור הדפסה נאותה על לחסום את ההרכבה. שמור על השורה של הראשים מיושרים במקביל פני השטח של הגוש ככל האפשר כדי למנוע חלקים אחידים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח סכין גילוח וקוצץ את פרפין לנזול החוצה מהראשים לטוס כך שורה קטנה רק עם ראשי המוטבע נשארת (סכין הגילוח ניתן התחמם עבור זמירה קלה). ודא שלא לקצץ יותר מדי כך פרפין לא לשבור במהלך חתך (יותר זמירה יכול להיעשות במהלך חתך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את גוש הרכבה לתוך מחזיק אובייקט של microtome ולהבטיח כי היישור של שורת ראשי מקביל ככל האפשר אל קצה הלהב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן שקופיות מיקרוסקופ על ידי מכסה אותם עם שכבה דקה של פתרון poly-L- ליזין (PLL) ולתת להם להתייבש במשך 5 דקות. מכסים אותם במים זמן קצר לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים 7 סעיפים מיקרומטר ולהעביר את סרט סעיפים לשקופית צף על פני המים. &lt;br /&gt; הערה: כדי להשיג את המוח כולו לחלקים אופקיים, אנו אוספים את הסרט מתוך כאשר מתחילים לחתוך לתוך העין עד הראש נחתך לחלוטין (חיתוך מן החוטם לתוך המוח). יותר משקופית אחת עשויה להיות נחוצה עבור כל הראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקף על צלחת חום על 37 מעלות צלזיוס ולאפשר סרט להרחיב בערך 1 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה של עודפי מים (על ידי שפיכת אותו או באמצעות רקמות) ומייבשים את השקופיות O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את שעוות פרפין משקופית ידי צבת את השקופיות בצנצנת שקופיות מכתימות גבוהה, אנכית מלאה סוכן deparafinization (לגמרי מכסה את הסעיפים). בצע 3 שוטף של 30 דק &#39;- 60 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את השקופית מן לשטוף הסופי. מניחים 2 טיפות של התקשורת הטבעה לשקופית ולכסות אותו עם coverslip גדול. </li></ol> 3. לצלם וניתוח סעיפים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר השקופיות המוכנות להתייבש במשך 1 - 2 ד. לאחר מכן בחן אותם על microsc הקרינהאופ תחת אור כחול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בהגדלה נמוכה כדי לקבוע את הכיוון של זבובים כדי למצוא את האזור של עניין אם מתמקדים באזור מסוים. הערה: לקבלת זבובי SWS (ראה איור 2), אנו מוצאים את החלק המכיל השליך הגדול ולקחת תמונה (בדרך כלל 40X גדלה). כאשר מנתחים את המוח כולו (כמו באיור 3), אנו לגלול בין כל הקטעים מתוך ראש או לצלם את החלק עם פנוטיפ החמור ביותר או כל החלקים שמראים vacuoles. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח כפול סמיות, לקחת ותמונות מספר בלי לדעת את הגנוטיפ ולהקליט את מספר צווארון המיקום של הראש בשורה לזהות אותם מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התמונות ננקטו, ולנתח אותם באמצעות תוכנת הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת vacuoles לכל סעיף או לנפש. כדי למדוד את גודל vacuole, לפתוח את התמונות מתוך התוכנה ובחר את vacuoles עם מבחר מדיl. לקבוע את כמות הפיקסלים vacuoles שנבחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמרת מיקרומטר 2, לצלם תמונה של שקופית כיול מיקרומטר הבמה בהגדלה משמשת עבור רכישת תמונות. לקבוע את כמות הפיקסלים 100 מיקרומטר 2 כדי לחשב את מקדם המרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המר את מספר הפיקסלים הכולל לתוך מיקרומטר 2 על ידי חלוקת מספר הפיקסלים במקדם ההמרה מחושב בשלב לעיל. </li></ol>

<ol><li>Alexander, A. G., Marfil, V., Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Caenorhabditis+elegans+as+a+model+to+study+Alzheimer%27s+disease+and+other+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Use of Caenorhabditis elegans as a model to study Alzheimer's disease and other neurodegenerative diseases.</a> Front Genet. 5, 279(2014).</li>
<li>Bonini, N. M., Fortini, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neurodegenerative+disease+modeling+using+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Human neurodegenerative disease modeling using Drosophila.</a> Annu Rev Neurosci. 26, 627-656 (2003).</li>
<li>Calahorro, F., Ruiz-Rubio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+as+an+experimental+tool+for+the+study+of+complex+neurological+diseases%3A+Parkinson%27s+disease%2C+Alzheimer%27s+disease+and+autism+spectrum+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Invert+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans as an experimental tool for the study of complex neurological diseases: Parkinson's disease, Alzheimer's disease and autism spectrum disorder.</a> Invert Neurosci. 11, 73-83 (2011).</li>
<li>Chen, X., Barclay, J. W., Burgoyne, R. D., Morgan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+C.+elegans+to+discover+therapeutic+compounds+for+ageing-associated+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+Central+Journal%22%5BJournal%5D)">Using C. elegans to discover therapeutic compounds for ageing-associated neurodegenerative diseases.</a> Chemistry Central Journal. 9, 65(2015).</li>
<li>Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+human+neurodegenerative+diseases+in+transgenic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Modeling human neurodegenerative diseases in transgenic systems.</a> Hum Genet. 131, 535-563 (2012).</li>
<li>Jaiswal, M., Sandoval, H., Zhang, K., Bayat, V., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+mechanisms+that+underlie+human+neurodegenerative+diseases+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Probing mechanisms that underlie human neurodegenerative diseases in Drosophila.</a> Annu Rev Genet. 46, 371-396 (2012).</li>
<li>Konsolaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fruitful+research%3A+drug+target+discovery+for+neurodegenerative+diseases+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Fruitful research: drug target discovery for neurodegenerative diseases in Drosophila.</a> Expert Opin Drug Discov. 8, 1503-1513 (2013).</li>
<li>Kretzschmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegenerative+mutants+in+Drosophila%3A+a+means+to+identify+genes+and+mechanisms+involved+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Invert+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurodegenerative mutants in Drosophila: a means to identify genes and mechanisms involved in human diseases.</a> Invert Neurosci. 5, 97-109 (2005).</li>
<li>Kretzschmar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swiss+cheese+et+allii%2C+some+of+the+first+neurodegenerative+mutants+isolated+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">Swiss cheese et allii, some of the first neurodegenerative mutants isolated in Drosophila.</a> J Neurogenet. 23, 34-41 (2009).</li>
<li>Li, J., Le, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+neurodegenerative+diseases+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Modeling neurodegenerative diseases in Caenorhabditis elegans.</a> Exp Neurol. 250, 94-103 (2013).</li>
<li>Prussing, K., Voigt, A., Schulz, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+as+a+model+organism+for+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster as a model organism for Alzheimer's disease.</a> Mol Neurodegener. 8, (2013).</li>
<li>Wentzell, J., Kretzschmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease+and+tauopathy+studies+in+flies+and+worms%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease and tauopathy studies in flies and worms.</a> Neurobiol Dis. 40, 21-28 (2010).</li>
<li>Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+locomotor%2C+learning%2C+and+memory+deficits+in+Drosophila+models+of+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Barone, M. C., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+neurodegenerative+phenotypes+in+Drosophila+dopaminergic+neurons+by+climbing+assays+and+whole+brain+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assessing neurodegenerative phenotypes in Drosophila dopaminergic neurons by climbing assays and whole brain immunostaining.</a> J Vis Exp. , e50339(2013).</li>
<li>Dutta, S., Rieche, F., Eckl, N., Duch, C., Kretzschmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+expression+of+Swiss-cheese+%28SWS%29%2C+the+Drosophila+orthologue+of+Neuropathy+Target+Esterase%2C+is+required+for+neuronal+ensheathment+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Glial expression of Swiss-cheese (SWS), the Drosophila orthologue of Neuropathy Target Esterase, is required for neuronal ensheathment and function.</a> Dis Model Mech. , (2015).</li>
<li>Iijima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abeta42+mutants+with+different+aggregation+profiles+induce+distinct+pathologies+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Abeta42 mutants with different aggregation profiles induce distinct pathologies in Drosophila.</a> PLoS One. 3, e1703(2008).</li>
<li>Krishnan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+circadian+clock+accelerates+aging+in+neurodegeneration-prone+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Loss of circadian clock accelerates aging in neurodegeneration-prone mutants.</a> Neurobiol Dis. 45, 1129-1135 (2012).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+rapid+iterative+negative+geotaxis+assay+and+its+use+in+a+genetic+screen+for+modifiers+of+Abeta%2842%29-induced+locomotor+decline+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Bull%22%5BJournal%5D)">Automated rapid iterative negative geotaxis assay and its use in a genetic screen for modifiers of Abeta(42)-induced locomotor decline in Drosophila.</a> Neurosci Bull. 31, 541-549 (2015).</li>
<li>Papanikolopoulou, K., Skoulakis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally+distinct+phosphorylations+differentiate+Tau-dependent+learning+deficits+and+premature+mortality+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Temporally distinct phosphorylations differentiate Tau-dependent learning deficits and premature mortality in Drosophila.</a> Hum Mol Genet. 24, 2065-2077 (2015).</li>
<li>Ping, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+abeta42-induced+hyperexcitability+to+neurodegeneration%2C+learning+and+motor+deficits%2C+and+a+shorter+lifespan+in+an+Alzheimer%27s+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Linking abeta42-induced hyperexcitability to neurodegeneration, learning and motor deficits, and a shorter lifespan in an Alzheimer's model.</a> PLoS Genet. 11, e1005025(2015).</li>
<li>Sujkowski, A., Rainier, S., Fink, J. K., Wessells, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+Induction+of+Human+NTE+%28PNPLA6%29+Rescues+Neurodegeneration+and+Mobility+Defects+of+Drosophila+swiss+cheese+%28sws%29+Mutants%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Delayed Induction of Human NTE (PNPLA6) Rescues Neurodegeneration and Mobility Defects of Drosophila swiss cheese (sws) Mutants.</a> PLoS One. 10, e0145356(2015).</li>
<li>Barone, M. C., Sykiotis, G. P., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+activation+of+Nrf2+signaling+is+sufficient+to+ameliorate+neurodegenerative+phenotypes+in+a+Drosophila+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Genetic activation of Nrf2 signaling is sufficient to ameliorate neurodegenerative phenotypes in a Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Dis Model Mech. 4, 701-707 (2011).</li>
<li>Coulom, H., Birman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+exposure+to+rotenone+models+sporadic+Parkinson%27s+disease+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Chronic exposure to rotenone models sporadic Parkinson's disease in Drosophila melanogaster.</a> J Neurosci. 24, 10993-10998 (2004).</li>
<li>Navarro, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+dopaminergic+neuronal+dysfunction+in+genetic+and+toxin-induced+models+of+Parkinson%27s+disease+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of dopaminergic neuronal dysfunction in genetic and toxin-induced models of Parkinson's disease in Drosophila.</a> J Neurochem. 131, 369-382 (2014).</li>
<li>Heisenberg, M., Böhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+anatomical+brain+mutants+of+Drosophila+by+histological+means%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschrift+f%C3%BCr+Naturforschung+C%22%5BJournal%5D)">Isolation of anatomical brain mutants of Drosophila by histological means.</a> Zeitschrift für Naturforschung C. 34, 143(1979).</li>
<li>Han, P. L., Meller, V., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+brain+revisited+by+enhancer+detection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The Drosophila brain revisited by enhancer detection.</a> J Neurobiol. 31, 88-102 (1996).</li>
<li>Lin, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+in+situ+brain+imaging+for+mapping+the+Drosophila+connectome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">Automated in situ brain imaging for mapping the Drosophila connectome.</a> J Neurogenet. 29, 157-168 (2015).</li>
<li>Strausfeld, N. J., Sinakevitch, I., Vilinsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mushroom+bodies+of+Drosophila+melanogaster%3A+an+immunocytological+and+golgi+study+of+Kenyon+cell+organization+in+the+calyces+and+lobes%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">The mushroom bodies of Drosophila melanogaster: an immunocytological and golgi study of Kenyon cell organization in the calyces and lobes.</a> Microsc Res Tech. 62, 151-169 (2003).</li>
<li>Bettencourt da Cruz, A., Wentzell, J., Kretzschmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swiss+Cheese%2C+a+protein+involved+in+progressive+neurodegeneration%2C+acts+as+a+noncanonical+regulatory+subunit+for+PKA-C3%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Swiss Cheese, a protein involved in progressive neurodegeneration, acts as a noncanonical regulatory subunit for PKA-C3.</a> J Neurosci. 28, 10885-10892 (2008).</li>
<li>Bolkan, B. J., Kretzschmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Tau+results+in+defects+in+photoreceptor+development+and+progressive+neuronal+degeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Loss of Tau results in defects in photoreceptor development and progressive neuronal degeneration in Drosophila.</a> Dev Neurobiol. 74, 1210-1225 (2014).</li>
<li>Cook, M., Mani, P., Wentzell, J. S., Kretzschmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+RhoA+prenylation+in+the+loechrig+%28loe%29+mutant+leads+to+progressive+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Increased RhoA prenylation in the loechrig (loe) mutant leads to progressive neurodegeneration.</a> PLoS One. 7, e44440(2012).</li>
<li>Wittmann, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tauopathy+in+Drosophila%3A+neurodegeneration+without+neurofibrillary+tangles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tauopathy in Drosophila: neurodegeneration without neurofibrillary tangles.</a> Science. 293, 711-714 (2001).</li>
<li>Rasmuson, B., Green, M. M., Ewertson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QUALITATIVE+AND+QUANTITATIVE+ANALYSES+OF+EYE+PIGMENTS+AND+PTERIDINES+IN+BACK-MUTATIONS+OF+THE+MUTANT+wa+IN+DROSOPHILA+MELANOGASTER%5BTitle%5D)+AND+%22Hereditas%22%5BJournal%5D)">QUALITATIVE AND QUANTITATIVE ANALYSES OF EYE PIGMENTS AND PTERIDINES IN BACK-MUTATIONS OF THE MUTANT wa IN DROSOPHILA MELANOGASTER.</a> Hereditas. 46, 635-650 (1960).</li>
<li>Bettencourt da Cruz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+MAP1B-related+protein+FUTSCH+leads+to+changes+in+the+neuronal+cytoskeleton%2C+axonal+transport+defects%2C+and+progressive+neurodegeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Disruption of the MAP1B-related protein FUTSCH leads to changes in the neuronal cytoskeleton, axonal transport defects, and progressive neurodegeneration in Drosophila.</a> Mol Biol Cell. 16, 2433-2442 (2005).</li>
<li>Kretzschmar, D., Hasan, G., Sharma, S., Heisenberg, M., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+swiss+cheese+mutant+causes+glial+hyperwrapping+and+brain+degeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The swiss cheese mutant causes glial hyperwrapping and brain degeneration in Drosophila.</a> J Neurosci. 17, 7425-7432 (1997).</li>
<li>Dutta, S., Rieche, F., Eckl, N., Duch, C., Kretzschmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+expression+of+Swiss+cheese+%28SWS%29%2C+the+Drosophila+orthologue+of+neuropathy+target+esterase+%28NTE%29%2C+is+required+for+neuronal+ensheathment+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Glial expression of Swiss cheese (SWS), the Drosophila orthologue of neuropathy target esterase (NTE), is required for neuronal ensheathment and function.</a> Dis Model Mech. 9, 283-294 (2016).</li>
<li>Davis, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocerebrosidase+Deficiency+in+Drosophila+Results+in+alpha-Synuclein-Independent+Protein+Aggregation+and+Neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Glucocerebrosidase Deficiency in Drosophila Results in alpha-Synuclein-Independent Protein Aggregation and Neurodegeneration.</a> PLoS Genet. 12, e1005944(2016).</li>
<li>Dias-Santagata, D., Fulga, T. A., Duttaroy, A., Feany, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+mediates+tau-induced+neurodegeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress mediates tau-induced neurodegeneration in Drosophila.</a> J Clin Invest. 117, 236-245 (2007).</li>
<li>Kretzschmar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+and+neuronal+expression+of+polyglutamine+proteins+induce+behavioral+changes+and+aggregate+formation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Glial and neuronal expression of polyglutamine proteins induce behavioral changes and aggregate formation in Drosophila.</a> Glia. 49, 59-72 (2005).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+model+for+TDP-43+proteinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A Drosophila model for TDP-43 proteinopathy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 3169-3174 (2010).</li>
</ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

השיטה המתוארת מספק אמצעי לכמת ניוון מוחיים במוח של דרוזופילה. בעוד שיטות אחרות, כמו לספור לסוג תא מסוים, שניתן להשתמש בהם כדי לזהות ניווניות של מערכת העצבים, את היתרון של שיטה זו הוא כי זה יכול להיות מיושם באופן כללי יותר. ספירת תאים דורשת כי תאים אלה יכולים להיות מזוהים באופן מהימן או באמצעות נוגדן ספציפי או הביטוי של סמן תא ספציפי, וזה לא תמיד זמין. יתר על כן, הוכח כי תוצאות שונות באופן דרמטי ניתן להשיג את השיטה 24, ככל הנראה בשל תנאי המשמש תיוג לצורך זיהוי. ...

עם העלייה בתוחלת החיים, מחלות ניווניות כמו אלצהיימר או פרקינסון הפכו איום בריאותי הגובר באוכלוסיה הכללית. על פי המכון הלאומי לבריאות בארה&quot;ב, 115 מיליון אנשים ברחבי העולם הם חזו להיות מושפעים דמנציה בשנת 2050. למרות התקדמות משמעותית נעשתה בזיהוי גנים וגורמי סיכון מעורבים לפחות חלק ממחלות אלה, עבור רבים מהם, נכס הבסיס מנגנונים מולקולריים עדיין אינם ידועים או לא הבין היטב. אורגניזמים מודל חסרי חוליות פשוטות כמו elegans Caenorhabditis ו תסיסנית מציעים מגוון רחב של יתרונות הניסיונות כדי לחקור את המנגנונים של מחלות ניווניות, כוללים מחזור חיים קצר, מספר רב של צאצאים, ואת הזמינות של ומבוססת ולפעמים ייחודי שיטות גנטיות ומולקולריות 1 -12. יתר על כן, אורגניזמים אלה ניתנים משוחדיםמסכי אינטראקציה שיכול לזהות גורמי תורמי מחלות אלה על ידי ההשפעות המחמירות או ממתן שלהם על פנוטיפים ניווניות. ניתוח אינטראקציות גנטיות כאלה והערכת השפעות ההזדקנות דורש פרוטוקולים כמותיים לזהות ניוון מוחיים, למדוד חומרתה. הערכה זו יכולה להיעשות בקלות יחסית כאשר מודדים היבטים התנהגותיים תסיסנית, כגון למידת חוש ריח, geotaxis השלילי, או מהר phototaxis, המספקים ערך ביצועים מספרי 13-21. כמו כן ניתן לקבוע את ההשפעות על הישרדות עצבית על ידי ספירת תאי עצב. עם זאת, זה אפשרי רק כאשר התמקדות אוכלוסייה מסוימת כי הוא שקל לזהות, כמו נוירונים דופאמינרגיים המושפעות במחלת פרקינסון, וגם אז, והתוצאות היו במחלוקת 22-24. הפרוטוקול המתואר כאן משתמש בשיטת הצווארון לבצע קטעי סדר פרפין, שיטהאשר פותחה במקור על ידי הייזנברג Bohl, שהשתמשו בו כדי לבודד מוטנטים המוח האנטומי תסיסנית 25. השימוש בשיטת הצווארון מכן הותאם, לרבות cryosections, חלקי vibratome, וחתכי פלסטיק 26-28. כאן, זוהי שיטה המופעלת להשיג חלקי סדרה של ראש הזבוב כולו, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש כדי למדוד את vacuoles המתפתח זבובים עם פנוטיפים ניווניות 16,21,29-32. מדידות אלה ניתן לעשות זאת באזורים ספציפיים במוח או יכולות לכסות את כל המוח; הגישה השנייה מאפשרת לזהות פנוטיפים ניווניות אפילו חלש, כפי שנצפה במהלך ההזדקנות. לבסוף, בעת שימוש הצווארונים, עד 20 זבובים ניתן לעבד כהכנה אחד, וזה לא רק פחות זמן רב, אלא גם מאפשר לניתוח מלא זבובים הניסיונות באותה ההכנה, מזעור חפצים בשל שינויים קלים ההכנה.

<table><tbody><tr><td>שם חברת הריאגנט/ציוד</td><td></td><td>מספר</td><td></td>קטלוגי</tr><tr><td>צווארון</td><td>Genesee Scientific</td><td>TS 48-100</td><td>אנו משתמשים בצווארונים בהתאמה אישית העשויים מחתיכת מתכת אחת במקום שכבות כמו אלה של Genesee. תיאור כיצד להכין צווארונים ניתן למצוא בכתובת http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/fluorescent/index.html&nbsp;</td></tr><tr><td>מגש קוביות קרח גומי להטמעה</td><td>חנות</td><td></td> ביתית <td>ניתן להתאים את הגודל להתאמה על ידי הדבקה בקירות נוספים&nbsp;</td></tr><tr><td>צלחת התגבשות</td><td>חברת פישר סיינטיפיק</td><td>08-762-3</td><td></td></tr><tr><td>אתר</td><td>פישר סיינטיפיק חברה</td><td>E138-1</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>דקון מעבדות בע"מ</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Choloroform</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>Glacial Acetic Acid</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Methylbenzoate</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>M205-500</td><td>ריח מובהק - לשימוש בקולטים אדים!</td></tr><tr><td>נקודת התכה נמוכה שעוות פרפין</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>T565</td><td>הקפד לשמור על נמס נוסף ב 65 מעלות; C אמבט מים</td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica Biosystems</td><td>Reichert Jung 2040 Autocut</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ שקופיות</td><td>פישר סיינטיפיק חברה</td><td>12-550D</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי מיקרוסקופ זכוכית</td><td>פישר סיינטיפיק קומפני</td><td>12-545-M</td><td></td></tr><tr><td>SafeClear</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>314-629</td><td>שלושה מיכלים שונים לשטיפות</td></tr><tr><td>צנצנת מכתים אנכית עם כריכה</td><td>: טד פלה בע"מ&nbsp;</td><td>432-1</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פולי-L-ליזין (PLL)</td><td>Sigma Life Science</td><td>P8290-500</td><td></td></tr></tbody></table>

mass היסטולוגיה לכמת מוחיים ב<em&gt; תסיסנית</em

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

מחלות ניווניות מתקדמות כמו מחלת אלצהיימר (AD) או מחלת פרקינסון (PD) מהוות איום הולך וגובר על בריאות אדם ברחבי העולם. למרות מודלים יונקים סיפקו תובנות חשובות המנגנונים של פתוגניות, את המורכבות של מערכות יונקים יחד עם העלויות הגבוהות שלהם הם מגבילים את השימוש בהם. לכן, תסיסנית פשוט אך ומבוססת מודל המערכת מספקת אלטרנטיבה לחקירת מסלולים מולקולריים המושפעות במחלות אלה. מלבד גירעונות התנהגותי, מחלות ניווניות המאופיינות פנוטיפים היסטולוגית כגון מוות עצב axonopathy. כדי לכמת ניוון עצבי ולקבוע כיצד הוא מושפע מגורמים גנטיים וסביבתיים, אנו משתמשים בגישה היסטולוגית המבוססת על מדידת vacuoles במוחות הזבוב הבוגר. כדי למזער את ההשפעות של טעות שיטתית ולהשוות חלקים ישירות מלא expזבובים erimental כהכנה אחד, אנו משתמשים בשיטת &quot;צווארון&quot; עבור חלקים פרפין. מוחייה אז נבחן על ידי מדידת הגודל ו / או מספר vacuoles שהתפתח במוח הזבוב. זה יכול להיעשות גם על ידי התמקדות באזור מסוים של עניין או על ידי ניתוח כל המוח על ידי קבלת קטעים סדרו כי היקף הראש המלא. לכן, שיטה זו מאפשרת למדוד לא רק ניוון חמור, אלא גם יחסית פנוטיפים קל כי ניתנים לזיהוי רק בעוד כמה סעיפים, כפי שקורה במהלך הזדקנות נורמלית.

באמצעות תוצאות השיטה המתוארת בסעיפים סדרתי יוכתמו הפיגמנט בעין 33 המקיפים את ראש זבוב כולו. חלק זה מוצג באיור 1B, שבו קטעים מתוך ראש הפרט מוצגים מלמעלה למטה. הסעיפים מפני זבובים שונים נראים משמאל לימין בדוגמה זו. כדי להקל על ההתמצאות זיהוי של זבובים, זבוב חסר עיניים (oculis סינוס) מוכנס כסמן במיקום 3 (חץ, איור 1B). <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:r...

תסיסנית נעשה שימוש נרחב כמערכת מודל ללמוד ניווניות של מערכת העצבים. פרוטוקול זה מתאר שיטה שבאמצעותה ניוון, כפי שנקבע על ידי היווצרות vacuole במוח, ניתן לכמת. הוא גם מפחית תופעות עקב ההליך הניסיון על ידי עיבוד ובקרת חתך וזבובים הניסיונות כמו דגימה אחת.

Mass היסטולוגיה לכמת מוחיים ב<em&gt; תסיסנית</em

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לכמת ניוון עצבי במוח של Drosophila, הנגרם ממגוון גורמים הכוללים גיל, מוטציות גנטיות או השפעות סביבתיות, ללא צורך בצביעה ספציפית. שיטה זו שימושית מאוד בניתוח שאלות מפתח בתחום המחלות הניווניות של מערכת העצבים, כגון אילו גנים או גורמים סביבתיים גורמים למחלות אלו או תורמים להן?היתרון המרכזי של שיטה זו הוא שהיא נמנעת משגיאות שיטתיות או ממזערת אותן, מכיוון שזבובים של קבוצת הביקורת וזבובים של קבוצת הניסוי מטופלים כדגימה אחת. באופן כללי, אנשים שאינם מנוסים בשיטה זו עשויים להתקשה בתחילה, שכן נדרש תרגול כדי להבטיח שהאזור הנכון של המוח נמצא על השקופית וכדי למנוע נזקים שעלולים להתרחש במהלך החיתוך. כדי להתחיל, השתמשו תחילה בפינצטה כדי להשחיל את הזבובים הנבדקים דרך העורף אל תוך הטבעות.יישרו את כל הראשים לאותו כיוון והבטיחו שלא ייגרם נזק לראש או לעיניים. שלבו זבובים מסוג Eyeless Senoculus במיקומים אקראיים וידועים, כדי שניתן יהיה לזהות בקלות את סדר הזבובים בחתכים. בנוסף, אם לזן הזבובים הנבדק יש עיניים בהירות או לבנות, השחילו זבובים בעיניים אדומות במרווחים לאורך הרצועה, כדי להבטיח נוכחות של מספיק פיגמנט לצביעת הפיתוח.תעדו את סדר הזבובים, יחד עם מספר הטבעת במידה ובשימוש ביותר מאחת. לאחר סיום העבודה עם טבעת, העבירו אותה לתמיסת Carnoy למשך שלוש וחצי עד ארבע שעות. בצעו ס

mass-histology-to-quantify-neurodegeneration-in-drosophila

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מבחני התנהגות למדידת פונקציות של תנועה, למידה, ויכולות...

Assaying של תנועה, למידה, וזיכרון גירעונות תסיסנית מודלים של ניוון מוחיים

הגורם המגביל בשימוש של...

אחד תסיסנית אומטידיום Dissection והדמיה

כאן אנו מתארים שני מבחני שנקבעו ללמוד ניוון מוחיים תלוי גיל של דופאמין (DA)...

הערכת פנוטיפים ניווניות ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; נוירונים דופאמין על ידי מבחני לאז וimmunostaining מוח כל

כאן אנו מתארים שיטה פשוטה ונגישה באופן נרחב לפגוע עצבים סגמנטליים בזחלים תסיסנית לדמיין לכמת neurodegeneration של נוירונים המנוע בצומת neuromuscular (NMJ) של הזחלים instar השלישי.

פשוט Neuronal מכני מתודולוגיה פגיעה ללמוד<em&gt; תסיסנית</em&gt; נוירון מוטון ניוון

פרוטוקול זה מתאר את הקרע של immunostaining של המבוגרים דרוזופילה melanogaster רקמות המוח. באופן ספציפי, פרוטוקול זה מדגיש את השימוש נוירונים הגוף, קולט אור פטריות דרוזופילה בתור דוגמה עצביים קבוצות משנה יכול לשמש באופן מדויק לחשוף את עקרונות כלליים שבבסיס היבטים רבים של ההתפתחות העצבית.

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

פיתחנו זרימת עבודה פשוטה וישימה לחלץ נתונים כמותיים במחקרים ביולוגיים תא המבוססות על ידי קרינה פלואורסצנטית-הדמיה של צבירת חלבון, שטף autophagic במערכת העצבים המרכזית דגמי דרוזופילה הקשורים ניוון מוחיים.

ביולוגיה של התא כמותית של הקשורים ניוון מוחיים ב דרוזופילה דרך ניתוח לא משוחדת של חלבונים מתויגות Fluorescently באמצעות ImageJ

אנו מציגים פרוטוקול באמצעות גישה גנטית הקדמי למסך עבור מוטציות המציגות ניוון נוירוזוסופילה מלאנוגסטר. היא משלבת שיטת טיפוס, ניתוח היסטולוגיה, מיפוי גנים ורצפי דנ א בסופו של דבר לזהות גנים חדשניים הקשורים לתהליך של הגנה עצבית.

ב Vivo Forward המסך הגנטי כדי לזהות גנים נוירוגינים הרומן ב Drosophila ילה melanogaster

כאן, אנו מספקים פרוטוקולים כדי לבצע שלושה המושרה הנגרמת לפציעה מניוון (אקסון מוות) בחני ילה melanogaster כדי להעריך את השימור מורפולוגית ופונקציונלית של אקסונים קטוע הסינפסות שלהם.

הערכה מורפולוגית ופונקציונלית של Axons וסינפסות שלהם במהלך מוות Axons בדרוסופילה מלאנוסטר

המטרה של הליך זה היא לנתח את רקמת שריר האורך גב (DLM) כדי להעריך את השלמות המבנית של צמתים עצביים שריריים DLM (NMJs) במודלים של מחלות ניווניות באמצעות מלנוגסטר Drosophila.

הדמיה ניוון סינפטי ב דרוזופילה למבוגרים בשיתוף עם ניוון עצבי

מחקר זה מציג פרוטוקול פשוט לעיבוד רקמות הכולל עריפת ראש, קיבוע, קריוסקציה, צביעה פלואורסצנטית, צביעה חיסונית והדמיה, שניתן להרחיב להדמיה קונפוקלית ורב-פוטונית. השיטה שומרת על יעילות דומה לדיסקציות מורכבות, ועוקפת את הצורך במיומנויות מוטוריות מתקדמות. ניתוח תמונה כמותי מספק פוטנציאל חקירה נרחב.

הקפאה ישירה של ראשי דרוזופילה לצביעה פלואורסצנטית משופרת של המוח וצביעה חיסונית

למדו כיצד לכמת ניוון עצבי במוח Drosophila באמצעות היסטולוגיה המונית ללא צביעה ספציפית. שיטה זו ממזערת שגיאות מערכתיות על ידי עיבוד זבובי בקרה וניסוי כמדגם אחד, ומאפשרת ניתוח גורמים גנטיים וסביבתיים.

Mass היסטולוגיה לכמת מוחיים ב

גלה סרטונים נוספים