מדידת G- חלבון מצמידים איתות באמצעות רדיו שכותרתו GTP מחייב

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד ממברנות תאיות המכילות קולטנים מצומדים לחלבון G או GPCRs ולחקור פרמקולוגיה של GPCR באמצעות חיבור מחייב GTP פונקציונלי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביוכימיה לגבי התכונות הפרמקולוגיות של קולטנים מבוססים או יתומים המצומדים לחלבון G. היתרונות העיקריים הם שהוא פשוט, מהיר ומודד את האירוע הפרוקסימלי ביותר באיתות קולטנים מצומדים לחלבון G.

ראשית, צלחת תאי כליה עובריים אנושיים על צלחת תרבית רקמה של 10 סנטימטר ב-10 מיליליטר של DMEM מלא. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני, עד שמגיעים למפגש של 70% עד 80%. לאחר הדגירה, יש להעביר את התאים עם HAMOR1 באמצעות מגיב טרנספקציה מתאים בהתאם להנחיות היצרן.

לאחר מכן, דגרו על התאים כפי שתואר קודם לכן למשך 36 עד 48 שעות. לאחר הוצאת התאים המועברים מהחממה, יש לשאוב את המדיום ולשטוף את התאים בחמישה מיליליטר PBS קר כקרח. לאחר מכן, שאפו את ה- PBS ועודפי הנוזלים מהצלחת.

לאחר מכן, הוסף 600 מיקרוליטר של מאגר 1 לתאים. בעזרת מגרד תאים, עקרו את התאים משטח הצלחת והכניסו את תרחיף התא לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה של 1.6 מיליליטר. הצמד מיד להקפיא את צינור המיקרו צנטריפוגה בחנקן נוזלי.

לאחר הקפאת הדגימה, הפשירו את הליזטים על קרח. לאחר שהליזטים הופשרו, השתמש בהומוגנייזר מיקרו-צינור דופק יחיד כדי לפתוח את התאים. פועם את ההומוגנייזר הזה שלוש עד חמש פעמים למשך 10 שניות.

הנח את הצינור על קרח למשך 30 שניות בין פולסים. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימה למשך 10 דקות בטמפרטורה של 1, 000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, העבירו את הסופרנטנט לצינור מיקרו צנטריפוגה חדש בנפח 1.6 מיליליטר על קרח.

השעו מחדש את החך ב-100 מיקרוליטר של מאגר 1. הומוגניזציה מחדש של הדגימה ודופק את ההומוגנייזר שלוש עד חמש פעמים למשך חמש שניות, והניח את הצינור על קרח למשך 30 שניות בין פולסים. לאחר צנטריפוגה של הדגימה בפעם השנייה, שלב את הסופרנטנטים והצנטריפוגה למשך 20 דקות ב-11,000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס.

העבירו את הסופרנטנט לצינור מיקרו צנטריפוגה חדש בנפח 1.6 מיליליטר. השעו מחדש 200 מיקרוליטר של מאגר 2. לאחר מכן, הפכו את החך להומוגניזציה על ידי טריטורציה שלו שלוש עד חמש פעמים.

לאחר צנטריפוגה של הדגימה ושאיבת הסופרנטנט, השעו מחדש את החך המכיל את סיעת הממברנה הגולמית ב-50 מיקרוליטר של מאגר 2. מלאי מדולל S35GTP gamma S ל-50 ננו-מולרי ו-10 מילי-מולרי עקבות HCl ו-10 מילי-מולרי DTT. הכינו 250 מיקרוליטר שעה לניסויי הכריכה, והקפאת בזק לאחסון אם תרצו.

לאחר מכן, הכינו מאגר קשירה מלא או CBB, על ידי השלמת מאגר קשירה לא שלם כך שיכלול ריכוז סופי של מילי-מולרי DTT אחד, 0.1% BSA, 10 מיקרו-מולרי GTP ו-0.1 ננו-מולרי S35GTP גמא S.לאחר הפשרת שבר הממברנה על קרח, יש לדלל אותו לריכוז של 100 מיקרוגרם למיליליטר ומאגר קשירה לא שלם. כדי לבחון את השפעת הפפטיד DAMGO על קשירת GTP באמצעות MOR1, הכינו סדרה של דילולי DAMGO ו-CBB לנפח סופי של 100 מיקרוליטר. כדי להעריך את כריכת GTP בזיליקום, הכינו צינור מיקרו צנטריפוגה בנפח 1.6 מיליליטר עם 100 מיקרוליטר CBB.

כדי להעריך קשירה לא ספציפית, הכינו צינור מיקרו צנטריפוגה בנפח 1.6 מיליליטר עם 99 מיקרוליטר CBB בתוספת מיקרוליטר אחד של שני מילי-מולרים לא רדיאליים המסומנים GTP gamma S.כעת, הוסיפו 100 מיקרוליטר מתמיסת הממברנה המדוללת לכל דגימה. דגרו את הדגימות למשך 30 דקות בחום של 25 מעלות צלזיוס במיקסר תרמי ב -300 סל"ד. משרים מראש מסנני סיבי זכוכית במים מזוקקים למשך 10 דקות.

לאחר הוצאת הדגימות מהמיקסר התרמו, סובב אותן בקצרה למשך חמש שניות כדי לאסוף כל דגימה בתחתית הצינור. לאחר מכן, הסר את המכסה של מנגנון סינון ואקום והנח את המסננים הספוגים מראש על יציאות הוואקום של המכשיר. אבטח מחדש את מכסה המכשיר ליצירת אטם ואקום והפעל את הוואקום.

פיפטה 195 מיקרוליטר מכל דגימה על המסננים. שטפו את המסננים שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של מאגר שטיפה קרה כקרח. הניחו חמישה בקבוקוני ספירת נצנוץ של מיליליטר במדף ספירה.

הוסף חמישה מיליליטר נוזל נצנוץ לכל בקבוקון. לאחר מכן, כבה את הוואקום והסר את המכסה של מנגנון סינון הוואקום. בעזרת פינצטה, הרם את המסננים מיציאות הוואקום של מנגנון הסינון והפיל כל מסנן לבקבוקון נצנוץ.

לאחר כיסוי כל בקבוקון בצורה מאובטחת, דגרו את הדגימות על שייקר מסלולי בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר מכן, הפעל את מונה הנצנוץ, תכנת את המונה למדידת פליטת איזוטופ גופרית 35 למשך חמש דקות לכל דגימה באמצעות תוכנית הנצנוץ הסטנדרטית הקשורה ולחץ על התחל כדי לקחת בחשבון. הפרדה עצמית, מפרידה בצורה נקייה בין חלבוני הממברנה לחלבון הגרעיני היסטון h2b והחלבון הציטופלזמי גליצרול כדי להסתיר שלושה פוספט דהידרוגנאז.

חלבונים מועשרים בשברים התת-תאיים שלהם. נציג של כתם פונסו מדגים עומס חלבון שווה בכל שבר. ניתן להניע פרמטרים פרמקולוגיים מרובים כדי לאפיין אינטראקציה של ליגנד GPCR באמצעות ניסויי קשירת GTP כגון EC50 ומקדם הגבעה.

אלה המגיבים לקשירת GTP ל-MOR1 לאחר טיפול ב-DAMGO מודגמים כאן. תרשים זה ממחיש את הפעילות האגוניסטית של DAMGO באנטגוניזם של נלוקסון על איתות חלבון G MOR1. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעתיים עד ארבע שעות, תלוי במספר תנאי הניסוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשתמש בריכוזי ליגנד GPCR לפחות חמישה סדרי גודל מעל ומתחת ל-EC50 הצפוי. בעקבות הליך זה, הערכת מולקולות הדומות מבחינה מבנית לליגנד המעניין שלך, יכולה לעזור להגדיר חלקים מבניים חשובים בליגנד המגדירים את פרופיל הליגנד של הקולטן. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סייעה בגילוי תרופות וסללה את הדרך לחוקרים לחקור היבטים מפורטים של איתות GPCR, כגון אגוניזם מוטה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד ממברנות תאיות ולמדוד תכונות פרמקולוגיות של GPCRs באמצעות GTP עם תווית רדיו. אל תשכח, שעבודה עם קרינה יכולה להיות מסוכנת ביותר. יש לנקוט באמצעי זהירות, כגון לבישת ציוד מגן אישי מתאים ועבודה עם לבוש מעבדה מתאים לקרינה.

יש לבחון את ההנחיות המוסדיות לעבודה עם רדיואקטיביות לפני ביצוע הליך זה.