ב Situ Immunofluorescent מכתים של autophagy בתאי גזע שריר

Autophagy פעיל קשורה התחדשות שריר פרודוקטיבי, אשר חיוני עבור תא גזע שריר (MuSC) ההפעלה. כאן, אנו מספקים פרוטוקול לזיהוי באתרה של LC3, סמן autophagy ב MyocS חיובי Myocs של קטעים רקמות שריר מן שליטה ועכברים שנפגעו.

המטרה הכוללת של פרוטוקול צביעה אימונופלואורסצנטי זה היא לנטר את התהליך האוטופאגי בתאי לוויין שריר במהלך התחדשות שרירי השלד. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום התחדשות הרקמות לגבי הבנת התרומה של אוטופגיה בגזירת התחדשות שרירים וניטור אוטופגיה בתאי לוויין. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לזהות את התהליך האוטופאגי ישירות בתאי לוויין בחתך רקמה משרירים לא מופרעים ופגועים.

מי שידגים את ההליך הזה יהיה פרנצ'סקו קסטנטי, סטודנט נהדר מהמעבדה שלי. כדי לגרום לפגיעה חריפה בשרירי השלד, טען מזרק אינסולין, המצויד במחט בגודל 30, עם 20 מיקרוליטר של מלאי קרדיוטוקסין 10 מיקרו-מולארי מסונן. להזריק את הקרדיוטוקסין ישירות לשריר הטיביאליס הקדמי השמאלי של מספר שווה של זכרים ונקבות בני חודשיים, כ-20 גרם, C57 שישה עכברים שחורים.

כדי להעריך את השטף האוטופגי, החל מ-24 שעות לאחר הפציעה, יש לתת 50 מיליגרם לק"ג כלורוקווין כל 24 שעות במשך ארבעה ימים על ידי הזרקה תוך צפקית. הטיפול בכלורוקווין הוא קריטי מכיוון שהוא מוביל להצטברות LC3 ויכולת זיהוי בתנאי שטף אוטופאגי פעיל. חמישה ימים לאחר הפציעה, הרטיבו את בעלי החיים באתנול 70%.

והשתמש במספריים כדי לבצע חתך מאונך של שלושה מילימטר בעור הגב של העכבר בגובה הירך. משוך את העור לכיוון הזנב כדי לחשוף את השרירים הבסיסיים. ולזהות את שריר השוקה הקדמי.

השתמש במלקחיים כדי לתפוס את שריר השוקה הקדמי על ידי הגיד. ומשוך בזהירות את השריר כלפי מעלה לכיוון הברך. לאחר מכן משוך את שני הגידים הדיסטליים בכיוונים מנוגדים כדי להפריד את שריר השוקה הקדמי משריר ה-extensor digitorum longus ולחתוך את הגיד הפרוקסימלי.

השתמש במלקחיים כדי להסיר את הפאשיה הדקה המכסה את השריר, תוך הקפדה לא לפגוע ברקמה. והשתמש במגבת נייר כדי להסיר עודף לחות מהדגימה. הנח את השריר הכרות במרכז תבנית רקמה, המכילה תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית.

והשתמש במלקחיים מקוררים מראש כדי להוריד בזהירות את התבנית לאיזופנטן צונן חנקן נוזלי למשך 20 עד 30 שניות. לאחר מכן אחסן את הדגימה הקפואה בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס. לאחר לילה אחד לפחות בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס, הגדר את הקריוסטט בין שלילי 15 למינוס 23 מעלות צלזיוס והשתמש בטיפה של תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית כדי לחבר את דגימת השריר לצ'אק הקריוסטט כאשר עיקר הרקמה מכוון בחלק העליון של הצ'אק.

לאחר מכן השג חלקים בעובי שבעה עד שמונה מיקרומטר, ואסוף שלוש עד ארבע פרוסות רקמה בכל שקופית. לאחר רכישת כל החתך, יש לייבש באוויר את דגימות הרקמה למשך 10 עד 15 דקות, ולאחר מכן צביעת המטוקסילין ואאוזין. בדוק את איכות החלקים במיקרוסקופ אופטי בהגדלה של פי 10.

ותקן את הדגימות עם 4% פרפורמלדהיד בתא דגירה. לאחר 10 דקות, הסר את הקיבוע בארבע שטיפות של חמש עד שבע דקות ב-PBS. לאחר מכן השתמש בעט הידרופובי כדי לצייר מחסום סביב חלקי הרקמה.

וכסו את החלק ב-200 מיקרוליטר של מתנול שלילי של 20 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות דגירה ב-20 מעלות צלזיוס שליליות. חדירות מתנול היא קריטית מכיוון שהיא מאפשרת שמירה טובה על צביעת LC3. לאחר מכן, שטפו את הקטע ארבע פעמים ב-PBS כפי שהודגם זה עתה.

ולחסום את דגימות הרקמה עם שבר IGG FAB מטוהר נגד עכבר לא מצומד למשך 60 דקות לפחות בטמפרטורת החדר. בתום הדגירה, דגרו את הדגימות ב-100 מיקרוליטר של תערובת נוגדנים ראשונית בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת בבוקר, שטפו את השקופיות עם אלבומין סרום בקר 1% ב-PBS ארבע פעמים למשך 10 דקות בכל שטיפה.

לאחר מכן דגרו את הדגימות עם קוקטייל הנוגדנים המשני המתאים למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר מוגנת מפני אור. בתום הדגירה המשנית של הנוגדנים, שטפו את השקופיות ארבע פעמים ב-PBS למשך חמש עד שבע דקות לכל שטיפה. לאחר מכן תיוג עם קוקטייל הנוגדנים העיקרי השני למשך שעה עד שעתיים בטמפרטורת החדר מוגן מאור.

שטפו את החלקים ב-1% BSA ו-PBS ארבע פעמים. לאחר מכן דגירה בנוגדנים השני המתאים למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר מוגנת מאור. לאחר מכן שטפו את הדגימות ב-PBS וסמנו את הרקמות ב-200 מיקרוליטר DAPI לכל שקופית למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר מוגנת מאור.

לאחר סט אחרון של שטיפות PBS, הסר את עודפי ה-PBS מהשקופיות והוסף 10 מיקרוליטר גליצרול ב-PBS למרכז כל שקופית. מכסים כל שקופית בכיסוי, תוך הקפדה על הימנעות מבועות. בחר את האובייקט 63X במיקרוסקופ לייזר קונפוקלי בעל ארבעה לייזר המשולב עם מערכת לכידת תמונות ותוכנה אנליטית.

מרכז את שדות ההתחדשות הפעילה בשקופית הראשונה כדי לאפשר מיקוד ידני של אזורי ההתחדשות. לאחר מכן אתר את תאי לוויין השריר החיוביים של myoD הממוקמים בתוך הלמינין המסומן myofibers. ולהשיג תמונות בשבעה שדות לפחות משלושה עכברים לפחות בכל קבוצת ניסוי.

צביעת H ו-E מגלה שבעוד ששרירים לא מופרעים הציגו בדרך כלל גדלי מיופייבר בלתי משתנים, שרירים פגועים הציגו בדרך כלל סיבי שריר משובשים השונים בגודלם ונמצאים בשפע בחדירה דלקתית. יתר על כן, הגרעין המרכזי של סיבי השריר, שנעדר בשרירים לא מופרעים, הוא סימן להיווצרות סיבים חדשים בעכברים העוברים התחדשות פעילה. תאי לוויין שריר חיוביים ל-MyoD מבטאים LC3 וצביעה של למינין מאפשרת לוקליזציה נכונה של תאי שריר בנישה שמתחת ללמינה הבסיסית.

בעוד שעכברים לא פצועים אינם מדגימים הפעלת תאי לוויין שריר כפי שמעיד היעדר תאים חיוביים ל-myoD ואות LC3. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך יומיים אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור תמיד לשמור על לחות חלקי הרקמות.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחקר תחום התחדשות הרקמות כדי לחקור את התהליך האוטופאגי במהלך התחדשות שרירי שלד רגילה ופרלוגית בעכברים ובביופסיות אנושיות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לזהות LC3 בתאי לוויין במהלך התחדשות השרירים.