יחיד תא RNA-Seq של קבוצות מוגדרות של תאים גנגליון רשתית

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד תאים בודדים בעלי תווית פלואורסצנטית מרשתית הר שלמה חיה. שיטה זו יכולה לסייע לענות על שאלות מפתח במדעי המוח. כגון כמה תת-סוגים של מחלקה עצבית מסוימת קיימים ומהם הסמנים הגנטיים לכל תת-סוג?

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנו מוותרים על הצורך בדיסוציאציה של רקמת הרשתית, מה שמאפשר לתאים לשרוד בסביבה בריאה יותר לפני הבידוד. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על כל אוכלוסיית תאים המסומנת פלואורסצנטית ולכן ניתן ליישם אותה על מערכות אחרות כדי להבין את המגוון התאי ותפקודו בבריאות ובחולי. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו, מכיוון שטכניקה זו מסתמכת על יכולתו של החוקר להדק תא מבלי לפגוע בכדאיות התא.

הדגמה עתידית של שיטה זו היא קריטית מכיוון ששלבי בידוד RNA עשויים להיות קשים ללמידה, מכיוון שהכמות הקטנה של RNA עלולה להתפרק בקלות אם לא מטפלים בה כראוי ובמהירות. כדי להתחיל בהליך זה, תקעו את הקרנית בעזרת מחט וחתכו אותה בגבול הקרנית והסקלרה. לאחר מכן, הסר את העדשה באמצעות מלקחיים.

עשה בעדינות קרע בסקלרה וחתוך את עצב הראייה במקום שבו הרשתית והסקלרה נפגשות. סיים בזהירות את הסרת הסקלרה מהרשתית. לאחר מכן, הסר את הזגוגית השקופה

פורסים את הרשתית לשניים ומאחסנים אותה בתמיסה החוץ-תאית המחומצנת בטמפרטורת החדר עד לשימוש. כאשר מוכנים להרכיב את הרקמה בתא ההקלטה, העבירו חתיכת רשתית לתמיסת האנזים, מדוללת ב-500 מיקרוליטר של תמיסה חוץ-תאית מחומצנת בצלחת פטרי, ודגרו אותה במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר על שייקר. לאחר מכן, שטפו את הרשתית בתמיסה החוץ-תאית המחומצנת והעבירו אותה לתא הקלטה בתחתית זכוכית עם פיפטת העברה מפלסטיק.

לאחר מכן, השתמש במלקחיים כדי לשטח בזהירות את הרקמה כששכבת קולטני האור פונה כלפי מטה. הסר עודפי נוזלים באמצעות פיפטה ועגן את הרקמה באמצעות טבעת פלטינה עם רשת ניילון. לאחר מכן, מלאו את החדר בתמיסה החוץ-תאית המחומצנת והרכיבו אותה על במת מיקרוסקופ.

חדרו את הרקמה בתמיסה החוץ-תאית המחומצנת במהירות של שניים עד ארבעה מיליליטר לדקה. כדי להתכונן להליך זה, דופק כמה מיקרופיפטות זכוכית להקלטות אלקטרופיזיולוגיות באמצעות מושך מיקרופיפטה. התבונן בשכבת תאי הגנגליון באמצעות אופטיקה IR-DIC.

לאחר מכן, זהה את תאי ה-GFP בתוספת גנגליון באמצעות אפיפלואורסצנציה בכ-480 ננומטר. לאחר מכן, אתר את הפיפטה המלאה בתמיסה תוך-תאית ב-DIC. הפעל לחץ חיובי קל ואפס כל קיזוזי מתח על המגבר.

לאחר מכן, הורד את המיקרו-פיפטה מזכוכית על תא חיובי GFP והחל שלבי פקודת מתח בדיקה כדי לנטר את התנגדות האיטום. הלחץ השלילי צריך ליצור חותם ג'יגה-אוהם בין הפיפטה לקרום התא. לאחר יצירת אטימה יציבה, קרע את הממברנה על ידי הפעלת פולסים קצרים של לחץ שלילי כדי להשיג גישה לתא שלם.

המתן דקה עד שתיים עד שהדנדריטים של התא יתמלאו בעוקב פלואורסצנטי. בשלב זה, חלץ בזהירות את התוכן הציטופלזמי של התא לתוך הפיפטה על ידי הפעלת לחץ שלילי עם מזרק של עשרה מיליליטר. בינתיים, עקוב אחר המיצוי ב-DIC על ידי הדמיה של גוף התא הולך ופוחת בגודלו.

לאחר חילוץ התוכן הציטופלזמי, הרם את הפיפטה בזהירות מהרקמה והסר במהירות את הפיפטה מהתמיסה. לאחר מכן, הסר במהירות את הפיפטה ממחזיק הבמה הראשית ושטוף את קצה הפיפטה לזמן קצר עם H2O שטופל ב-DEPC. לאחר מכן, חבר את הפיפטה למזרק מיליליטר אחד באמצעות הצינור ההדוק.

הוצא מיד את התאים לעשרה מיקרוליטרים של מאגר ליזה אחד בצינורות ה-PCR של 0.2 מיליליטר. צנטריפוגה קצרה את הצינורות בצנטריפוגה מיני על השולחן ב -2000 פעמים גרם למשך עשר שניות. לאחר מכן מיד להקפיא את הדגימות על קרח יבש למשך חמש דקות.

לאחר ההקפאה, אחסן אותם בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס עד שבועיים לקבלת התוצאות הטובות ביותר. כדי להתכונן להליך זה, הגדר התקן מפריד מגנטי על ידי הדבקת החלק העליון של מחזיק קצה P20 או P200 הפוך למעמד המגנטי של 96 בארות. לאחר מכן, הכינו אתנול טרי של 70% בערך מיליליטר לדגימה.

הסר את החרוזים המגנטיים של RNA מאחסון של 4 מעלות צלזיוס והפשיר אותם בטמפרטורת החדר. לאחר שחרוזי ה-RNA בטמפרטורת החדר, מערבל אותם למשך 30 שניות כדי להבטיח שהתמיסה מעורבבת היטב. לאחר מכן, הפשירו את התאים בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת.

לאחר מכן, הוסף חמישה מיקרוליטרים של H2O נטול Rnase לכל דגימה ופיפטה למעלה ולמטה. לאחר מכן, מוסיפים 22 מיקרוליטר חרוזי RNA לכל צינור ומערבבים היטב. דגרו את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות כדי לאפשר ל-RNA לקיים אינטראקציה ולהיקשר עם החרוזים המגנטיים.

לאחר מכן, הנח את הצינורות על מכשיר מפריד מגנטי למשך שמונה דקות. לפני שתמשיך, ודא שהסופרנטנט צלול. התבונן בחרוזים מפלטה אחת והקפד לא לנתק אותה מצד הצינור במהלך הפיפטינג.

הסר את הסופרנטנט מהדגימות והוסף 150 מיקרוליטר של 70% אתנול. לאחר מכן, הסר את האתנול וחזור על הכביסה פעמיים נוספות. הניחו לדגימות להתייבש באוויר במשך שש דקות.

בדוק לסירוגין אם נאסף יותר אתנול בתחתית הצינור והסר אותו בהתאם. זכור שזה קריטי לייבש את החרוזים כראוי. אם החרוזים אינם יבשים מספיק, אתנול עלול לעבור עם חומר הניקוי ויפחית את התשואות הכוללות, בעוד שחרוזים מיובשים יתר על המידה עלולים לגרום לאובדן RNA.

בזמן שהדגימות מתייבשות, הכינו מאגר תגובה פי 10 על ידי שילוב של 19 מיקרוליטר של מאגר ליזה שניים ומיקרוליטר אחד של מעכב Rnase. סובב אותו בקצרה ושמור אותו על קרח. לאחר שהדגימות יבשות וכדורי החרוזים כבר לא נראים מבריקים, הסר את הצינורות מהמפריד המגנטי והוסף 9.5 מיקרוליטר של H2O נטול Rnase כדי להחזיר את הדגימות.

לאחר מכן, הניחו את הדגימות על קרח והוסיפו מיקרוליטר אחד של מאגר תגובה פי 10 לכל דגימה. תמונה זו מציגה את שכבת תאי הגנגליון של הרשתית, המומחשת באמצעות IR-DIC בכל הכנת רשתית ההר. אותו תכשיר הודגם באפיפלואורסצנציה בכ-480 ננומטר כדי לזהות את תאי הגנגליון החיוביים ל-GFP.

תמונה זו מציגה תא חיובי GFP שהיה מיועד להקלטת מהדק טלאי ומלא בעוקב פלואורסצנטי. תמונה קונפוקלית של דנדריטים ipRGC המצולמים בתת-למינה לסירוגין של שכבת הפרספקס הפנימית מאפשרת סיווג של סוגי תאים אלה פלט ביו-אנלייזר זה מציג את הדוגמאות לספריות שעברו שעתוק הפוך, הגברה וטיהור. נתיבים 1 עד 3 מציגים מריחות DNA אידיאליות, בעוד שנתיב 4 מייצג דגימה מעובדת בצורה גרועה.

נתיב הבקרה צריך להכיל שתי פסגות נקיות בגדלים של 35 bp ו-10380 bp. להלן עקבות מפורטים של ספרייה אחת שהוכנה בהצלחה בעוצמה גבוהה בסביבות 2 קילו-בייט. עקבות אלה מדגימים גם הכנה מוצלחת, אך עם המריחה מרוכזת סביב 500 bp.

תמונה זו מציגה את פלט הביו-אנלייזר לאחר תיוג, הגברה וטיהור של הדגימות. ניתן לראות את העקבות המפורטים של דגימה שתויגה בהצלחה כאן, המתאימה לדגימה בנתיב הראשון. תיוג לא שלם יגרום לעקבות כמו זה שנראה כאן, המצדיק תיוג מחדש עם דילול חדש.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לבודד RNA מסוגי התאים המסומנים באופן פלואורסצנטי ברשתית השלמה. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי RNA רגיש מאוד לפירוק וכי תאי רשתית בריאים הם המפתח. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך יומיים אם היא מבוצעת כראוי.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו qPCR, הכלאה של NC2 או אימונוהיסטוכימיה, על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו האם גנים שזוהו הם ספציפיים לתת-סוג תאי נתון. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מדעי המוח, המנסים להבין הטרוגניות של נוירונים באזורי מוח שונים. הבנת ההטרוגניות הזו תאפשר מחקרים עתידיים של תפקוד תאים וקישוריות באוכלוסיות מזוהות מולקולרית.