Name: בניית מודלים אלמנטים סופיים לחקור ביומכניקה לסת דג הזברה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 11 s
Description: חקור ניתוח אלמנטים סופיים לביומכניקת לסתות Danio rerio באמצעות מיקרוסקופיית קונפוקל ויצירת רשתות תלת־ממדיות. שיטה זו מאפשרת הדמיית סביבה מכנית וניתוח השפעת עומסים על התפתחות שלדית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

LHB מומן על ידי תכנית PhD Cell Wellcome Trust הדינמית; קאר מומנה על ידי מענק פרויקט MRC MR / L002566 / 1 (הוענק Ejr ו CLH) ו CLH מומנה על ידי מענק ערוק 19479. כמו כן, אנו רוצים להודות מתקן bioimaging וולפסון ייעוץ הדמיה.

כל השלבים שונים הפרוטוקול אחרי מאונ&#39; הטיפול בבעלי החיים של הבריסטול והנחיות רווחה לבין אלה של משרד הפנים בבריטניה. ויזואליזציה 1. לאנטומיה השלד והשרירים הערה: כדי להמחיש את הצורה של אלמנטים השלד, לכמת שרירים כדי למצוא את המיקום המדויק של הקבצים המצורפים שריר, immunostain (סעיף 1.1) דגים בגיל המתאים עבור שרירן השלד (אשר חושף שרירים) וקולגן מסוג II (לדמיין סָחוּס). לחלופין, לדמיין את האנטומיה השריר-שלד באמצעות קווי כתב ניאון מהונדסים כגון col2a1 כתב a1 קולגן: mCherry 13,14 לדמיין סחוס ואת smyhc כתב השרשרת כבדה האיטי השרירן: GFP 15 כדי להמחיש את העמדה מצורפת שריר (סעיף 1.2). קווים אלטרנטיביים המסמנים סחוס ושרירים יכולים לעבוד באותה מידה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלורסנט Immunostaining <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן זחל paraformaldehyde 4% העודפים (PFA) ב פוספט שנאגר מלוח (PBS) במשך שעה 1. לשטוף ב- PBS עם 0.1% Tween 20 (PBT) ו מייבשים מתנול 50% (MeOH) ב PBT ו 100% MeOH במשך 5 דקות בהתאמה. זהירות: PFA הוא רעיל, יש לטפל בהתאם גיליון בטיחות חומרים. הערה: זחל ניתן לאחסן 100% MeOH עד לרגע השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רעננותם זחל ב -50% MeOH ב PBT במשך 5 דקות. לשטוף PBT במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize זחל טריפסין 0.25% ב PBT על קרח למשך 5-6 דקות. לשטוף 4x PBT במשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום במשך 2-3 שעות בסרום 5% ב PBT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הזחל עם הדילול המומלץ של קולגן אנטי סוג הארנב 2 ונוגדנים נגד שרירן העכבר בסרום 5% ב PBT במשך שעה 1 ב טמפ החדר או לילה ב 4 מעלות צלזיוס. הערה: טווח הדילול המומלץ הוא בדרך כלל על גיליון נתוני נוגדן. בחר נוגדנים אשר מועלות כנגד זנים שונים זה לזה וכי הם גם diffeלשכור לרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 6x זחל במשך 15 דקות ב PBT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום במשך 1-2 שעות בסרום 5% ב PBT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדגירים נוגדנים משני בחושך. השתמש שכותרתו fluorescently ועכבר אנטי (550) ו-ארנב נגד (488) נוגדנים משני ב דילול מתאים בסרום 5% ו PBT עבור הנוגדן הספציפי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 6X במשך 10 דקות כל אחד ב PBT ותמונה על מיקרוסקופ confocal 10X בהקדם האפשרי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדמיה השלד והשרירים גיאומטריה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר הזחלים ventrally על coverslip ב נקודת התכה 0.3-0.5% נמוך פושר (LMP) agarose בתמיסה של Danieau 16. הערה: דג מהונדס יהיה צורך מסומם ב 0.02% MS222 (methanesulfonate Tricaine, pH 7) לפני הרכבה ובמהלך הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח ערימת תמונת confocal של האזור של עניין באמצעות העדשה 10X אובייקטיבית הזום הדיגיטלי כ פי 2.5. הכנת תמונות של ערוץ ירוק ואדום באמצעות 488 ננומטר ו 561 nמ לייזרי בהתאמה. תמונה ברזולוציה פיקסל 512 x 512 עם מרווח בין מטוסי z של 1.3 מיקרומטר ו -3 ממוצעי קו. המחסנית וכתוצאה מכך תהווה של כ -100 פרוסות z. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצא את הנתונים כסדרה TIFF. תחזיות מקסימלי של אלמנטים שריר וסחוס של פגית דג הזברה 5dpf מוצגים באיור 1. </li></ol></li></ol> 2. יצירת משטח 3D <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר במערך נציג עבור כל נקודת זמן ב -3, 4 ו -5 DPF (בחר לאחר להדמיה של דגימות מרובות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח ערימת TIFF 3 ממדים ובחר את כל ערוצי תוכנת ניתוח. קליק ימני על ערוץ הסחוס ובחרתי תמונת מסנן חלק: גאוס (איור 2 ב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאור פרויקט קליק ימני על תמונה מסוננת ובחר &#39;פילוח תמונה&#39; ולאחר מכן &#39;לערוך תווית חדשה&#39;. צור תווית חדשה עבור כל חומר, כלומר, סחוס joint. בחר את אזור הסחוס של התמונה (איור 2C, אות לבן, מתאר סגול) באמצעות הכלי מטה הקסמים. השתמש בכלי המברשת כדי להסיר את רעש מן המתאר. הערה: אם אתה משתמש בכלי מטה קסם, לחץ על &#39;כל הפרוסות&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את האזור המשותף עם כלי המברשת ולהקצות לרכיב משותף (איור 2 ג, מתאר כחול) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספר פרוסות חלקות בבת אחת על ידי בחירת פילוח בתפריט העליון ותוויות חלקות. קליק ימני על התמונה ובחר ליצור משטח לייצר משטח 3D לדקלם של הרכיב (איור 2 ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש על המשטח ולשמור נתונים כקובץ hmascii לצורך יבוא תוכנת meshing. </li></ol> 3. חישוב הכוחות השרירים כדי לשמש דגם FE <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את מספר סיבי שריר מתמונות confocal של smyhc: דג הזברה מהונדס GFP (איור 1 א &#39;, ראש חץ, 1C) ולמדוד את קוטרeter של סיבים כדי לחשב שטח החתך שלהם (πr 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה כוח מתאים ליחידת שטח שריר מהספרות. כוח השריר המקסימאלי שנוצר ליחידת שטח עבור שרירי שלד דג זברת זחל (40 ננ / מיקרומטר 2) שמש 17. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את הכוחות לכל קבוצת שרירים אנטומיים ידי הכפלת מספר סיבי ושטחם ידי הכוח ליחידת שטח. ראה טבלה 1. </li></ol> 4. יצירת Mesh <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבא את מודל 3D שנוצר בסעיף 2 (לעיל) לתוך חבילת תוכנה מסוגלת לייצר רשת אלמנטים סופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור רשת A2D של הסחוס ומשטחים משותפים על ידי שימוש באפשרות הפסיכולוג לעטוף תחת תפריט 2D. בחר גודל אלמנט מתאים. הערה: השתמש בגודל אלמנט בין 1.5-2.5. במידת הצורך, ליצור מגוון של השטח 2D בגודל שונה משתלב לבצע אופטימיזציה רשת 3D (סעיף 4.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע בדיקות איכות רשת למצוא תחת &quot;כלי 2D&gt;&gt; בדוק אלמנטים&quot; לוח לבדוק אלמנטים כפולים, הוספות וחדירות של הרשת. תקן זוויות dihedral באמצעות לשונית שירות עץ מודל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור רשת 3D מן משתלב משטח 2D עם הבדלי גודל האלמנט באמצעות subpanel 3D&gt; Tetramesh. הערה: השווה את התוצאות של גדלי רשת שונים ובחר את מודל FE עם גודל הרשת הנמוך ביותר מתכנס לאחר סימולציות נוספות כלשהו ואינו משפיע על הגדרת תכונה. הדוגמא באיור 3 מכילה 1.5 מיליון אלמנטים tetrahedral עבור סחוסי הלסת התחתונים והייתה לו גודל אלמנט 2D של 2.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את הרשת כך מודל לסת הוא להתרחב בד בבד לכל מחסנית confocal באמצעות subpanel הגיאומטריה&gt; המרחק. הערה: ודא הסחוס ורכיבים משותפים מחוברים במודל על ידי יצוא מודל ממוזג או באמצעות קשרים. </li></ol> 5. Mod אלמנטים סופייםאל בניה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אלמנטים סופיים תוכנה מסחרית (FE), ליצור מודל FE. באמצעות ערימות confocal 3D השרירים שכותרתו סחוס שנוצרו בסעיף 1 כמדריך, להקצות צמתים מתאימות נקודות מצורפות שריר. צור וקטור בין שני צמתים המייצגים את המקור ואת החדרת כל שריר (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור אספן עומס מסוג &#39;היסטוריה&#39; כדי להחיל &quot;עומס ג &#39;עבור כל שריר. ציין את גודל ב ניוטונים (המחושב בשלב 3.3) ולהקצות וקטור הקשורים. איור 3 מציג את נקודות ההתקשרות עבור mandibulae adductor (PM), מד-זווית hyoideus (PH) ו intermandibularis (IM). הערה: לקבלת שרירי לסת אלה, כוח התכווצות מקסימלית מופץ בין מוצא ההחדרה כך שרק 50% של כל אחד מעומסי מוחל בכל אתר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקצאת תכונות החומר איזוטרופיים אלסטי המתאים כפי שנקבע על ידי הספרות. מודול יאנג עבור סחוסואת interzone במודל זה היו 1.1 מגפ&quot;ס ו 0.25 מגפ&quot;ס בהתאמה ויחס פואסון היה 0.25 עבור שני 18,19. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור אספן עומס של &#39;הגבול&#39; הסוג להחיל מגבלות ראשוניות לדגם. עבור אל כרטיסיית ניתוח&gt; האילוצים של subpanel ליצור, לאסוף את הבלוטות לדגם ברצונך להגביל. בחר את דרגות החופש (DOF) כי מגבילים את התנועה של המודל הקירוב הטוב ביותר של טווח התנועה הטבעי. הערה: המודל באיור 3 היה מוגבל בכל צירי תנועה (DOF: 1, 2, 3 מייצגים x, y ו- z, בהתאמה) בבית ceratohyal לעגן אותו בחלל בנקודה אמצע במודל וב ציר y ו- z בנקודה שבה palatoquadrate מתחבר לשאר הגולגולת דג הזברה (איור 3, טבלה 1). המודל חייב להיות מוגבל בכל השלושה DOF בתוך צומת לפחות אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור &quot;צעד טען &#39;, עבור כל סוג של תנועה ברצונך מכשירי כושראכול (כלומר, פתיחה, סגירה), תחת תפריט הניתוח ובחר את כל ההמון הרלוונטי (עשה בסעיף 5.2) ואילוצים (עשה בסעיף 5.4) כדי לדמות את התנועה הזאת. בחירה &#39;סטטי&#39; מן התפריט הנפתח כאשר הוא מופיע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מודל יצוא כוללים רשת, המון, אילוצי תכונות חומר בפורמט קובץ מתאים, בפורמט &quot;.inp&quot; במקרה זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מודל טען לתוך תוכנת ניתוח FE. יצירה וביצוע עבודה עבור המודל באמצעות מודול איוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח פלט מתח, מתח, עקירה, וכו המצויות בתפריט להדמיה הכרטיסייה ותוצאות (איור 4 ו -5). </li></ol> 6. אימות של לסת דפורמציה / עקירת מרחקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר 3-6 Tg (Col2a1aBAC: mCherry) דג הזברה מהונדס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קלות לטשטש את הזחלים עם MS222 0.02% עד שהם מפסיקים להגיב למגע אך ליבם עדיין פועם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרהזחלים רוחביים (תוך מורדם) על coverslips ב agarose LMP פושר 1% (המורכבים בתמיסה של Danieau). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את agarose מרחבי הראש והלסתות עם מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף הטרי הפתרון של Danieau (ללא MS222) מעל ראשו של הזחל להסיר הרדמה בעזרת פיפטה פסטר עד תנועות פה נורמליות לחדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנת לכידת סרט לקחת קטעי וידאו בהיר שדה מהיר של תנועות פה. קח סרטים של סביב משך דקות בקצב התמונות הגבוה ביותר, או מספיק כדי להקליט מחזורים רבים של פתיחת לסת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר מסגרות המציגות את הלסת פתוחה העקירה המקסימלית שלה. למדוד את המרחק בין הקצה הקדמי של הסחוס של המקל ואת הלסת העליונה (קץ צלחת כִּברָתִי) ב מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את עקירת ממוצע זחלי דג מרובים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלץ נתוני עקירה מהמודל. השתמש העקירה הממוצעת מחושבת ב 6.8 לאמת התנהגות תזוזת מודל ( <strong&gt; איור 4). אם המודל חורג מן צפוי, ניתוח רגיש מנוהל על ידי שינוי ברצף תכונות חומר והמון שרירים. </li></ol>

<ol><li>Rayfield, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finite+Element+Analysis+and+Understanding+the+Biomechanics+and+Evolution+of+Living+and+Fossil+Organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Earth+Planet.+Sci%22%5BJournal%5D)">Finite Element Analysis and Understanding the Biomechanics and Evolution of Living and Fossil Organisms.</a> Annu. Rev. Earth Planet. Sci. 35, 541-576 (2007).</li>
<li>Rao, S. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRao%2C+SS+%22The+Finite+Element+Method+in+Engineering%3A+Fifth+Edition%22">The Finite Element Method in Engineering: Fifth Edition</a>. , (2010).</li>
<li>Taylor, M., Prendergast, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+decades+of+finite+element+analysis+of+orthopaedic+devices%3A+Where+are+we+now+and+what+are+the+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Four decades of finite element analysis of orthopaedic devices: Where are we now and what are the opportunities.</a> J Biomech. 48, 767-778 (2015).</li>
<li>Button, D. J., Rayfield, E. J., Barrett, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cranial+biomechanics+underpins+high+sauropod+diversity+in+resource-poor+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Royal+Soc+London+B%3A+Biol+Sci.+281%22%5BJournal%5D)">Cranial biomechanics underpins high sauropod diversity in resource-poor environments.</a> Proc Royal Soc London B: Biol Sci. 281. 281, (2014).</li>
<li>Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiology+and+developmental+control%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanobiology and developmental control.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 27-61 (2013).</li>
<li>Shwartz, Y., Farkas, Z., Stern, T., Aszodi, A., Zelzer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+contraction+controls+skeletal+morphogenesis+through+regulation+of+chondrocyte+convergent+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+biol%22%5BJournal%5D)">Muscle contraction controls skeletal morphogenesis through regulation of chondrocyte convergent extension.</a> Dev biol. 370, 154-163 (2012).</li>
<li>Rolfe, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+mechanosensitive+genes+during+skeletal+development%3A+alteration+of+genes+associated+with+cytoskeletal+rearrangement+and+cell+signalling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomics%22%5BJournal%5D)">Identification of mechanosensitive genes during skeletal development: alteration of genes associated with cytoskeletal rearrangement and cell signalling pathways.</a> BMC genomics. 15, 48(2014).</li>
<li>Roddy, K. A., Kelly, G. M., van Es, M. H., Murphy, P., Prendergast, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+patterns+of+mechanical+stimulation+co-localise+with+growth+and+cell+proliferation+during+morphogenesis+in+the+avian+embryonic+knee+joint%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Dynamic patterns of mechanical stimulation co-localise with growth and cell proliferation during morphogenesis in the avian embryonic knee joint.</a> J Biomech. 44, 143-149 (2011).</li>
<li>Haudenschild, D. R., Chen, J., Steklov, N., Lotz, M. K., D'Lima, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+chondrocyte+actin+cytoskeleton+in+living+three-dimensional+culture%3A+response+to+anabolic+and+catabolic+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+cell+biomech%22%5BJournal%5D)">Characterization of the chondrocyte actin cytoskeleton in living three-dimensional culture: response to anabolic and catabolic stimuli.</a> Mol cell biomech. 6, 135-144 (2009).</li>
<li>Nowlan, N. C., Murphy, P., Prendergast, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+pattern+of+mechanical+stimulation+promotes+ossification+in+avian+embryonic+long+bones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">A dynamic pattern of mechanical stimulation promotes ossification in avian embryonic long bones.</a> J Biomech. 41, 249-258 (2008).</li>
<li>Giorgi, M., Carriero, A., Shefelbine, S. J., Nowlan, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiological+simulations+of+prenatal+joint+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Mechanobiological simulations of prenatal joint morphogenesis.</a> J Biomech. 47, 989-995 (2014).</li>
<li>Heegaard, J. H., Beaupre, G. S., Carter, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanically+modulated+cartilage+growth+may+regulate+joint+surface+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ortho+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanically modulated cartilage growth may regulate joint surface morphogenesis.</a> J Ortho Res. 17, 509-517 (1999).</li>
<li>Hammond, C. L., Schulte-Merker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+populations+of+endochondral+osteoblasts+with+differential+sensitivity+to+Hedgehog+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Two populations of endochondral osteoblasts with differential sensitivity to Hedgehog signalling.</a> Development. 136, 3991-4000 (2009).</li>
<li>Mitchell, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+studying+osteoarthritis+genetics+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+cartilage+%2F+OARS%2C+Osteoarth+Res+Soc%22%5BJournal%5D)">New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish.</a> Osteoarthritis and cartilage / OARS, Osteoarth Res Soc. 21, 269-278 (2013).</li>
<li>Elworthy, S., Hargrave, M., Knight, R., Mebus, K., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+multiple+slow+myosin+heavy+chain+genes+reveals+a+diversity+of+zebrafish+slow+twitch+muscle+fibres+with+differing+requirements+for+Hedgehog+and+Prdm1+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression of multiple slow myosin heavy chain genes reveals a diversity of zebrafish slow twitch muscle fibres with differing requirements for Hedgehog and Prdm1 activity.</a> Development. 135, 2115-2126 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Danieau%27s+solution+%2830%C3%97%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Prot%22%5BJournal%5D)">Danieau's solution (30×).</a> Cold Spring Harb Prot. , pdb.rec12467 (2011).</li>
<li>Iorga, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromechanical+function+of+myofibrils+isolated+from+skeletal+and+cardiac+muscles+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+physiol%22%5BJournal%5D)">Micromechanical function of myofibrils isolated from skeletal and cardiac muscles of the zebrafish.</a> J Gen physiol. 137, 255-270 (2011).</li>
<li>Tanck, E., Blankevoort, L., Haaijman, A., Burger, E. H., Huiskes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+muscular+activity+on+local+mineralization+patterns+in+metatarsals+of+the+embryonic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ortho+Res%22%5BJournal%5D)">Influence of muscular activity on local mineralization patterns in metatarsals of the embryonic mouse.</a> J Ortho Res. 18, 613-619 (2000).</li>
<li>Tanck, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanical+consequences+of+mineralization+in+embryonic+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">The mechanical consequences of mineralization in embryonic bone.</a> Bone. 35, 186-190 (2004).</li>
<li>Brunt, L. H., Norton, J. L., Bright, J. A., Rayfield, E. J., Hammond, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finite+element+modelling+predicts+changes+in+joint+shape+and+cell+behaviour+due+to+loss+of+muscle+strain+in+jaw+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Finite element modelling predicts changes in joint shape and cell behaviour due to loss of muscle strain in jaw development.</a> J Biomech. 48, 3112-3122 (2015).</li>
<li>Roddy, K. A., Prendergast, P. J., Murphy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+influences+on+morphogenesis+of+the+knee+joint+revealed+through+morphological%2C+molecular+and+computational+analysis+of+immobilised+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Mechanical influences on morphogenesis of the knee joint revealed through morphological, molecular and computational analysis of immobilised embryos.</a> PloS one. 6, e17526(2011).</li>
<li>Cuff, A. R., Bright, J. A., Rayfield, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+experiments+on+finite+element+models+of+an+ostrich+%28Struthio+camelus%29+cranium%5BTitle%5D)+AND+%22Peer+J%22%5BJournal%5D)">Validation experiments on finite element models of an ostrich (Struthio camelus) cranium.</a> Peer J. 3, 1294(2015).</li>
<li>Schilling, T. F., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Musculoskeletal+patterning+in+the+pharyngeal+segments+of+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Musculoskeletal patterning in the pharyngeal segments of the zebrafish embryo.</a> Development. 124, 2945-2960 (1997).</li>
<li>Dowthwaite, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+underlying+the+movement+requirement+for+synovial+joint+cavitation%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+biol%22%5BJournal%5D)">A mechanism underlying the movement requirement for synovial joint cavitation.</a> Matrix biol. 22, 311-322 (2003).</li>
<li>Nia, H. T., Han, L., Li, Y., Ortiz, C., Grodzinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poroelasticity+of+cartilage+at+the+nanoscale%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Poroelasticity of cartilage at the nanoscale.</a> Biophys J. 101, 2304-2313 (2011).</li>
</ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף. חלק מנתוני תאני 3-5 כבר נדפסו מן J.Biomech, 48 (12), בניטל et al., דוגמנות אלמנט סופית צופה שינויים בצורה משותפת ותא התנהגות כתוצאה מאובדן מתיחת שריר בפיתוח לסת, 3112-22. 2015, באישור Elsevier 15.

מודלים אלמנטים סופיים שימשו להתייחס בתחומי אלמנטים השלד כי הם תחת לחץ עם אלה היווצרות העצם והתנסות 10, כמו גם למפות את האזורים תחת לחץ במהלך התאבנות endochondral ומורפוגנזה משותף 8,12,21. מחקרים אחרים גם הצליחו ליישם מודלי צמיחה תיאורטי לשכפל שינויים במהלך פיתוח משותף 11,12. כאן אנו מציגים את הפרוטוקול לבניית מודלי FE עבור מערכת פשוטה יחסית, לסת דג הזברה 20. בניגוד לשיטות חלופיות איסוף תמונות גולמיות עבור דגמי FE, כגון CT סריקה 22, הדמית confocal של קווים מהונדסים או דג זברת immunostained מאפשר רקמות מרובות כדי להיחקר. זה יכול, אם כן, לספק מידע ישיר על נקודות מצורפות שריר ביחס סחוס. בין דגמי חוליות דג הזברה ניתנת במיוחד מניפולציה גנטית תרופתית. הדור של דגמי FE עבור דג הזברהסחוס craniofacial עכשיו פותח את האפשרות של מחקר נוסף של יחסי הגומלין בין ביומכניקה וגנטיקה morphogenesis משותף. ישנם מספר שלבים קריטיים לתהליך של יצירת מודל FE; הראשון הוא יצירת ייצוג תלת ממדי מדויק של המערכת. זה דורש הדמיה ברזולוציה גבוהה מספיק כדי להגדיר גבולות ברורים. שימו לב כי גם עם הדמיה ברזולוציה גבוהה לבצע משטח טוב אחד יכול להיות להחליק כמה אזורים. שלב קריטי נוסף הוא הגדרת המיקום הנכון של העומס ואילוצים נכונים. מודל מוגבל מספיק ייכשל לפתור והשמה שגוי של העומסים יגרום תנועה חריגה. חלק מהעיבוד של הנתונים הגולמיים (איור 2) יש צורך כמשטח המופק מהנתונים הגולמיים יהיה קשה רשת (תרשים 2B). אנחנו מסוננים הנתונים באמצעות מסנן גאוס (איור 2 ג </sטרונג&gt;) וביצענו כמה החלקה ידנית של עקומות לייצר סדרה של קווי המתאר נקי כי ניתן להמיר את משטח 3D. חלקה יותר מדי יכולה לייצר משטח &quot;נמס&quot; שאבד רבים מסממניה. בחירת גודל האלמנט הנכון היא תהליך חוזר ונשנה כמו בחירה קטנה מדי גודל אלמנט היוצר גדולה מדי רשת אשר מחשוב אינטנסיבי. עם זאת, בחירת גודל אלמנט גדול מדי תפיק רשת אשר נכשלה לשחזר את הצורה הנכונה של המבנה. הרשת הנכונה, ניתנה גודל האיבר הקטן שכבש את הצורה הנכונה של הלסת והתאסף פתרון נכון, לאמת אותם באמצעות עקירת בלסת. זה יכול להיות גם צורך לשנות את תכונות חומר או חישובי עומס טוב יותר לחקות את העקירה הנכונה כגילים ומינים שונים יהיו מאפיינים שונים באופן משמעותי. חשוב לזכור כי תמיד יש מגבלות מודל היפותטי<html> ssumptions הריץ מודלי FE. כאשר רק דוגמנות אחד או מספר קטן של דוגמאות הוא קריטי כדי להבטיח מדגם מייצג נבחר שם צפוי להיות שינויים קלים בין אנשים. כפי רק כמה מן האלמנטים הלסת והשרירים נכללו, המודל הוא גרסה פשוטה יותר של מערכת השלד והשרירים craniofacial דג הזברה. לכן, אילוצים חייבים להיות ממוקמים לתת דין וחשבון על שלושת יסודות לסת הדגם שיחברו עם שאר הגולגולת ואת המודל היה מוגבל באופן מלאכותי במרכז לתקן את זה ב &#39;מרחב&#39;. אילוץ מלאכותי זה לא השפיע על פרשנות שאובי המודלים כמו ceratohyal עצמו לא נותח. ההכללה יותר של מבנה craniofacial, במיוחד אחרים שרירי פתיחת לסת כגון sternohyals והסחוס המצורף שלה 23, יכל להוסיף למודל, אבל מגבלות כוללות את היכולת של דגמים גדולים יותר לרוץ בתוכנת האלמנטים הסופיים. <html> s = &quot;jove_content&quot;&gt; מגבלה נוספת היא שלא אנו דגם כניסת רצועה, אם כי זו יכולה להיות מושגת על ידי ההחדרה של מעיינות 8. הנחה נוספת אחת עשתה במקרה זה הייתה שהמודל יתנהג באופן ליניארי. סדרי הגודל של זנים על המודלים היו דומים לאלו במודלים שפורסמו וכן להחיל תאים במבחנת 10,24, עם זנים להיות מתחת 3500 ומעלה -5000 μɛ מלבד נקודות מצורפות אילוץ ושרירים. לכן, הזנים על האזורים הרלוונטיים של המודל נחשבו בתוך טווח מקובל עבור מודל ליניארי. סחוס אינו מתנהג לגמרי כחומר לינארית כבר דגם בעבר כחומר poroelastic, שאפשר ניתוח של ההתנהגות הנוזלת במודל 25. הפצת נקודות המצורפת שריר בקרב צרור של בלוטות מקומיות תחלק כוחות השיא ועוד לייצג במדויק את כניסת השריר עבור שרירים מסוימים. אף אוזן גרון &quot;&gt; שימוש FE מאפשר הערכה של הזנים המדגישים מתנהגים על מבנה. כטכניקה הוא משמש לעתים קרובות בתחומי מדעי חיים רבים כולל אורתופדיה, פליאונטולוגיה וביולוגיה התפתחותית ולאחרונה. כאן אנו מתארים כיצד לבנות פס עבור דג הזברה לסת תחתונה. בעתיד המודלים האלה ניתן יהיה להרחיב להסתכל הלסת כולה, כולל את החיך. בטכניקות דומות יכולות לשמש מודל ביומכניקה שדרה בדגים, אשר עד כה בעיקר נחקרו באמצעות קינמטיקה.

דוגמנות אלמנט סופי (FE) היא טכניקה הנדסה שניתן לחשב המחשוב ולמפות את גודל ומיקום של זנים שפועלים על מבנה 1. המודל מורכב מבנה 3D, מיוצג על ידי רשת של &quot;אלמנטים סופיים&quot;, ואת התוצאה הסופית של הניתוח נשלטת על ידי מספר גורמים, כולל את המבנה ואת מספר אלמנטי הרשת, העוצמת והמיקום של המכנים המון ואת תכונות חומר. תכונות חומר לתאר היבטים מסוימים של ההתנהגות של חומר תחת סוג של עומס נתון; מודול יאנג (E) מתאר את האלסטיות של החומר תוך מקדם פואסון מתאר את הירידה המידתית ברוחב של חומר אורכו כאשר מדגם נמתח. דוגמנות FE יכול לשמש כדי לחשב מגוון רחב של משתנים ובהם עקירה, מתח, לחץ ומשחק הלחץ על מודל על ידי לקיחת בחשבון את נתוני הקלט שמייחד את מבנה &#39;; S צורה, מיקום וגדל המון ואת תכונות חומר המבוקשות. דוגמנות FE נעשה שימוש נרחב בהנדסה 2 ויותר עבור יישומים אורתופדיות 3 ו כפליאונטולוג 4. בפיתוח כוחות ביומכניים ידועים לפעול כגירוי בתאים רבים כדי להפעיל תגובות תא 5-8 וזה שימושי לחזות הוא את המיקום היחסי ואת הבהירויות של גירויים מכאניים בתוך בפיתוח מערכות איברים, לעומת זאת, כיום דוגמנות FE כבר המשמש קצת לפיתוח דג הזברה. הסחוס והעצם שניהם הוכחו להיות חומרי mechanosensitive. לדוגמא, במבחנת דחיסה נמצאה להפעיל מסלולי chondrogenic, תוך מתח הוכח להיות הכרחי עבור עצם היווצרות 9. FE הניתוח (FEA) נוצל מודל זנים הפועלים דגימות ביולוגיות, כולל הפועלים אלמנטי שלד במהלך עצם FOrmation 10. פיתוח יישומים אחרים כוללים את שימוש בו כדי לחזות את הצורה של ג&#39;וינט לאחר שהוא נחשף כוחות ביומכניים תיאורטי 11,12 וכדי להראות הדפוס של זנים נוכחים במהלך המורפוגנזה מפרק ברך חומוס 8. פרוטוקול זה נועד לשתף את החוויה של יצירת משטחים 3 ממדים, משתלב ומודלי אלמנטים סופיים מתמונות confocal עם נוף להבנת המכניקה של רקמות מתפתחות. אנחנו גם להראות דרכים של תיקוף המודלים FE אף לכידת מידע עקירה משותף אמיתי in vivo. בעוד אנו משתמשים לסת דג הזברה כדגם אותן הטכניקות יכולות לשמש על כל מערכת ביולוגית קטנה עבורו מידע 3D על המבנה של מערכת השלד והשרירים ניתן להשיג על ידי הדמית confocal או multiphoton.

<table><tbody><tr><td>Coll2</td><td>Abcam</td><td>ab34712</td><td>נוגדן קולגן מסוג II - מכתים את כל הסחוס</td></tr><tr><td>A4.1025 / MF20</td><td>מחקרים התפתחותיים בנק היברידומה</td><td>A4.1025</td><td>נוגדן מיסואין שלד - מסמן את כל שרירי השלד&nbsp;</td></tr><tr><td>סיגמא אגרוז נמס נמוך</td><td>&nbsp;</td><td>A9414-5G</td><td>להרכבת דג זברה</td></tr><tr><td>MS222 (אתיל 3-אמינובנזואט מתאן סולפונט)</td> <td>Sigma</td><td>E10521-10G</td><td>להכנת חומר הרדמה</td></tr><tr><td>טריפסין</td><td>פישר</td><td>T/3760/48</td><td>דגימת פרמבליזציה</td></tr><tr><td>Dylight 488 עכבר IgG</td><td>Thermofisher</td><td>35502</td><td>נוגדן משני</td></tr><tr><td>Dylight 550 ארנב IgG</td><td>Thermofisher&nbsp;</td><td>84541</td><td>נוגדן משני</td></tr><tr><td>SP8/SP5 או SPE קונפוקלי</td><td>Leica&nbsp;</td><td></td><td>להדמיה&nbsp;</td></tr><tr><td>תוכנת לכידת LAS Leica</td><td>תוכנת הדמיה</td><td>Leica</td><td></td></tr><tr><td>Aviso (גרסה 7.0.0)</td><td>תוכנת ניתוח תמונות תלת מימד</td> <td>של FEI Visualization Science Group</td><td></td> (סעיף 2)</tr><tr><td>Hypermesh חלק מחבילת Hyperworks (גרסה 10)</td><td>תוכנת יצירת מודלים של Altair Engineering</td><td></td><td>FE (סעיף 4-5)</td></tr><tr><td>Abaqus (גרסה 6.14)</td>תוכנת ניתוח <td>SIMULIA</td><td></td><td>FE (סעיף 5.7-5.8)</td></tr></tbody></table>

בניית מודלים אלמנטים סופיים לחקור ביומכניקה לסת דג הזברה

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

מורפוגנזה של השלד מתרחשת באמצעות התנהגויות תאים מווסתות היטב במהלך ההתפתחות; סוגי תאים רבים משנים את התנהגותם בתגובה למאמץ מכני. מפרקי השלד נתונים לעומס מכני דינמי. ניתוח אלמנטים סופיים (FEA) היא שיטה חישובית, המשמשת לעתים קרובות בהנדסה שיכולה לחזות כיצד חומר או מבנה יגיבו לקלט מכני. על ידי חלוקת מערכת שלמה (במקרה זה שלד הלסת של דג הזברה) לרשת של 'אלמנטים סופיים' קטנים יותר, ניתן להשתמש ב-FEA כדי לחשב את התגובה המכנית של המבנה לעומסים חיצוניים. ניתן לדמיין את התוצאות בדרכים רבות, כולל כ'מפת חום' המציגה את מיקומם של זנים עיקריים מקסימליים ומינימליים (מתח עיקרי חיובי מצביע על מתח ואילו שלילי מצביע על דחיסה. המקסימום והמינימום מתייחסים לזן הגדול והקטן ביותר). ניתן להשתמש בהם כדי לזהות אילו אזורים בלסת ולכן אילו תאים צפויים להיות תחת עומסי מתח או דחיסה גבוהים במיוחד במהלך תנועת הלסת ולכן ניתן להשתמש בהם כדי לזהות קשרים בין מתח מכני להתנהגות התאים. פרוטוקול זה מתאר את השלבים ליצירת מודלים של אלמנטים סופיים מנתוני תמונה קונפוקלית על מערכת השלד והשרירים, תוך שימוש בלסת התחתונה של דג הזברה כדוגמה מעשית. הפרוטוקול מוביל את הקורא דרך סדרה של שלבים: 1) צביעה של רכיבי השלד והשרירים, 2) הדמיית רכיבי השלד והשרירים, 3) בניית משטח תלת מימדי (תלת מימד), 4) יצירת רשת של אלמנטים סופיים, 5) פתרון ה-FEA ולבסוף 6) אימות התוצאות על ידי השוואה לתזוזות אמיתיות שנראות בתנועות לסת הדג.

Immunostaining עבור שריר (איור 1 א) וסחוס (איור 1B) או הדמיה של כתבים מהונדסים (תרשים 1C) מאפשר מבנה 3D של הלסת להיות מדמיין, יחד עם השרירים הקשורים. על ידי הדמיה ברזולוציה גבוהה ניתן היה לבנות מודל לוכד הוא הצורה התל-ממדית של הלסת (איור 2) ואת המיקום ומיקום של עומסים (איור 3). ניצול ב התקות vivo לראות דרך לכיד וידאו במהירות גבוהה (איור 4) אנו מאשרים כי את טווח התנועה במודל היה בטווח מציאותי. מודלי FE פעם ריצה יכולים לשמש כדי להציג מגוון של נתונים, כגון מתח (איור 5 א), מינימום ומתח עיקרי מרבי (איור 5 ב - K). תוצאות אלו עולות שלושה עמומות<html> ensional כך המודל יכול להיות מוגדל לראות דפוסים בסדר הפירוט (איור 5E, 5i) לסובב להשיג צפיות רלוונטי (איור 5F, 5G, 5J, 5K) מחולק באופן דיגיטלי (5E איור &#39;, 5E&#39; &#39;, 5i&#39;, 5i &#39;&#39;) כדי להראות עד כמה דפוסי מתח, מתח או שינוי בלחץ לאורך כל דגם. כמו כן ניתן לחלץ נתונים כמותיים מהמודל (לא מוצג). על ידי אימות המודל באמצעות תכונות חומר המדויק ביותר, המון רשת צורת המודל FE יכול לשמש כדי לחקור את האומדן הטוב ביותר של הסביבה המכאנית נחווים על ידי תאים במהלך החלון של פיתוח. התוצאות של המודל ניתן להשוות באופן ישיר לשינויים בהתנהגות הסלולר ביטוי גנים 20. <html> בתשובה לשאלה 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54,811 / 54811fig1.jpg &quot;/&gt; איור 1:. נציג תמונות של אלמנטי השלד של לסת דג הזברה הנמוכה ב 5 DPF ערימות confocal נציג של הלסת התחתונה של זחלי 5dpf כל מוצג עם קדמי למעלה (א) Immunostaining עבור A4.1025 אשר מכתים את כל שרירן השלד (B) immunostaining עבור קולגן סוג II המסמן את כל הסחוס (C) סטאק של פגיית חיים המבטאים את col2a1 הכתבים המהונדס: mCherry סימון סחוס (אדום) ו smyhc: שרירים איטיים GFP (ירוק). IA: הקדמי intermandibularis, PH: המד hyoideus, AM: adductor mandibulae, HI: hyoideus נח, HI: hyoideus מעולה, CH: sternohyoideus, MC: הסחוס של המקל, PQ: Palatoquadrate, CH:. Ceratohyal <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של נתון זה.</a> &quot;FO: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig2.jpg" /> איור 2: דור של משטח 3D מנתונים confocal תמונות מראות את המעבר מנתוני confocal לתוך משטח 3D עבור לסת דג הזברה הנמוכה עם גדלה גבוהה של האזור המשותף.. (א) נתונים confocal גלם; (ב) מערך נתונים לאחר היישום של מסנן גאוס; (ג) מתאר מסונן; (ד) משטח 3D. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig3.jpg" /> איור 3: משתלב נציג מראים אילוצי וקטורי כוח משתלב נציג עבור זחל 5 DPF עבור (א) סגירת פה.(ב) פתיחת פה. נקודות לבנות מציינים במקומות בהם מודל מוגבל ושבהם ממדים (למשל, x ו- y או x, y ו- z). קווים לבנים לציין עמדות שרירות, עם הווקטור בכוח השריר כונה על ידי חצים לבנים. אדום עולה סחוס צהוב interzone. נתון זה יש הבדל בין חומר משלים שפורסמו בעבר בנטל et al. 15. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig4.jpg" /> איור 4:. בדיקות רגישות FE-מודל המדמה עקירה בלסת דג הזברה 5dpf לסחוס שונים moduli של interzone יאנג. לסת עקירה (פתוח סגור מיקרומטר) מסומן על הלסת; רשם באמצעות מקש הצבע. כל דגם (A - L) יש שילוב שונה של סחוס (c = 1.1, 3.1, או 6.1 MPA) או interzone (i = של 0.25, 0.5, 0.75, או 1 נכסים MPA). חץ שחור אופקי מדגיש את הערך של עקירת בלסת בקצה של הסחוס של המקל (המיוצגים על ידי החץ השחור האנכי). M ו- N סטילס מתוך וידאו של 5 DPF מינימום מראה זחלים, כלומר, לסת סגורה (M) ומקסימום, כלומר, לסת פתוחה לגמרי (N) עם שני גבים (O) - קו לבן על O מייצגת את העקירה (43 מיקרומטר). יחסית במקרה זה תכונות סחוס של 1.1 עם interzone של 0.25 (א) ההתאמה הטובה ביותר התקות לראות דגים חיים (O). לוחות AL של נתון זה פורסמו בעבר בנטל et al. 15. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג vers גדול</a>יון של נתון זה. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig5.jpg" /> איור 5: נציג נתונים מהמודלים FE סימולציה FE-מודל של כל השרירים מיושם 5 DPF הזחל (A - C).. (א) פון מיזס (EMaxmin) (B) זן עיקרי מינימום (E Min. P, μɛ) (ג) זן העיקרי מקסימלי (E מקס. פ, μɛ). FE-מודל סימולציה של זנים עיקריים מינימום ומקסימום במהלך פתיחת הלסת. (D - K): זן עיקרי מקסימאלי (. E מקס פ, μɛ) (ד) צפה לסת גחון (E) נוף משותף גחון (E) מציג את המיקום של חלקים הפרוקסימלי-דיסטלי דרך הסחוס של המקל משותף ואת interzone ב (E &#39;) ו- (ה&#39; &#39;), בהתאמה. (F): לרוחבלסת בעלת נוף. (G): נוף משותף לרוחב. (H - K): זן עיקרי מינימום (. E Min P, μɛ) ב (H) גחון לסת הצגה (I) נוף משותף גחון. (אני) מציג את המיקום של חלקים הפרוקסימלי-דיסטלי דרך משותפת הסחוס של מקל ו interzone ב (אני) ו (אני &#39;&#39;) בהתאמה (J): נוף הלסת לרוחב. (K): נוף משותף לרוחב. נתון זה כבר פורסם בעבר בנטל et al. 15. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> מספר סיבי שריר </td><td> שריר סיבים באזור (מיקרומטר 2) </td><td> שרירים באזור הקבוצה (מיקרומטר2) </td><td> חיל (N) </td></tr><tr><td> 5 DPF intermandibularis קדמי </td><td> 5 </td><td> 23.8 </td><td> 119 </td><td> 4.76e-6 </td></tr><tr><td> 5 DPF מד hyoideus </td><td> 6 </td><td> 23.8 </td><td> 142.8 </td><td> 5.71e-6 </td></tr><tr><td> 5 DPF adductor mandibulae </td><td> 9 </td><td> 23.8 </td><td> 214.2 </td><td> 8.57e-6 </td></tr></tbody></table> שולחן 1: כימות שרירים. לפי חישוב כוחות שריר הממוצע עבור Anterior Intermandibularis, adductor Mandibulae ואת זוית Hyoideus ב 5 DPF באמצעות 40 ננ / מיקרומטר 2 (ערך ליחידת שטח שנלקח התייחסות 17). (Lorga et al., 2011) (n = 3).

ניתוח אלמנטים סופיים הוא כלי בשימוש תכוף לחקירת הביצועים המכניים של מבנים תחת עומס. כאן אנו מיישמים את השימוש בו למידול הביומכניקה של לסת דג הזברה.

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

המטרה הכלית של טכניקת מידול זו היא לדמות את הסביבה המכנית שחווים לסתות של דגי זבראה (zebrafish) בשלבי התפתחותם. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום השריר-שלד, כגון: כיצד משתנים דפוסי העומס המכני לאורך זמן? וכיצד עומסים אלו מעוררים התנהגות תאית.היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לנו לנתח דפוסי ביטוי גנים ושינויים בהתנהגות התאים בהקשר של הסביבה המכנית. שיטה זו יכולה לספק תובבנות לגבי התפתחות השלד. ניתן ליישמה גם על כל מבנה ביולוגי אחר החשוף לעומס מכני, כגון מרכיבי השלד בחולייתנים גבוהים, או מערכת הלב וכלי הדם.באופן כללי, אנשים שאינם מנוסים בשיטה זו עשויים להתקשות, מכיוון שהטרמינולוגיה והתוכנה מניחות רקע בהנדסה. כדי להמחיש את צורת רכיבי השלד, לכמת את השריר ולזהות את המיקום המדויק של נקודות החיבור של השריר, בצעו צביעה אימונוהיסטוכימית לדגי השלד בגיל המתאים עבור myosin של השלד וקולגן מסוג II. ראשית, קבעו זחלי דג ב-4% paraformaldehyde ו-PBS למשך שעה אחת.לאחר מכן, שטפו את המקבע באמצעות שני שטיפות PBT. לאחר מכן, בצעו דהידרציה לזחל ב-50%methanol וב-PBT למשך חמש דקות, ולאחריהן ב-100%methanol למשך חמש דקות. ניתן לאחסן את הזחלים ב-100%methanol עד למועד השימוש.בעת הצורך, יש להחזיר את הזחל למצב הידרטציה ב-50% methanol ו-PBT למשך חמש דקות. לאחר מכן, יש לשטוף אותו ב-PBT למשך חמש דקות. כעת, יש לבצע פרמיליזציה לזחל באמצעות 0.25% trypsin ו-PBT על קרח למשך חמש עד שש דקות.לאחר מכן, שטפו אותה ב-PBT למשך חמש דקות וחזרו על השטיפה ב-PBT שלוש פעמים נוספות. לפני החלת הנוגדנים, חסמו את הזחל למשך שעתיים עד שלוש שעות ב-5% serum ו-PBT. לאחר מכן, דגרו את הזחל בדילול המומלץ של נוגדני rabbit anti-type II collagen ו-mouse anti-myosin עם 5% serum ו-PBT.בצעו דגירה זו למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, או למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C. לאחר יישום הנוגדנים הראשוניים, שטפו את הזחלת ב-PBT insgesamt שש פעמים, למשך 15 דקות לכל שטיפה. לאחר השטיפות ב-PBT, החילו חסימה של 5% serum ו-PBT למשך שעה אחת או שעתיים.כעת, יש להוסיף את הנוגדנים המשניים, ומכאן יש להקפיד להחזיק את הדגימה בחושך ככל האפשר. השתמשו בנוגדנים משניים נגד עכבר ונגד ארנב המסומנים פלואורסקית, ב-5% serum וב-PBT. לאחר הוספת הנוגדנים המשניים, שטפו את הזחל ב-PBT שש פעמים, למשך 10 דקות לכל שטיפה.ניתן כעת לצלם באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי כל זחל שנצבע כפי שתואר, או המבטא תגי פלואורסצנציה, באופן הבא. צלמו סדרת תמונות (stack) קונפוקאלית של אזור העניין באמצעות עדשה אובייקטיבית 10x עם זום דיגיטלי של כ-2.5x. עוררו את הערוץ הירוק והאדום באמצעות לייזר 488-nanometer ולייזר 561-nanometer.לאחר מכן, דגמו תמונות בגודל 512x512 פיקסלים במרווח של 1.3 microns בין מישורי z, עם שלושה ממוצעי שורות (line averages). כ-100 חתכי z ימלאו את הערימה. ייצאו את הנתונים כערימת תמונות בפורמט TIFF.פתחו את ערימת תמונות ה-TIFF והציגו את כל הערוצים בתוכנה המתאימה. לחצו קליק ימני על ערוץ הסחוס, בחרו ב-orthoslice, ואז ב-create. לאחר מכן, לחצו קליק ימני על ערוץ הסחוס ובחרו ב-Image Processing, לאחר מכן ב-Smoothing And Denoising, בחרו ב-image filter, והפעילו את ה-smoothing Gaussian.בתצוגת הפרויקט, לחצו לחיצה ימנית על התמונה המסוננת ובחרו ב-image segmentation, ולאחר מכן ב-edit new label. צרו תווית חדשה עבור כל חומר, כגון סחוס ומפרק. לאחר מכן, בחרו את אזור הסחוס בתמונה באמצעות כלי ה-magic wand כאשר מתג ה-all slices מופעל, והשתמשו בכלי ה-brush כדי להסיר רעשים מהקוים המתארים.בשלב הבא, בחרו את אזור המפרק באמצעות כלי המברשת, והקצו אותו לרכיב המפרק, וחזרו על הפעולה לאורך כל המפרק. כדי להחליק מספר פרוסות בבת אחת, בחרו Segmentation מהתפריט העליון, ואז בחרו Smooth labels. לאחר מכן, כדי להפיק רינדור פני שטח בתלת-ממד של הרכיב, לחצו קליק ימני על התמונה ובחרו Generate Surface.כעת, לחצו על המשטח המרונדר ושמרו את הנתונים כקובץ HMASCII עבור תוכנת היצירת רשת (meshing). יצירת רשת תלת-ממדית היא שלב קריטי ביצירת מודל איכותי. עליכם להגיע לפשרה בין רשת המייצגת את הצורה האמיתית של המבנה שאתם מנסים למדל, לבין רשת שאינה כוללת פירוט רב מדי שעלול להוביל להחדרת אלמנטים בעייתיים, כגון אלמנטים בעלי זווית קטנה או גדולה מדי.כדי ליצור את הרשת, ייבא את המודל התלת-ממדי לחבילת תוכנה מתאימה. כדי ליצור רשת דו-ממדית של משטחי הסחוס והמפרק, השתמש בכלי ה-shrinkwrap תחת תפריט ה-2D. בחר גודל אלמנט שבין 1.5 ל-2.5.ניתן ליצור מגוון רשתות פני השטח בגדלים שונים כדי לבצע אופטימיזציה של רשת תלת-ממדית. כדי להבטיח שהרשת תהיה רציפה בין משטחי המפרק והסחוס, על כל האלמנטים בגבול לחלוק צמתים משותפים. כדי להשיג זאת, יש להסיר את פני השטח הפנימיים של המפרק, כך שיישאר צינור חלול.השתמש במקש הפונקציה F2 כדי לגשת לקיצור הדרך של תפריט מחיקת אלמנטים (Delete Elements). בחר את האלמנטים למחיקה. התאם את צמתי הגבולה כך שיתאימו לפני השטח של הסחוס.השתמשו בשילוב של מקשי הפונקציה F2, F3 ו-F6 כדי למחוק, להזיז קשרי רשת (nodes) וליצור אלמנטים חדשים, בהתאמה. לבסוף, שכפלו את פני השטח של הסחוס במפרק באמצעות תפריט ארגון הרכיבים של ה-collector. השתמשו במקש הפונקציה F2 כדי למחוק את כל האלמנטים שאינם שייכים למפרק.לאחר מכן, בצעו בדיקות איכות על ידי מעבר לפאנל Check elements. בדקו אם קיימים אלמנטים כפולים, השחלות (insertions) וחדירות (penetrations) ברשת (mesh). במידה ונמצאו, ערכו אותם באמצעות לשונית Tools.בדקו את הזוויות הדיהדרליות באמצעות לשונית השירות (utility) הנמצאת באפשרויות עץ המודל. כדי להנפיק רשת תלת-ממדית מרשתות משטחים דו-ממדיות בעלות גדלי אלמנטים שונים, השתמשו בכלי ה-Tetramesh. השוו בין גדלי רשת שונים, ובחרו את מודל ה-FE בעל גודל הרשת הנמוך ביותר שמתכנס לאחר סימולציות נוספות, ואינו פוגע בהגדרת המאפיינים.בשלב הבא, השתמש בכלי המרחק (Distance tool) כדי לשנות את קנה המידה של הרשת (mesh) כך שדגם הלסת יהיה במقياس הנכון. ודא שמרכיבי הסחוס והמפרק מחוברים בדגם על ידי ייצוא של דגם ממוזג, או באמצעות קשרי קיבוע (ties). לאחר מכן, החל עומסים, אילוצים ותכונות חומר על מודל ה-FE כדי לסמלץ את תפקוד הלסת.השתמשו בסדרות תמונות הקונפוקליות המסומנות כמדריך להגדרת השרירים. ראשית, הקצו נקודות (nodes) התואמות לנקודות ההיצמדות של השריר. לאחר מכן, צרו וקטורים בין הנקודות המייצגים את נקודת המוצא וההחדרה של כל שריר.לאחר הגדרת כל השרירים, צור loadcollector של היסטוריה, והחל Cload על כל שריר. הגדר את העוצמה בניוטונים, והקצה את הווקטור המתאים. לאחר מכן, הקצה תכונות חומר איזוטרופיות אלסטיות מתאימות, כפי שנקבעו בספרות.בשלב הבא, צור loadcollector לגבולות, והחל מספר אילוצים ראשוניים על המודל. בחר את הצמתים להגבלה, ובחר מקדם דרגות-חופש (degrees-of-freedom) הדומה לטווח התנועה הטבעי של השריר המוגדר על ידי צמתים אלו. כעת, צור שלב העמסה (load step) עבור כל סוג תנועה שברצונך לסמלץ.בתפריט הניתוח (analysis), בחרו את כל העומסים והאילוצים הרלוונטיים כדי לסמלץ את התנועה המוגדרת. לאחר מכן, בחרו static מהתפריט הנפתח. כשסיימתם, ייצאו את המודל בפורמט קובץ מתאים, כולל הרשת (mesh), העומסים, האילוצים ותכונות החומר.במקרה זה, נבחר פורמט INP. לאחר מכן, טענו את המודל לתוכנת ניתוח ה-FE. שם, צרו והריצו תפקיד (job) עבור המודל, ונתחו את הפלט עבור מאמץ, מאמץ יחידה, העתקה וכדומה.בחר שלושה עד שישה זחלי דגי זברה טרנסגניים, והרדם אותם קלות באמצעות 0.02% MS-222 עד שיפסיקו להגיב למגע, אך ליבם עדיין ימשיך להכות. לאחר מכן, מקם את הזחלים במצב צדי על לוחות כיסוי בתוך 1% agarose בנקודת התכה נמוכה בטמפרטורה פושרת בתמיסת Danieau. לאחר מכן, הסר בזהירות בעזרת פינצטה את ה-agarose מהאזור שסביב הראש והלסת.לאחר מכן, בעזרת פיפט פסטור, שטפו תמיסת Danieau טרייה על ראש הזחל כדי להסיר את חומר ההרדמה. המשיכו בכך עד לחזרת תנועת הפה הרגילה. כעת, השתמשו בתוכנה ללכידת וידאו כדי להקליט סרטוני מהירות גבוהה פלואורסצנטיים של תנועות הפה.צלמו בקצב הפריימים הגבוה ביותר למשך הזמן הדרוש להקלטה של מספר מחזורי פתיחה של הלסת. לאחר מכן, נתחו את ההעתקה המקסימלית של הלסת. בחרו את הפריימים המראים את הלסת פתוחה ברוחבה המקסימלי, ומדדו את המרחק בין הקצה הקדמי של סחוס מקל (Meckel's cartilage) לבין הלסת העליונה.נקודת הלסת העליונה תואמת לקצה לוח האתמואיד. צביעה אימונוהיסטוכימית של שרירים וסחוס, או דימות של רפורטרים טרנסגניים, מאפשרים להimagen את המבנה התלת-ממדי של הלסת, יחד עם מערכת השרירים הנלווית. באמצעות דימות ברזולוציה גבוהה, ניתן היה לבנות מודל הלוכד את הצורה התלת-ממדית של הלסת.המודל משלב עומסים אשר מיקומם ועוצמתם נגזרו מתמונות קונפוקאליות של שריר וסחוס. על בסיס מודל זה, נבחנו סדרה של תכונות חומרים שונות. באמצעות שימוש בהעתקה (displacement) in vivo שנצפתה באמצעות לכידת וידאו במהירות גבוהה, נבחר מודל אחד המשחזר בצורה הטובה ביותר את טווח התנועה הזה.תוך שימוש בנתוני תכונות החומר, העומסים וצורת הרשת המדויקים ביותר, שימש מודל ה-FE לבחינת ההערכה המיטבית של הסביבה המכנית שחווה במהלך מסגרת זמן זו. לדוגמה, נמדדו עוצמות המאמץ. ניתן להגדיל את המודל כדי לראות את הפרטים הדקים של הדפוס, ולאחר מכן לבחון אותו בחתכים דיגיטליים כדי להבחין בפרטים בכל הממדים.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה באופן השימוש בדימוי קונפוקאלי לבניית מודל תלת-ממדי מדויק פיזיולוגית של מבנה ביולוגי הנמצא תחת עומס מכני. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור כי זהו מודל ליניארי ואלסטי, וסחוס אינו מתנהג כחומר ליניארי לחלוטין. ניתן לשלב תכונות חומר נוספות, כגון חדירות (permeability), אך הדבר עשוי לדרוש התאמות נוספות של הרשת (mesh).

building-finite-element-models-to-investigate-zebrafish-jaw

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

לסתי דג הזברה בינית הוא איבר חוש הכסות המכיל ectodermal, mesodermal ונגזרות הרכס העצבי. חשוב לציין, בינית מבוגר יכול להתחדש לאחר כריתה הפרוקסימלי. וידאו זה מציג לסתי פיתוח בינית ומדגים פרוטוקול כירורגי כדי לעורר התחדשות, ואחריו הדמיה, אוסף הטבעה במורד דגימות בינית.

שיטות מחקר של דג הזברה לסתי בינית

confocal הדמיה זמן לשגות היא טכניקה רבת עוצמה שימושית לאפיון התפתחות עוברית. כאן, אנו מתארים את המתודולוגיה ולאפיין המורפוגנזה craniofacial בסוג פראי, כמו גם PDGFRA, smad5, וSMO עוברים שעברו מוטציה.

ניתוח Craniofacial המורפוגנזה בדג הזברה שימוש 4D מיקרוסקופיה confocal

עובר דג הזברה הוא מודל מצוין למחקר בביולוגיה התפתחותית. במהלך עובר, דג הזברה מתפתחת עם מסת חלמון, אשר מציבה אתגרים תלת ממדים לתצפית מדגם וניתוח. פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור הכנות הר שטוחות דו ממדים של הר שלם באתרם דגימות (לוואי) מוכתמות דג הזברה עובר.

הר הכנה שטוחה לתצפית וניתוח של עובר דג הזברה דוגמאות ויטראז בהר שלם<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה

דג הזברה הוא מערכת מודל מצוינת למחקרים גנטיים והתפתחותיים. השתלת חרוזים היא טכניקה חשובה למניפולציה של רקמות שניתן להשתמש בה כדי לחקור מנגנוני התפתחות על ידי הכנסת שינויים בסביבות תאיות מקומיות. פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע השתלת מיקרו-חרוזים בעובר דג הזברה.

Microbead השרשה בעובר דג הזברה

המטרה של פרוטוקול זה היא לשנות את penetrance של פנוטיפים קטלני השלד מוטציה בדג זברה באמצעות ברירה מלאכותית. מוטציות קטלני זין לבגרות וגדלתי עצמם, לכן פרוטוקול זה מתאר שיטת מעקב ובחירה penetrance לאורך הדורות מרובים על-ידי רומא בדיקות.

הסטה דג זברה קטלני השלד Penetrance מוטציה על ידי רומא בדיקות

כאן נתאר 3 מודלים פציעה דג זברה מבוגרים, שלהם להשתמש בשילוב עם טיפול תרופות לדיכוי המערכת החיסונית. אנו מספקים הדרכה על הדמיה של התחדשות הרקמות ועל גילוי מינרליזציה עצם המצוי בו.

דג זברה בוגרת מודלים פציעה ללמוד את השפעות Prednisolone רגנרציה רקמת העצם

שינינו את מודל ירידה במשקל של מרמארו לדגי זברה בוגרים כדי לבחון רוחב של פתולוגיות בעקבות פגיעה מוחית טראומטית בוטה (TBI) והמנגנונים שבבסיס ההתחדשות העצבית שלאחר מכן. מודל TBI קהה זה הוא מדרגי, מעורר TBI מתון, בינוני או חמור, ומשיב הטרוגניות פציעה שנצפו ב- TBI האנושי.

מודל מדרגי לחקר ההשפעות של פגיעה בוטה בכוח בדגי זברה בוגרים

פרוטוקול זה מתאר את הקציר וההדמיה של קשקשים אלסמואידים של דגי זברה במהלך התחדשות in vivo . בנוסף, תרבות ex vivo של קשקשים אלה עד 7 ימים לאחר הקציר מוצג.

התחדשות סולם דגי זברה בתרבות הקשקשים של טוטו ואקס ויוו

פרוטוקול זה מציע שיטה לחקר דינמיקה תאית באמצעות טכניקה פשוטה של תרבית חוץ גופית . הוא מספק הזדמנות לחוקרי דגי זברה ולמחנכים לחקור תהליכים תאיים, כגון אלה הקשורים להומאוסטזיס עצם ולביולוגיה בסיסית של התא, על ידי הדמיה של גרעינים פלואורסצנטיים ותאים אפופטוטיים בתוך הקשקשים.

טכניקת תרבית חוץ גופית לחקר דינמיקה תאית בסקאלות דגי זברה

הפרוטוקול המתואר כאן מציג הליך פשוט וקל לביצוע לצביעה וניתוח סחוסי גולגולת פנים בזחל דג זברה בן 5 ימים. בעזרתו ניתן לחקור את האנטומיה, הצורה והגודל של מבנים אלה בתנאי התפתחות שונים.

דיסקציה של רקמות הגולגולת של דג הזברה לאחר צביעה בכחול אלציאני

עבודה זו מתארת פרוטוקול לכימות צורת הסחוס הקרניופציאלי באמצעות תוכנה חופשית (tpsDigs2, MorphoJ ו-PAST) למדידת שינויים במבנה הפנים של זחלי דגי זברה.

ניתוחים מורפומטריים של צורה: ארגז כלים לתוכנת ניתוח לכימות צורת קרניופנים בדגי זברה

חקור ניתוח אלמנטים סופיים לביומכניקת לסתות Danio rerio באמצעות מיקרוסקופיית קונפוקל ויצירת רשתות תלת־ממדיות. שיטה זו מאפשרת הדמיית סביבה מכנית וניתוח השפעת עומסים על התפתחות שלדית.

בניית מודלים אלמנטים סופיים לחקור ביומכניקה לסת דג הזברה

גלה סרטונים נוספים