Fat Body Organ Culture System in <em>Aedes Aegypti</em>, a Vector of Zika Virus

Hae-Na Chung; Stacy D. Rodriguez; Victoria K. Carpenter; Julia Vulcan; C. Donovan Bailey; Madhugiri Nageswara-Rao; Yiyi Li; Geoffrey M. Attardo; Immo A. Hansen

doi:10.3791/55508

תרבות הגוף השמן איברים במערכת Aedes Aegypti, וקטור של וירוס Zika

JoVE Journal
Biology
Author Produced

This content is Free Access.

JoVE Journal Biology

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

תרבות הגוף השמן איברים במערכת Aedes Aegypti, וקטור של וירוס Zika

Full Text

10,111 Views

06:18 min

August 19, 2017

DOI: 10.3791/55508-v

Hae-Na Chung¹, Stacy D. Rodriguez¹, Victoria K. Carpenter², Julia Vulcan¹, C. Donovan Bailey¹, Madhugiri Nageswara-Rao¹, Yiyi Li³, Geoffrey M. Attardo⁴, Immo A. Hansen^1,5

¹Department of Biology,New Mexico State University, ²Department of Molecular Genetics and Microbiology,Duke University, ³Department of Computer Sciences,New Mexico State University, ⁴Department of Epidemiology of Microbial Diseases,Yale School of Public Health, ⁵Institute of Applied Biosciences,New Mexico State University

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

The fat body is a crucial metabolic organ in insects, analogous to liver and fat tissues in vertebrates. This article presents a live organ culture system for studying the responses of isolated mosquito fat body tissue to various stimuli.

Key Study Components

Area of Science

Neuroscience
Metabolism
Insect Physiology

Background

The mosquito fat body is essential for metabolic processes.
It serves as the primary source of yolk proteins in mosquitoes.
This study focuses on the yellow fever mosquito, Aedes aegypti.
The fat body culture system allows for in-depth physiological studies.

Purpose of Study

To demonstrate an in vitro organ culture system for mosquito fat bodies.
To explore the regulation of yolk protein production.
To investigate nutrient uptake mechanisms in Aedes aegypti.

Methods Used

Preparation of solutions and reagents for fat body culture.
Dissection of mosquitoes to isolate fat bodies.
Transfer of isolated fat bodies to an amino acid-enriched medium.
Subsequent analyses including RNA-seq and gene expression studies.

Main Results

Identification of gene expression changes in response to stimulation.
Demonstration of yolk protein gene activation in cultured fat bodies.
Comparison of unstimulated and stimulated fat body samples.
Results indicate significant changes in gene expression levels.

Conclusions

The fat body culture system is effective for studying insect metabolism.
Stimulation with amino acids and ecdysone enhances yolk protein synthesis.
This method provides insights into metabolic regulation in mosquitoes.

Frequently Asked Questions

What is the fat body in mosquitoes?

The fat body is a metabolic organ in insects that functions similarly to the liver and fat tissues in vertebrates.

How is the fat body culture system set up?

The system involves preparing solutions, isolating fat bodies through dissection, and transferring them to a nutrient-rich medium.

What are the applications of this fat body culture system?

It can be used for studying yolk protein production, nutrient uptake, and various downstream analyses like RNA-seq.

What stimuli are used to activate fat body metabolism?

Amino acids and the insect steroid hormone 20-hydroxyecdysone are used to stimulate yolk protein synthesis.

What results were observed in the study?

Significant changes in gene expression were noted between unstimulated and stimulated fat body samples.

שומן הגוף הוא האיבר מטבולית במרכז בחרקים. אנו מציגים מערכת תרבות איברים חיים המאפשרת למשתמש ללמוד את התגובות של רקמות הגוף השמן מבודד לגירויים שונים.

שלום, שמי אימו הנסן, מהמעבדה לפיזיולוגיה וקטורית מולקולרית באוניברסיטת ניו מקסיקו. מערכת תרבית הגוף של שומן יתושים שנדגים היום היא מערכת תרבית איברים במבחנה בה אנו משתמשים במעבדה שלנו כדי לחקור פיזיולוגיה ומטבוליזם של רקמת גוף שומן חיה המחוברת לדפנות הגוף הבטניות של יתוש. גוף שומן חרקים הוא איבר בו מתרחשים תהליכים מטבוליים רבים.

תפקידיו משקפים את אלה של רקמות הכבד והשומן בבעלי חוליות. השתמשנו במערכת זו כדי לחקור את ויסות ייצור חלבון החלמון ואת מנגנוני ספיגת החומרים המזינים ביתוש הקדחת הצהובה, Aedis aegypti. Aedi aegypti הוא וקטור עיקרי של ארבו-וירוס כמו דנגי, צ'יקונגוניה וזיקה.

גוף השומן של היתושים הוא המקור היחיד לחלבוני חלמון ביתושים. פרוטוקול וידאו זה מדגים מערכת תרבית גוף של שומן יתושים במבחנה ומציג מספר יישומים ניסיוניים של המערכת. הפרוטוקול שנדגים מוגדר במספר חלקים.

ראשית, נכין את הפתרונות והריאגנטים הדרושים למערכת תרבית גוף השומן. שנית, נבצע נתיחות יתושים כדי לבודד גופי שומן. לאחר מכן, דבר אחרון, נעביר גופי שומן מבודדים למדיום מועשר בחומצות אמינו כדי להפעיל את סינתזת חלבון החלמון.

ישנם מספר יישומים במורד הזרם שניתן לבצע בעקבות תרבית גוף שומן. היום נבצע תרבית גוף שמנה ואחריה ריצוף של הדור הבא. נשווה שתי דגימות, דגימה לא מגורה עם דגימה אחת מגורה עם חומצות אמינו ואקדיזון.

חומרים וציוד נוספים שיידרשו כוללים שואב עם בקבוקון איסוף לאיסוף יתושים, כרית זבוב CO2 המחוברת לבקבוק גז CO2, אתנול לניקוי כרית הזבובים, מיקרוסקופ סטריאו עם מקור אור, מספריים מיקרו דיסקציה, פינצטה עדינה וצלחות באר 96. כדי להתכונן לתרבית גוף שומן, יש להכין שלוש תמיסות מלאי וריאגנטים, תמיסת מלאי אמינו, תמיסת מלאי מלח פיזיולוגית של Aedes ותמיסת מלאי סידן. תמיסת מלאי המלח הפיזיולוגית של Aedes ותמיסת מלאי הסידן משולבים כדי להפוך את מצע תרבית גוף השומן.

יתושים המשמשים לניסוי זה צריכים להיות בני שלושה ימים לפחות לאחר הופעתם. בעזרת שואב המופעל על ידי סוללה, אוספים את היתושים לבקבוקון איסוף. הנח את בקבוקון האיסוף עם הדגימה שלך על כרית CO2 כדי להרדים את היתושים.

לחלופין, ניתן להשתמש בקרח כדי להרדים את היתושים. השליכו את כל הזכרים לפני תחילת הנתיחות. ראשית, מקד את המיקרוסקופ המנתח באמצעות יתוש בדיקה כדי להבטיח נראות.

לאחר שמיקדתם את המיקרוסקופ, הניחו שקופית קעורה על המיקרוסקופ והניחו שתי טיפות של APS במרכז. ה-APS מסייע בשמירה על רמת היתוש ובאיסוף איברי יתושים שונים. בחר את היתוש בעזרת המלקחיים, ומרים את היתוש ברגליים.

הסר את הרגליים. תוך כדי החזקת היתוש בבית החזה ביד שמאל, השתמש במלקחיים האחרים כדי לתפוס את היתוש בשניים או שלושה החלקים האחרונים של הבטן ומשוך בעדינות כדי להסיר. פעולה זו אמורה להסיר את השחלות, צינוריות מלפיגיה, המעי האחורי, המעי האמצעי והיבול.

לאחר הסרת האיברים, השתמש במספריים הקפיציים כדי לסיים את דיסקציה של גוף השומן. הכניסו להב אחד לחור שנוצר מהסרת שניים-שלושה מקטעים אחרונים של הבטן וחתכו את הבטן לאורכה עד שתגיע לקטע שמתחת לבית החזה. לאחר החתך, הבטן צריכה להתרחב כלפי חוץ.

חתך נוסף נעשה לרוחב החלק העליון של הבטן במקום שבו הסתיים החתך הראשון. לאחר החתכים, הבטן נפתחת וצפה כשצד הציפורן כלפי מעלה וגופי השומן נחים בתוך ה-APS. לאחר שגופי השומן התייצבו על תמיסת ה-APS למשך חצי שעה לפחות, ניתן להעביר אותם למדיה של תרבית גוף השומן.

על מנת לעורר את גופי השומן להתחיל בביטוי גנים של חלבון חלמון, אנו מעבירים אותם למדיה עם רמות גבוהות של חומצות אמינו חופשיות והורמון הסטרואידים של החרקים, 20-הידרוקסיאקדיזון. לאחר ההעברה, גופי השומן מודגרים במשך שש שעות בתקשורת. לאחר תקופת הדגירה, גופי השומן מועברים לצינור אפנדורף עם חיץ המתאים לניתוחים הרצויים.

בהתאם למטרת הניסוי, ניתן להשתמש בגופי השומן במספר פרוטוקולים עוקבים כגון qPCR, כתמים מערביים, פרוטאומיקה, מטבולומיקה או RNA-seq. כדוגמה, ביצענו ניסוי בתרבית גוף שומן וגירינו גופי שומן מבודדים על ידי דגירה על תמיסה המכילה תערובת מאוזנת של כל 20 חומצות האמינו הטבעיות והורמון הסטרואידים של החרקים 20-הידרוקסיאקדיזון למשך שש שעות כאשר גופי שומן בקרה הודגרו על PS למשך פרק זמן זהה. איור זה מציג את התוצאות של ניתוח RNA-seq של הניסוי שלנו.

מפת החום מציינת רמות ביטוי גנים של 1256 גנים המתבטאים בגופי שומן מתורבתים בשני טיפולים שונים. כל הגנים הללו שינו באופן משמעותי את רמות הביטוי בין שני הטיפולים. טבלה זו מציגה את עשרת הגנים המווסתים ביותר לאחר הפעלה של גופי שומן מתורבתים עם חומצות אמינו ו-20-הידרוקסיאקדיזון.

כצפוי, רוב הגנים הללו הם גנים של חלבון חלמון. תודה על התעניינותך בתרבות הגוף של שומן יתושים.