Name: ניתוח היסטולוגית של פגיעה חריפה בכבד אלכוהול דג הזברה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: למדו ניתוח היסטולוגי של פגיעה חריפה בכבד אלכוהול בזברה דגים באמצעות טיפול באתנול 2% למשך 24 שעות. שיטה זו מאפשרת הערכת סטאטוזיס כבדי ונפיחות כלי דם כבדיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לד&quot;ר קייטי מוריי במרכז המשאבים הבינלאומי של דג הזברה; ד&quot;ר סטייסי הופרט וקארי הופרט ב CCHMC, על עצות מועילות שלהם על הפרוטוקול; ו CCHMC שירות וטרינרי, עבור טיפול דגים. עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH R00AA020514 ומענק מחקר מהמרכז לגנום ילדים ב CCHMC (ל- CY). זה היה גם תמיכה בחלקו על ידי מענק NIH P30 DK078392 (אינטגרטיבית מורפולוגיה Core) של מרכז העיכול מחקר מרכז הליבה בסינסינטי.

<ol><li>Yoon, Y. H., Chen, C. M., Yi, H. Y. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYoon%2C+YH+%22Surveillance+report+%23100%3A+Liver+cirrhosis+mortality+in+the+United+States%3A+National%2C+State%2C+and+regional+trends%22">Surveillance report #100: Liver cirrhosis mortality in the United States: National, State, and regional trends</a>. , National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism. Bethesda, MD. 2000-2011 (2014).</li>
<li>Singal, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+frequency+and+outcomes+of+liver+transplantation+based+on+etiology+of+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Evolving frequency and outcomes of liver transplantation based on etiology of liver disease.</a> Transplantation. 95 (5), 755-760 (2013).</li>
<li>Louvet, A., Mathurin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcoholic+liver+disease%3A+mechanisms+of+injury+and+targeted+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Alcoholic liver disease: mechanisms of injury and targeted treatment.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 12 (4), 231-242 (2015).</li>
<li>Ki, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-22+treatment+ameliorates+alcoholic+liver+injury+in+a+murine+model+of+chronic-binge+ethanol+feeding%3A+role+of+signal+transducer+and+activator+of+transcription+3%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Interleukin-22 treatment ameliorates alcoholic liver injury in a murine model of chronic-binge ethanol feeding: role of signal transducer and activator of transcription 3.</a> Hepatology. 52 (4), 1291-1300 (2010).</li>
<li>Tsuchiya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstrain+differences+in+liver+injury+and+one-carbon+metabolism+in+alcohol-fed+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Interstrain differences in liver injury and one-carbon metabolism in alcohol-fed mice.</a> Hepatology. 56 (1), 130-139 (2012).</li>
<li>Koteish, A., Yang, S., Lin, H., Huang, X., Diehl, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+ethanol+exposure+potentiates+lipopolysaccharide+liver+injury+despite+inhibiting+Jun+N-terminal+kinase+and+caspase+3+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Chronic ethanol exposure potentiates lipopolysaccharide liver injury despite inhibiting Jun N-terminal kinase and caspase 3 activation.</a> J Biol Chem. 277 (15), 13037-13044 (2002).</li>
<li>Leo, M. A., Lieber, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+fibrosis+after+long-term+administration+of+ethanol+and+moderate+vitamin+A+supplementation+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatic fibrosis after long-term administration of ethanol and moderate vitamin A supplementation in the rat.</a> Hepatology. 3 (1), 1-11 (1983).</li>
<li>Tsukamoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+and+progressive+steatosis+and+focal+necrosis+in+rat+liver+induced+by+continuous+intragastric+infusion+of+ethanol+and+low+fat+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Severe and progressive steatosis and focal necrosis in rat liver induced by continuous intragastric infusion of ethanol and low fat diet.</a> Hepatology. 5 (2), 224-232 (1985).</li>
<li>Tsukamoto, H., Mkrtchyan, H., Dynnyk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intragastric+ethanol+infusion+model+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Intragastric ethanol infusion model in rodents.</a> Methods Mol Biol. 447, 33-48 (2008).</li>
<li>Howarth, D. L., Passeri, M., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drinks+like+a+fish%3A+using+zebrafish+to+understand+alcoholic+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin+Exp+Res%22%5BJournal%5D)">Drinks like a fish: using zebrafish to understand alcoholic liver disease.</a> Alcohol Clin Exp Res. 35 (5), 826-829 (2011).</li>
<li>Howarth, D. L., Yin, C., Yeh, K., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+hepatic+dysfunction+parameters+in+two+models+of+fatty+liver+disease+in+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Defining hepatic dysfunction parameters in two models of fatty liver disease in zebrafish larvae.</a> Zebrafish. 10 (2), 199-210 (2013).</li>
<li>Lin, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+Animal+Model+for+Alcoholic+Liver+Disease+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Development of an Animal Model for Alcoholic Liver Disease in Zebrafish.</a> Zebrafish. , (2015).</li>
<li>Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+steatosis+in+response+to+acute+alcohol+exposure+in+zebrafish+requires+sterol+regulatory+element+binding+protein+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation.</a> Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).</li>
<li>Tsedensodnom, O., Vacaru, A. M., Howarth, D. L., Yin, C., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+metabolism+and+oxidative+stress+are+required+for+unfolded+protein+response+activation+and+steatosis+in+zebrafish+with+alcoholic+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Ethanol metabolism and oxidative stress are required for unfolded protein response activation and steatosis in zebrafish with alcoholic liver disease.</a> Dis Model Mech. 6 (5), 1213-1226 (2013).</li>
<li>Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3407311/">The bHLH transcription factor Hand2 marks hepatic stellate cells in zebrafish: Analysis of stellate cell entry into the developing liver.</a> Hepatology. , (2012).</li>
<li>Lassen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning%2C+baculovirus+expression%2C+and+tissue+distribution+of+the+zebrafish+aldehyde+dehydrogenase+2%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab+Dispos%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning, baculovirus expression, and tissue distribution of the zebrafish aldehyde dehydrogenase 2.</a> Drug Metab Dispos. 33 (5), 649-656 (2005).</li>
<li>Reimers, M. J., Hahn, M. E., Tanguay, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+zebrafish+alcohol+dehydrogenases+share+common+ancestry+with+mammalian+class+I%2C+II%2C+IV%2C+and+V+alcohol+dehydrogenase+genes+but+have+distinct+functional+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Two zebrafish alcohol dehydrogenases share common ancestry with mammalian class I, II, IV, and V alcohol dehydrogenase genes but have distinct functional characteristics.</a> J Biol Chem. 279 (37), 38303-38312 (2004).</li>
<li>Zhang, C., Ellis, J. L., Yin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+vascular+endothelial+growth+factor+signaling+facilitates+liver+repair+from+acute+ethanol-induced+injury+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Inhibition of vascular endothelial growth factor signaling facilitates liver repair from acute ethanol-induced injury in zebrafish.</a> Dis Model Mech. , (2016).</li>
<li>Vonghia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+alcohol+intoxication%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">Acute alcohol intoxication.</a> Eur J Intern Med. 19 (8), 561-567 (2008).</li>
<li>Wittekind, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traditional+staining+for+routine+diagnostic+pathology+including+the+role+of+tannic+acid.+1.+Value+and+limitations+of+the+hematoxylin-eosin+stain%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech+Histochem%22%5BJournal%5D)">Traditional staining for routine diagnostic pathology including the role of tannic acid. 1. Value and limitations of the hematoxylin-eosin stain.</a> Biotech Histochem. 78 (5), 261-270 (2003).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+Rerio%29%22">The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio)</a>. , University of Oregon Press. (2007).</li>
<li>Theise, N. D. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/cld.172/full">Histopathology of alcoholic liver disease.</a> Clinical Liver Disease. 2 (2), (2013).</li>
<li>Lorent, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Jagged-mediated+Notch+signaling+disrupts+zebrafish+biliary+development+and+generates+multi-organ+defects+compatible+with+an+Alagille+syndrome+phenocopy%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Jagged-mediated Notch signaling disrupts zebrafish biliary development and generates multi-organ defects compatible with an Alagille syndrome phenocopy.</a> Development. 131 (22), 5753-5766 (2004).</li>
<li>Huang, M., Xu, J., Shin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+Ethanol-induced+Fibrotic+Liver+Model+in+Zebrafish+to+Study+Progenitor+Cell-mediated+Hepatocyte+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration.</a> J Vis Exp. (111), (2016).</li>
<li>Paredes, J. F., Lopez-Olmeda, J. F., Martinez, F. J., Sanchez-Vazquez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Daily+rhythms+of+lipid+metabolic+gene+expression+in+zebra+fish+liver%3A+Response+to+light%2Fdark+and+feeding+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22Chronobiol+Int%22%5BJournal%5D)">Daily rhythms of lipid metabolic gene expression in zebra fish liver: Response to light/dark and feeding cycles.</a> Chronobiol Int. 32 (10), 1438-1448 (2015).</li>
<li>Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+isolation+of+PCR-ready+genomic+DNA+from+zebrafish+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues.</a> Biotechniques. 43 (5), 610-614 (2007).</li>
<li>van der Velden, Y. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serine-threonine+kinase+LKB1+is+essential+for+survival+under+energetic+stress+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The serine-threonine kinase LKB1 is essential for survival under energetic stress in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (11), 4358-4363 (2011).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הליך מפורט לטיפול אתנול חריף זחלי דג הזברה ואת ניתוחים histopathological שלאחר מכן עם מכתים H &amp; E. טיפול אתנול חריף צריך להתבצע לא לפני 96 שעות לאחר ההפריה, שכן זהו השלב שבו הכבד דג הזברה מתחיל להביע אנזימים מטבוליזם אלכוהול 13 . 2% אתנול הוא המינון המקסימלי כי הזחלים יכולים לסבול 13 , 14 . הזחלים שטופלו באתנול מתחילים להראות סטאטוזיס בכבד ב -8 שעות של טיפול, ואחוזי הזחלים ...

מחלת כבד אלכוהולית (ALD), הנגרמת על ידי צריכת יתר של אלכוהול, היא הגורם העיקרי לתחלואה ותמותה הקשורים לאלכוהול. בארצות הברית, כמעט מחצית ממקרי המוות של מחלת כבד כרוכים באלכוהול 1 , ו- ALD אחראי על כמעט 1 מתוך 3 השתלות כבד 2 . ALD יש ספקטרום רחב. סטאטוזיס, אשר מאופיין על ידי הצטברות שומנים עודף hepatocytes, מתרחשת בשלב מוקדם של שתייה כבדה והוא הפיך עם הפסקת השימוש באלכוהול. תחת ההשפעה של גורמים גנטיים וסביבתיים צריכת אלכוהול מתמשך, סטאטוזיס כבד יכול להתקדם הפטיטיס אלכוהוליים, ובסופו של דבר, שחמת הכבד 3 . מחקרים באמצעות מודלים מכרסמים ALD סיפקו תובנות משמעותיות למחלה, אבל יש להם מגבלות (נבדק בהתייחסות 3 ). הזנה אוראלית של דיאטה אלכוהול גורם רק סטאטוזיס במכרסמים 4 , &lt;/ Sup&gt; 5 . התפתחות של דלקת ו fibrosis דורש גם העלבון השני 6 , 7 או עירוי intragastric כרונית, אשר פולשנית מבחינה טכנית מאתגר 8 , 9 . דג הזברה Telost גם מפתחת פגיעה בכבד בתגובה לטיפול כרוני ו חריף אלכוהול 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 . בפרט, דג הזברה הזחל מייצג אורגניזם מודל משלים מושך שבו ללמוד פגיעה חריפה בכבד אלכוהול 10 , 11 , 13 , 15 . הכבד דג הזברה הוא פונקציונלי מייצר אנזימים מפתח עבור מטבוליזם אתנול על ידי 4 ימיםשל הפריה (dpf) 13 , 16 , 17. אתנול ניתן להוסיף ישירות למים, וחשיפה לאתנול 2% במשך 24 שעות מספיקה כדי לגרום סטאטוז בכבד ותגובות fibrogenic בזחלים דג הזברה 13 , 15 . זה כבר דווח כי הטיפול עם אתנול 2% במשך 24 שעות הביאה ריכוז אתנול רקמות של 80 מ&quot;מ זחלים דג הזברה 13 . אחרים הראו כי הזחלים לסבול ריכוז זה פנוטיפים הכבד לראות את החיות המטופלים ספציפיים לחשיפה אתנול 11 , 13 , 15 , 18 . עם זאת, בגלל 80 מ&quot;מ הוא כמעט קטלני בבני אדם 19 , חשוב להעריך את היסטולוגיה הכבד של דג הזברה שטופלו אתנול ו deteRmine הרלוונטיות הפיזיולוגית לבני אדם. התפתחות חיצונית מהירה שקיפות של הזחלים דג הזברה מאפשרים לאפיין את הפעולה של אלכוהול בתוך הכבד בזמן אמת דגימות קבוע. הזמינות של תאים מסוג ספציפי קווי ניאון מהונדס ההתקדמות האחרונות מיקרוסקופיה confocal להקל על המחקר של כמה סוגים שונים של תאים בכבד לשנות את המורפולוגיה שלהם והתנהגות בתגובה לטיפול אתנול חריפה 11 , 15 . עם זאת, הדמיה confocal של דג הזברה מהונדס פלואורסצנטי לא יכול להחליף לחלוטין Hematoxylin ו Eosin (H &amp; E) מכתים בעת לימוד היסטולוגיה הכבד. סימון כל סוגי תאי הכבד באותו זמן באמצעות דג הזברה מהונדס דורש את הדור של קווים מהונדס הפרט, כל תיוג אחד סוג תא הכבד עם fluorophore ייחודי. הצגת רקע מהונדס שונה לתוך אותו דג דורש breedinG דורות מרובים, וזה זמן רב ויקר. מכתים immunofluorescence נוספים יש צורך לזהות רכיבים מטריקס תאיים. H &amp; E מכתים, לעומת זאת, בו זמנית תוויות כל סוגי תאי הכבד ורכיבים מטריקס תאיים, ובכך לספק סקירה של הכבד 20 . יתר על כן, הוא מגלה בקלות כמה תכונות histopathological של מחלות כבד, כגון מוות hepatocyte, סטאטוזיס, ו פיברוזיס. למרות H &amp; E הוא כתם שגרתית היסטולוגיה כבד יונקים, זה לא נפוץ במחקר כבד דג הזברה, והפרוטוקול הוא הקים פחות טוב. עבודה זו מתארת ​​פרוטוקול לטיפול אתנול חריפה הזחלים דג הזברה עבור מעקב אחר היסטולוגית עם מכתים H &amp; E מכתים. פרוטוקול H &amp; E מכתים ניתן להשתמש בכל המחקרים של התפתחות הכבד ואת הפונקציה. יתר על כן, חלקים פרפין יכול לשמש אימונוהיסטוכימיה, כמו גם עבור sta מיוחד אחרIn פתולוגיה של הכבד, כולל כתם trichrome, כתם reticulin, וכו &#39; .

<table><tbody><tr><td>צינורות צנטריפוגה 1.5 מ"ל</td><td>E & K Scientific</td><td>280150</td><td></td></tr><tr><td>צינורות חרוטיים 15 מ"ל</td><td>VWR International</td><td>89039-664</td><td></td></tr><tr><td>צינורות חרוטיים 50 מ"ל</td><td>VWR International</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>95% אתנול (EtOH)</td> <td>Decon Labs, Inc.</td><td>2801</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית</td> דליקה <td>אספקת מצטרף חדש</td><td>10010A</td><td>מגרה</td></tr><tr><td>אגרוז</td><td>מוצרי מחקר בינלאומיים</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק מתלה צנצנת אלומיניום</td><td>אספקת מצטרף חדש</td><td>5300JRK</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי בקטריולוגיות עם מכסה</td><td>רפידות ביופסיה 351029</td><td></td><td></td>קורנינג</tr><tr><td></td><td>Simport</td><td>M476.1</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות טעונות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-550-16</td><td></td></tr><tr><td>אמצעי הרכבה ברורים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>8310-16</td><td>ניתן להחליף באמצעי הרכבה שקופים אחרים</td></tr><tr><td>מלחי ים מסחריים</td><td>Instant Ocean</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>להבי מיקרוטום חד פעמיים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>4280L</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ ניתוח</td><td>Leica Biosystems</td><td>Leica Mz 95</td><td></td></tr><tr><td>מעבד רקמות סגור</td><td>Leica Biosystems</td><td>ASP300 S</td><td></td></tr><tr><td>Eosin-Phloxine סט כתמים</td><td>Newcomer Supply</td><td>1082A</td><td></td></tr><tr><td>אלכוהול אתילי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פורמלדהיד דליקה, מגיב ACS, 37 WT. % ב-H20, מכיל 10 - 15% מתנול כמייצב (למניעת פילמור)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>252549</td><td>חשוד כמסרטן;</td></tr><tr><td>פורמלין מגרה, חוצץ, 10%</td> <td>Fisher Scientific</td><td>SF100-4</td><td>חשוד כמסרטן;</td></tr><tr><td>מגרה בקבוק מדיה מדורג</td><td>VWR International</td><td>16159-520</td><td></td></tr><tr><td>Harris hematoxylin</td><td>Poly Scientific R& D Corp.</td><td>s212</td><td></td></tr><tr><td>תבניות היסטולוגיה</td> מגרה <td>סאקורה פינטק ארה"ב בע"מ</td><td>4557</td><td></td></tr><tr><td>פלטה חמה/בוחש</td><td>VWR בינלאומי</td><td>47751-148</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית (HCl)</td> <td>פישר סיינטיפיק</td><td>A144</td><td></td></tr><tr><td>חממה</td> מגרה <td>VWR International</td><td>97058-220</td><td></td></tr><tr><td>מזרקי אינסולין</td><td>BD רפואי</td><td>BD-309301</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ תרכובת הפוכה</td><td>קרל זייס מיקרוסקופיה</td><td>491912-9850-000</td><td></td></tr><tr><td>איזופרופנול</td><td>אספקת עולה חדשה</td><td>12094E</td><td></td></tr><tr><td>דליק מתילן כחול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M9140</td><td>מיקרוטום מגרה</td></tr><tr><td></td><td>Leica Biosystems</td><td>Leica Jung BioCut 2035&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>מערבל אגוזים</td><td>VWR International</td><td>82007-202</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-1KG</td><td>חשוד כמסרטן;</td></tr><tr><td>מגרה Pasteur pipet</td><td>VWR International</td><td>53283-916</td><td></td></tr><tr><td>משאבת פיפטה (10 מ"ל)</td><td>VWR International</td><td>53502-233</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט, מונו-בסיסי (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>סכיני גילוח</td><td>Grainger</td><td>4A807</td><td></td></tr><tr><td>ערכת צביעת שקופיות</td><td>אספקת מצטרף חדש</td><td>5300KIT</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד (NaOH)</td><td>פישר BioReagents</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט מסוכן מאוד, דו-בסיסי (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>מסננת נירוסטה (קוטר 5 אינץ')</td><td>כלי מדע אדפטיביים</td><td>L0906045in</td><td></td></tr><tr><td>קלטות רקמות</td><td>Simport</td><td>M505.12</td><td></td></tr><tr><td>מרכז הטמעת רקמות</td><td>Sakura Finetek USA Inc</td><td>#5100</td><td></td></tr><tr><td>מגבי רקמות, 1 שכבות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>06666A</td><td></td></tr><tr><td>צנרת העברה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>137117M</td><td></td></tr><tr><td>אבקת טריקאין/אתיל 3-אמינובנזואט מלח מתאן סולפונאט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A5040</td> בסיס <td>טריס מגרה</td></tr><tr><td>, תקן ראשוני ומאגר</td><td>בקבוק כביסה Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr>, <tr><td>בצפיפות נמוכה פוליאתילן, פה רחב</td><td>Nalge Nunc International</td><td>2402-0750</td><td></td></tr><tr><td>Xylenes</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3S-4</td><td>מגרה</td></tr></tbody></table>

ניתוח היסטולוגית של פגיעה חריפה בכבד אלכוהול דג הזברה

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

מחלת כבד אלכוהולית (ALD) מתייחסת לנזק לכבד עקב שימוש חריף או חריף באלכוהול. זה בין הגורמים המובילים של תחלואה ותמותה הקשורים אלכוהול, משפיע על יותר מ -2 מיליון אנשים בארצות הברית. הבנה טובה יותר של המנגנונים הסלולר והמולקולריים העומדים מאחורי פגיעה בכבד הנגרמת על ידי אלכוהול היא הכרחית לפיתוח טיפול יעיל ל- ALD. זחלי דג הזברה התערוכה סטאטוזיס כבד ו fibrogenesis רק לאחר 24 שעות של חשיפה לאתנול 2%, מה שהופך אותם שימושי עבור מחקר של פגיעה חריפה בכבד אלכוהול. עבודה זו מתארת ​​את ההליך לטיפול באתנול חריף בזחלי דג הזברה, ומראה כי היא גורמת להתפתחות סטטוזה ונפיחות של כלי הדם הכבד. פרוטוקול מפורט עבור Hematoxylin ו Eosin (H &amp; E) מכתים כי הוא מותאם לניתוח היסטולוגית של כבד הזחל דג הזברה, מתואר גם. מכתים H &amp; E יש יתרונות ייחודיים מסוימים על ידי immunofluorescence, כפי שהוא מסמן את כל החייםתאים er ותאים תאיים בו זמנית והוא יכול בקלות לזהות פגיעה בכבד, כגון סטאטוזיס ו פיברוזיס. לאור השימוש הגובר של דג הזברה בדגימת רעלן הנגיף הנגרמת על ידי וירוס, כמו גם מחלות כבד בירושה, פרוטוקול זה משמש כנקודת התייחסות לניתוח היסטולוגית שבוצעה בכל המחקרים הללו.

10% שנאגרו פורמלין ו paraformaldehyde 4% (PFA) הם שניים של fixatives הנפוצים ביותר המשמשים פרקטיקות היסטולוגיה. עם זאת, הם לא נותנים תוצאות קיבעון אופטימלי עבור דג הזברה דג הזברה ( איור 1 ו 1 טבלה ). קיבוע עם פורמולין 10% או 4% PFA לעיתים קרובות התוצאות התכווצויות, יצירת פערים גדולים בין הכבד לבין הרקמות הסובבות ( איור 1A , B , איור 1B...

פרוטוקול זה מתאר ניתוח היסטולוגית של הכבד מן הזחלים דג הזברה כי טופלו באתנול 2% עבור 24 שעות. טיפול כזה אתנול חריפה התוצאות סטאטוזיס כבד נפיחות של כלי הדם הכבד.

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

המטרה הכללית של ניסוי זה היא להעריך את הפתו-היסטולוגיה של כבד זחלי דגי הזברה (zebrafish) כתוצאה מחשיפה חריפה לאתנול. שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בתחום של מחלות כבד אלכוהוליות, כגון המאפיינים ההיסטולוגיים של פגיעת כבד חריפה מאלכוהול, ובאיזו מידה התגובות של כבד דג הזברה לפגיעה חריפה מאלכוהול דומות לאלו הנראות בבני אדם. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שטיפול האתנול שלנו משרה תגובות חזקות יותר מאשר שיטות אחרות שפורסמו.בנוסף, פרוטוקול ההיסטולוגיה שלנו משפר את שלמות הרקמה בחתכים. התחילו בבחירה של עד 40 זחלים, 96 שעות לאחר ההפריה, בעלי שלפוחיות ציפה מנופחות, באמצעות פפט פסטור. חלקו אותם באופן שווה לשתי צלחות פטרי חדשות.הסיר כמה שיותר ממי הביצים שנותרו, ולאחר מכן הוסף לצלחת אחת מי ביצים המכילים 2% ethanol בצפיפות של זחל אחד למיליליטר. הוסף את אותה כמות של מי ביצים ללא ethanol לצלחת השנייה שתשמש כביקורת. השהה את זחלי הביקורת ואת הזחלים שעברו טיפול ב-ethanol בחדר הדגים למשך 24 שעות.לאחר שחלפו 24 שעות, אספו את הזחלים לשפופרת צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר, עם לא יותר מ-20 זחלים לשפופרת. בעת העבודה במכסה הכימית, הסירו מהזחלים כמה שיותר נוזל, ולאחר מכן הוסיפו לפחות מיליליטר אחד של מעכב Dietrich's fixative. הניחו לדגים לעבור קיבוע במיקסר נער (nutator) בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות לפחות.הכינו את קסטות הרקמה ושתי רפידות ביופסיה כחולות לכל קסתה. הניחו רפידת ביופסיה אחת בתחתית של כל קסתה. סמנו כל קסתה בעיפרון באופן המזהה בבירור את הדגימה.בזמן העבודה במנדף, הוצאו את המקבע מהמבחנות, ושטפו את הזחלילים שלוש פעמים למשך חמש דקות בכל פעם עם 1 mL של PBS. הניחו את המבחנות על נערור (nutator) בטמפרטורת החדר במהלך השטיפה. במהלך השטיפות, חממו 3% agarose במים באמצעות מיקרוגל כדי להמיס את המוצק.חממו במקטעים של 30 שניות, ועקבו בדריכות כדי למזער רתיחה. לאחר ההמסה, הניחו את האגרוז הנוזלי על פלטה מחממת המכוונת ל-90 degrees Celsius עם ערבוב עדין. בעזרת פיפט העברה, העבירו עד שמונה זחלים לתבנית היסטולוגית מפלסטיק, והסִירו כמה שיותר PBS.בעזרת פפטת העברה שקצה שלה גזוז, מלאו את התבנית לחלוטין באגרוז 3%, לאחר מכן השתמשו במזרק אינסולין כדי לרכז את הזחלים למרכז התבנית, ודחפו אותם לתחתית. עבור חתכים סגיטליים, סדרו את הזחלים בקו כאשר ראשיהם פונים לחלק העליון של התבנית. כדי להבטיח שהכבדים יהיו מכוונים באופן עקבי, סובבו את הזחלים כך שהצד השמאלי של הגוף פונה כלפי מטה, ומונח בצורה שטוחה על תחתית התבנית.לאחר המתנה של ארבע עד חמש דקות להת굳דות האגרוז, הוצא את גוש האגרוז מהתבנית, והשתמש בסכין גילוח כדי לקלף את האגרוז מסביב לזחלים. העמד את הגוש על צדו, וחתך את העובי בחצי כך שהגוש הסופי יהיה בעובי של כ-2 עד 3 מילימטרים. העבר את גוש האגרוז הקטן לקסטת רקמה מוכנה, והנח את פד הביופסיה השני על גבי הגוש.סגרו את הקסטה, והניחו את הקסטה המורכבת במלואה בתוך מיכל הניתן לאטימה עם 70% ethanol שהוכן במים מזוקקים פעמיים. לאחר הטמעת הרקמה בפאראפין, השתמשו במיקרוטום כדי להסיר את עודפי הפאראפין המכסים את הרקמה על ידי חיתוך של חמישה מיקרון בכל פעם עד שהרקמה נחשפת על פני בלוק הפאראפין, ואז הפסיקו והשליכו את כל הפרוסות שגולחו. השרו את הבלוקים עם הפנים כלפי מטה ב-PBS, והניחו אותם בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך לילה.ביום למחרת, הוצאו בלוק אחד בכל פעם מה-PBS, וחתכו חתכים בעובי של חמישה מיקרון באמצעות מיקרוטום. הפרידו את סרט החתכים מהלהב על ידי משיכה עדינה של החתך האחרון מהלהב באמצעות פינצטה או מברשת. השתמשו בפינצטה כדי להרים את הסרט מהחתך האחרון, והעבירו אותו לאמבט מים בטמפרטורה של 42 degrees Celsius.אפשרו לסרטים לצוף על פני המים למשך חמש דקות לפחות. השתמשו בפינצטה כדי להפריד מקטעים לקבוצות קטנות יותר שיתאימו להנחה על העששויות. הכניסו עששייה טעונה למים בזווית של 45 מעלות, ומקמו אותה בזהירות מתחת לקבוצת המקטעים שברצונכם לאסוף.הרם בזהירות את השקופית מהמים, ואפשר לחתכים להיצמד לשקופית. ספוג שאריות מים מהחתכים באמצעות נייר סופג ללא סיבים. הנח את השקופית במחזיק שקופיות או בקופסה.המשיכו לחתוך את הבלוק עד לאסוף את הרקמה הרצויה. בסיום, ייבשו את השקופיות באינקובטור או בתנור בטמפרטורה של 55 degrees Celsius למשך שלוש עד 16 שעות כדי להמיס את הפרפין. לאחר הזמן שהוקצב, בדקו שהפרפין הומס, והמתינו לקירור השקופיות לפני הצביעה.בצעו דפראפיניזציה לשקופיות על ידי טבילה ב-100% xylene פעמיים למשך 15 דקות בכל פעם, ולאחר מכן בצעו רהידרטציה לשקופיות באמצעות גרדיאנט של אתנול. עבור כל תמיסה, טבלו את השקופיות שמונה עד 10 פעמים למשך שתי שניות לכל טבילה, עד שהנוזל נשפך מהשקופיות בצורה נקייה. הניחו את השקופיות ב-100% filtered Harris Hematoxylin למשך ארבע דקות.לאחר ארבע דקות, העבירו אותם במהירות בחזרה למכל המים דה-יוניים. זרימו מים דה-יוניים לפינה האחורית של המכל, הרחוקה ביותר מהחתכים. רוקנו את המכל מעת לעת עד שהמים לא יהיו עוד בצבע סגול.בדקו במהירות את עוצמת צביעת ה-Hematoxylin תחת מיקרוסקופ דיסקטורי באמצעות תאורת גוז-צוואר. החזירו את הפלטים ל-100% Hematoxylin למשך דקה אחת אם נדרשת צביעה נוספת. ברגע שהושגה צביעת ה-Hematoxylin הרצויה, טבלו את הפלטים פעמיים ב-0.05% חומצה כלורית (hydrochloric acid), ולאחר מכן העבירו אותם מיד חזרה למכל עם מים דה-יוניים נקיים.רוקנו ומלאו מחדש את המיכל במים פעמיים. העבירו את השקופיות לשני מיכלים המכילים 95% ethanol למשך 30 שניות בכל פעם. הניחו את השקופיות בתמיסת Eosin Y-Phloxine B למשך שתי דקות.לאחר שתי דקות, העבירו את השקופיות בחזרה למכל ה-95% ethanol הקודם, ולאחר מכן בדקו את עוצמת הצבע תחת מיקרוסקופ דיסקטינג. אם הצביעה אינה מספקת, החזירו את השקופיות לתמיסת ה-Eosin למשך 30 שניות. חזרו על הפעולה במידת הצורך.לאחר השגת עוצמת הצביעה הרצויה, העבירו את השקופיות ל-100% isopropanol למשך 15 שניות. החליפו ב-100% isopropanol רענן, והניחו את השקופיות שוב ב-isopropanol למשך 15 שניות נוספות. חזרו על תהליך זה עד להשלמה של שישה שטיפות ב-isopropanol.לאחר טבילה ב-100% xylene למשך שלוש דקות, הוציאו שקף אחד. הוסיפו כמות מספקת של חומר עיגון (mounting medium) כדי לכסות את החתכים, ולאחר מכן טבלו את השקף ב-100% xylene. הניחו זכוכית כיסוי על השקף, וספגו כל עודף של חומר עיגון בעזרת נייר סופג עד שייראה קו דק בלבד, לאחר מכן טבלו טישיו ב-xylene ונגבו את גב השקף כדי להסיר שאריות של חומר עיגון שנטף.הנח את השקופית בצורה שטוחה על משטח יציב אך נייד, כגון פיסת קרטון, ואפשר ל-xylene להתאדות בתוך המנדף למשך 10 דקות. השאר את השקופיות בטמפרטורת החדר למשך לילה כדי לאפשר למצע ההרכבה להתקשות לפני הדמיה. כבד של זחלי דג זברא 120 שעות לאחר הפירה זה הוטבל ב-Dietrich's fixative בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות.מעצב דיטריך (Dietrich's fixative) מספק את הקיבוע האופטימלי לרקמה זו. בקיבוע בפורמלין 10%, ההפטוציטים מאבדים לעיתים קרובות את הציטופלזמה שלהם. הרקמה אינה נצבעת כראוי ב-Eosin, ונראית סגולה.לאחר קיבוע ב-4% PFA, ניתן לראות רווחים בין ההפטוציטים. 4% PFA גורם לרקמת הכבד להתכווץ, ולכן נראה כי קיים רווח גדול בין הכבד לרקמות הסובבות אותו. הקו המקווקו מסמן את גבול הרקמות הסובבות.תמונה זו בהגדלה גבוהה יותר מציגה צביעת H&E של הכבד בזחלי ביקורת לא מטופלים מסוג wild-type, שהיו חלק ממחקר טיפול באתנול. שוב, בעל חיים זה קובע באמצעות המקבע של Dietrich ב-120 שעות לאחר ההפריה. תמונה זו מראה את השפעת הטיפול ב-2% ethanol בין השעה 96 ל-120 לאחר ההפריה על הכבד.טיפול זה באתנול במינון חריף גורם לסטאטוזיס של הכבד ולהרחבה של כלי הדם. החיצים מצביעים על הפטוציטים עם שקיעה מרובה של טיפות עגולות, והכוכביות מסמנות את כלי הדם הכבדיים המורחבים. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לבצע את הטיפול באתנול במתקן לדגים עם מחזור אור-חושך.עבור צביעת H&E, השתמשו במקבע של Dietrich (Dietrich's fixative) למשמרTissue אופטימלי. כמו כן, זכרו לבדוק את עוצמת הצבע בתדירות גבוהה כדי למנוע צביעה יתר או תת-צביעה.

histological-analyses-of-acute-alcoholic-liver-injury-in-zebrafish

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

כדי להבין את המנגנונים המולקולריים של אתנול הנזק הנגרמת התפתחותית, פיתחנו מודל של דג הזברה חשיפה אתנול בוחנים את פיזיים, שינויים הסלולר, וגנטיים המתרחשות לאחר החשיפה...

הערכת שינויים teratogenic במודל דג הזברה של חשיפה אלכוהול עוברית

כדי לעזור להעריך את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס התחדשות הכבד המונעת על ידי דג הזברה, הקמנו מודל פגיעה בכבד שבו הפטוציטים המבטאים ניטרורודוקטאז מבוטלים גנטית בטיפול במטרונידזול.  בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד לתמרן במיומנות, לנטר ולנתח אבלציה של הפטוציטים והתחדשות כבד מונעת מרה.

אבלציה Hepatocyte הספציפי בדג הזברה לחקר התחדשות כבד מונע מרה

פיברוזיס מתמשך עם שקיעה של חלבוני מטריצה חוץ-תאיים מוגזמים מוביל לשחמת. שימוש לרעה באלכוהול הוא אחד הגורמים העיקריים למחלת כבד קשה. הקמנו מודל כבד פיברוטי המושרה על ידי אתנול כדי לחקור את המנגנונים והאסטרטגיות לקידום התחדשות הפטוציטים בעת פציעה הנגרמת על ידי אלכוהול.

פיתוח מודל כבד אתנול-induced fibrotic דג הזברה ללמוד ובתאים בתיווך תא התחדשות Hepatocyte

כאן אנו להפגין שיטה לכמת את גודל הכבד בזחל zebrafish, מתן דרך להעריך את ההשפעות של מניפולציות גנטיות ופרמקולוגית על גידול בכבד ופיתוח.

בדיקת גודל הכבד בזחל זברה באמצעות מיקרוסקופ ברייטפילד

עבודה זו מתארת פרוטוקול לכמת רמות האתנול בעובר דג זברה באמצעות כרומטוגרפיה הראש שטח גז משיטות חשיפה נכונה לעיבוד העובר ניתוח אתנול.

קוונפיקציה של רמות האתנול של עוברי דגים באמצעות כרומטוגרפיה גז החלל הראשי

פרוטוקול זה מתאר את ההליך להסרת האונה הגחונית של הכבד בדגי זברה בוגרים כדי לאפשר את המחקר של התחדשות הכבד.

כריתת הפטקטומיה חלקית בדגי זברה למבוגרים

במאמר זה אנו מציגים כיצד ליצור מודל של דגי זברה הקשורים למחלת כבד שומני שאינו אלכוהולי (NAFLD) כדי לחקור את ההשפעה של עודף כולסטרול על המיקרו-סביבה של הכבד ועל הנוף של תאי מערכת החיסון.

ניתוח של מיקרו-סביבה של הכבד במהלך התקדמות מוקדמת של קרצינומה הפטוצלולרית שאינה אלכוהולית הקשורה למחלת הכבד השומני בדגי זברה

מטרת הפרוטוקול הנוכחי היא להתוות את הצעדים הדרושים כדי לבסס ולהשתמש במבחן העדפה חברתית עבור דג זברה בוגר ולהוכיח שניתן להשתמש בו כדי לאפיין פגמים חברתיים הנגרמים על ידי אתנול.

מידול הפרעות בספקטרום האלכוהול העוברי בדגי הזברה כדי לאפיין את ההשפעה של סביבה עוברית שלילית על התנהגות חברתית של מבוגרים

כאן אנו מציגים שיטה אמינה לחקר התחדשות כליות במבוגרים על ידי גרימת פגיעה כלייתית חריפה על ידי הזרקת גנטמיצין. אנו מראים כי הפציעה תלויה במינון הגנטמיצין ובטמפרטורת הסביבה באמצעות הכלאה באתרה כדי לתייג lhx1a+ מפתח נפרונים חדשים.

התחדשות בכליות למבוגרי דג הזברה על ידי גנטמיצין מושרה פגיעה

מאמר זה מתאר שיטה ליצירת פגיעה מכנית בכלי דם בעוברי דג זברה. מודל פציעה זה מספק פלטפורמה לחקר המוסטזיס, דלקת הקשורה לפציעה וריפוי פצעים באורגניזם המתאים באופן אידיאלי למיקרוסקופיה בזמן אמת.

פגיעה כלי מכאנית בעוברי דג הזברה

למדו ניתוח היסטולוגי של פגיעה חריפה בכבד אלכוהול בזברה דגים באמצעות טיפול באתנול 2% למשך 24 שעות. שיטה זו מאפשרת הערכת סטאטוזיס כבדי ונפיחות כלי דם כבדיים.

ניתוח היסטולוגית של פגיעה חריפה בכבד אלכוהול דג הזברה

גלה סרטונים נוספים