ניתוח Spatiotemporal של אירועים Cytokinetic שמרים ביקוע

המטרה הכוללת של טכניקת מיקרוסקופיה זו של תאים חיים היא לחקור את האירועים המרחביים-זמניים המתרחשים במהלך ציטוקינזיס במערכת מודל שמרי הביקוע. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הציטוקינטי כגון הפרטים המולקולריים של השלבים השונים של הציטוקינזיס לאורך זמן. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לנתח רכיבים מרחביים שונים של המנגנון הציטוקינטי לאורך תקופות זמן ארוכות עם רעילות מינימלית לתאים.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי ציטוקינזיס ושמרי ביקוע, ניתן ליישם אותה גם על שמרים ניצנים ופטריות אחרות. כדי להתחיל בהליך זה, שפכו שלושה עד ארבעה מיליליטר של מדיה מומסת עם ויטמין C על צלחת תרבית עם תחתית זכוכית. לאחר שהמדיה התמצקה, השתמש באזמל חד כדי להרים בעדינות את לוח המדיה מכלי התרבית, והנח קצה פיפטה בין לוח המדיה לצלחת התרבית כדי למנוע מהלוח ליפול בחזרה לתוך הצלחת.

לאחר מכן טען שניים עד חמישה מיקרוליטרים של תרבית תאים תלויה מחדש בין לוח המדיה לתחתית הזכוכית של צלחת התרבית. לאחר מכן הסר בעדינות רבה את קצה הפיפטה והנח את לוח המדיה בחזרה למקומו המקורי על צלחת התרבות. דגרו את התאים בצלחת התרבות למשך 30 דקות עד שעה בחושך, בטמפרטורה בה תבוצע המיקרוסקופיה.

כאשר התאים מוכנים להדמיה, הניחו טיפת בר בצד החיצוני של הכוס על צלחת התרבית. הניחו את צלחת התרבות על מיקרוסקופ הפוך. התמקדו במישור המדיאלי של התאים, וודאו שהם מרווחים היטב ולא צפופים מדי.

הקפד להתחיל ברכישת תמונה של התאים בשלב מתאים של מחזור התא. בניסוי זה, זה מאוחר G2. לאחר מכן, תכנת את תוכנת רכישת התמונות. הגדר את זמן החשיפה עבור DIC ל-100 אלפיות השנייה.

עבור מסנני GFP ו-RFP, השתמש בזמני חשיפה של 75 אלפיות השנייה. הגדר את עוצמת הלייזר ל-50%אך שים לב שזה ישתנה בהתאם לניסוי האישי. כדי לצלם תמונות בתלת מימד, תכנת את התוכנה לרכוש סדרת Z.

שימוש בגודל צעד מרבי של 4 מיקרומטר ומרחק של 3.0 מיקרומטר סביב נקודת המיקוד המרכזית של התאים ללכידת 16 פריימים Z לנקודת זמן עבור מרחק Z כולל של 6 מיקרומטר. ניתן לשנות פרמטרים אלה בהתאם לעובי התא. הגדר את התוכנית לצלם תמונות כל שתי דקות.

בחר את זמן החשיפה בהתאם לדרישות הניסוי. בדוגמה זו, נעשה שימוש ב- 75 אלפיות השנייה. תכנת את התוכנה להפסיק את הרכישה לאחר 90 דקות.

ואז התחל ברכישת התמונה. תוכנת ImageJ משמשת לניתוח התמונה. כדי להתחיל, פתח את סדרת התמונות עבור כל אחד מאורכי הגל.

בחר תא למחקר. לחץ פעמיים על אפשרות הקו של סרגל הכלים כדי לפתוח חלון נוסף כדי להתאים את רוחב הקו. התאם את רוחב הקו כך שיתאים לרוחב התא שהוא כ- 40 עד 50 פיקסלים עבור תא מסוג פראי.

צייר קו לאורך הציר הארוך של התא המבוקש. לחץ על ניתוח ואז על כלים ואז על מנהל החזר ROI ולאחר מכן לחץ על הוסף. פעולה זו תוסיף את השורה שנבחרה לחלון ההחזר על ההשקעה לשימוש מאוחר יותר.

אל תסגור חלון זה. לחץ על התמונה המעניינת ולאחר מכן בחר ערוך, לאחר מכן בחר ולאחר מכן יישר. בדוק את כל הערימה של התהליך כדי ליישר את התא בצורה אופקית.

לחץ על התמונה ואז שנה ואז סובב 90 מעלות ימינה כדי ליישר את התמונה אנכית. לחץ על התמונה ואז ערם ואז צור מונטאז'. פעולה זו תפתח חלון להקצאת מספר השורות והעמודות עבור הערימה, גורם קנה המידה עבור גודל התמונה, הפרוסה או המסגרת הראשונה והאחרונה עבור המונטאז', ותוספת המסגרת עבור המונטאז'.

בדוק את פרוסות התווית ולחץ על Enter. כאשר מוצג חלון עם מונטאז' של התא המעניין, פתח את סדרת התמונות עבור אורך הגל השני. במנהל ההחזר על ההשקעה, לחץ על מזהה השורה כדי לבחור את אותו תא בקובץ התמונה השני.

חזור על השלבים הקודמים כדי לפתוח מונטאז' של התמונה השנייה. בתמונה עם סמן גוף מוט הציר, Sad1-mCherry, חפש את ההפרדה של סמן גוף מוט הציר, וסמן את נקודת הזמן הזו כזמן אפס. עקבו אחר האות של חלבון הטבעת Rlc1-tomato בתמונה לאורך זמן, וחפשו את האות שמופיע כקו מובהק בניגוד לכתמים של עגבנייה Rlc1.

נקודת זמן זו מסמנת את השלמת הרכבת טבעת האקטומיוזין או את תחילת שלב ההתבגרות. לאחר מכן, גלול בסרט לאורך זמן כדי לקבוע מתי טבעת העגבניות Rlc1 מתחילה לרדת בגודלה. זה מסומן כסוף שלב ההתבגרות או תחילת התכווצות הטבעת.

עקוב אחר אות עגבניות Rlc1 לאורך זמן לאורך כל ההתכווצות עד שהוא מופיע כנקודה באמצע ציר התא. זה מסומן כסוף התכווצות הטבעת או סוף חדירת המחיצה. לאחר המונטאז' של תמונות DIC, קבע מתי הושלם ההפסקה.

רשום את נקודת הזמן שבה התאים נפרדים פיזית. התחל את הניתוח הזה על ידי בחירת תא עם טבעת אקטומיוזין גלויה. לחץ פעמיים על אפשרות השורה של סרגל הכלים ImageJ.

התאם את רוחב הקו כך שיתאים לעובי הטבעת כ-15 עד 20 פיקסלים. צייר קו לאורך הטבעת, הקפד לוודא שכל עובי הטבעת כלול. לחץ על ניתוח, לאחר מכן כלים, לאחר מכן מנהל החזר ROI ולחץ על הוסף.

פעולה זו תוסיף את שורת הבחירה לחלון החזר ההשקעה לשימוש מאוחר יותר. אל תסגור חלון זה. לחץ על התמונה המעניינת ובחר ערוך, לאחר מכן בחר ואז יישר.

בדוק את כל הערימה כדי ליישר את הטבעת אופקית. אפסו את עוצמת המישור הבהיר ביותר בערימת Z באמצעות תמונה, לאחר מכן התאימו, לאחר מכן התאימו את הבהירות והניגודיות, ולאחר מכן אפסו. לחץ על הכרטיסייה SGK ולאחר מכן על פרויקט תלת מימד כדי לפתוח תיבת דו-שיח.

שנו את שיטת ההקרנה לנקודה הבהירה ביותר ואת ריווח הפרוסות לשניים עד שלושה פיקסלים. לבסוף, שנה את ציר הסיבוב לציר X או Y בהתאם לזווית הצפייה הרצויה. לחצו על 'אינטרפולציה' ולחצו על 'אשר' ליצירת הקרנה תלת-ממדית של התמונה.

השתמשו בפס הגלילה שמתחת לתמונה כדי לסובב את התמונה. לאחר מכן, פתח את סדרת התמונות עבור אורך הגל השני. לחץ על מזהה הקו במנהל ה-ROI כדי לבחור את אותה טבעת בקובץ התמונה השני.

חזור על השלבים הקודמים כדי לפתוח טבעת תלת-ממדית בתמונה עם אורך הגל השני. כאשר שתי טבעות התמונה התלת-ממדיות פתוחות, לחץ על התמונה, לאחר מכן צבע ולאחר מכן מזג ערוצים. בחר כל תמונה מהתפריט הנפתח עבור הצבע המתאים הרצוי ולחץ על אישור. השווה את הלוקליזציה של סמנים שונים ביחס ללוקליזציה בטבעת הציטוקינטית או בקרום החודר.

תאי שמרי ביקוע המתבטאים בסמן גוף קוטב הציר, Sad1-mCherry וסמן הטבעת Rlc1-GFP צולמו במהלך ציטוקינזיס. הפרדת גוף מוט הציר התרחשה ב-17 דקות, שנקבעו כזמן אפס. Rlc1-GFP מופיע באתר החלוקה ארבע דקות לפני הפרדת גוף מוט הציר.

לאחר הפרדת גוף מוט הציר, הבשלת הטבעת מתחילה בעשר דקות. התכווצות הטבעת מתחילה ב-31 דקות ומסתיימת ב-53 דקות. לבסוף, אבצסיון תאים מתרחש 80 דקות לאחר הפרדת גוף קוטב הציר.

ניתן לשרטט את ציר הזמן של אירועים ציטוקינטיים שנקבעו בתמונות הקודמות בגרף בהתייחס למיטוזה כפי שנקבע על ידי המרחק בין סמני גוף עמוד הציר. ניתוח של סמן הטבעת Rlc1-עגבנייה וסמן קרום המחיצה Bgs1-GFP באתר החלוקה לאורך הציטוקינזיס מגלה שהטבעת הורכבה לפני גיוס Bgs1-GFP. כאשר הטבעת מתכווצת, Bgs1-GFP מתמקם גם בקרום החודר הסמוך לטבעת המכווצת.

לבסוף, אות עגבניות Rlc1 מתפזר לאחר התכווצות הטבעת בעוד Bgs1-GFP מופיע כדיסק, ונשאר בתוך מחסום הממברנה. ניתן לקבוע את היעילות של אירועים ציטוקינטיים על ידי התפלגות החלבונים לאורך הטבעת. כאן התפלגות Cdc15-GFP לאורך הטבעת היא אחידה בתמונה השמאלית אך לא אחידה בתמונה הימנית.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעתיים-שלוש אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לבחור תאים עם שדה מתאים, המכילים באופן אידיאלי שישה עד שמונה תאים מרווחים היטב בסוף G2 או בשלב M מוקדם, ללא זיהומים נראים לעין באגר. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לנתח מרחבי-זמני לוקליזציה של חלבונים במהלך ציטוקינזיס.