אין ויוו הדמיה של עכברים כתב Cx3cr1^gfp/gfp עם תחומים הספקטרום טומוגרפיה אופטית קוהרנטית, סריקת לייזר Ophthalmoscopy

פרוטוקול זה מתאר איך ברזולוציה גבוהה טכניקות הדמיה כגון טומוגרפיה אופטית קוהרנטית בתחום ספקטרלי, סריקת לייזר ophthalmoscopy יכול להיות מנוצל מכרסמים קטנים, באמצעות מערכת פלטפורמה אופטלמולוגיות הדמיה, כדי לקבל מידע על עובי רשתית, microglial תא הפצה, בהתאמה.

המטרות הכוללות של הליך זה הן להשתמש בטומוגרפיה קוהרנטית אופטית בתחום הספקטרלי ואופטלמוסקופיה לייזר סורקת כדי לקבל מידע על עובי הרשתית והתפלגות תאי המיקרוגליה, בהתאמה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום רפואת העיניים הניסויית לגבי המתאם בין חריגות ברשתית והצטברות תאי מיקרוגליה. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שניתן לקבל מידע זה בזמן אמת בצורה לא פולשנית.

לאחר אישור חוסר תגובה לספוגית הקרנית, הנח את העכבר במצב שכיבה בצד שמאל של הפלטפורמה, כאשר המסלול הימני פונה לעדשה. מרחו טיפה של הידרוקסיפרופיל מתיל צלולוז בעדשת מגע קשיחה וחדירה לגז פלוס ארבע דיופטר על עין ימין והתחילו את מודול הרכישה. עבור סריקות B, בחר באפשרות טומוגרפיה של אינפרא אדום וקוהרנטיות אופטית תחת יישום ומבנה, בחר רשתית והשתמש במיקרו-מניפולטור כדי להזיז את העדשה לכיוון עין העכבר.

לפני ההתמקדות ברשתית, ודא שמחוון דקסטר האוקולוס נבחר, ולאחר מכן השתמש בכפתור המיקוד כדי להתקרב לתוך הרשתית עד שכלי הדם הגדולים נראים בבירור בתמונת הפונדוס בצד שמאל של מסך הצג. השתמש במיקרו-מניפולטור כדי להתאים את מיקום המצלמה, לפי הצורך, סובב את כפתור הרגישות כדי להפחית או להגביר את הבהירות של תמונת הפונדוס, לפי הצורך. בחר את סריקת הקו מתפריט תבנית והשתמש במיקרו-מניפולטור כדי להזיז את סריקת B בין הפינות העליונות והתחתונות של טומוגרפיית הקוהרנטיות האופטית של תחום הספקטרלי, או חלון הסריקה SD-OCT.

הגדר את הערך זמן אמת אוטומטי לתשע לפחות כדי לקבל איכות תמונה גבוהה ולחץ על Acquire. לאחר קבלת כל התמונות, העבירו את עדשת המגע מהעין לתמיסת מלח מאוזנת טרייה והרטבו את הקרנית בטיפה טרייה של הידרוקסיפרופיל מתיל צלולוז. לאחר צילום העין השמאלית, סובב את האופטיקה הסטנדרטית של 30 מעלות נגד כיוון השעון כדי להסיר אותה והרכיב את עדשת ה-55 מעלות לסבב הדמיה שני.

כדי להעריך את הקרינה האוטומטית, מבלי להזיז את העכבר, בחר אינפרא אדום בלוח הבקרה והתמקד בכלי הרשתית הגדולים. בחר הדמיה פלואורסצנטית אוטומטית והשתמש בכפתור הרגישות כדי לכוונן את בהירות התמונה, לפי הצורך. לחץ פעם אחת על כפתור הרגישות והגדר את הערך האוטומטי בזמן אמת ל-67 לפחות.

כאשר הושג הערך האוטומטי בזמן אמת, רכוש את התמונה ולחץ על כפתור הרגישות פעם שנייה כדי לעצור את הממוצע. התאימו את המיקוד כדי להמחיש את שכבות הרשתית השונות, בהתאם לניסוי. לאחר שכל התמונות הושגו, המשיכו לעדשת שדה רחב של 102 מעלות על האופטיקה ודמו את הקרינה האוטומטית בכל עין, כפי שהודגם זה עתה.

כדי למדוד את עובי הרשתית הידני בכל תמונה, לחץ פעמיים על השם בחיית הניסוי הראשונה לפתיחת סריקת ה-OCT. פתח סריקת B שהתקבלה עם עדשת 30 או 55 מעלות ובחר את פרופיל העובי. לחצו על הסמל Edit Layer Segmentations.

התוכנה תזהה אוטומטית את הממברנות הפנימיות והבסיסיות. כדי לתקן ידנית את מיקום הממברנות, בחר את השכבה שיש לשנות, כמו גם את אפשרות העיגול האדום. החזק את לחצן העכבר לחוץ, הזז את העיגול כדי לשנות את הקו עד שהשכבה המתאימה תמוקם כראוי ולחץ על שמור וסגור כדי לצאת מהחלון.

תחת שכבה אופציה, בחר רשתית ולחץ על מיקום אחר בדיאגרמה כדי להציג את עובי הרשתית עבור המיקום שנבחר. לאחר מכן מדוד את עובי הרשתית ואת המרחק הרצוי מראש עצב הראייה וייצא את הערכים לגיליון אלקטרוני. בסריקות בודדות SD-OCT מייצגות אלה מעכבר הומוזיגוטי לביטוי של gfp תחת מקדם Cx3cr1, ארכיטקטורת הרשתית מוצגת בבירור הן בתמונות העדשה של 30 מעלות והן בתמונות העדשה של 55 מעלות.

עם זאת, רפלקטיביות גבוהה של הכורואיד נצפית בסריקות המתקבלות עם עדשת 30 מעלות. בעקבות SD-OCT, סריקת אופטלמוסקופיה בלייזר מאפשרת הדמיה של תאי מיקרוגליה חיוביים gfp בודדים ברשתית באמצעות עדשה של 55 מעלות או 102 מעלות עם כיסוי שטח פונדוס גדול יותר המתקבל עם עדשת 102 מעלות. בסריקות SD-OCT, לאחר תיקון ידני של גבולות הרשתית המגבילים הפנימיים וקרום הבסיס, נצפה בדרך כלל מתאם טוב של מדידת עובי הרשתית בין עדשות 30 ל-55 מעלות כאשר נמדד אותו מרחק מראש עצב הראייה.

לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך פחות מחמישים דקות אם היא מבוצעת כראוי. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום רפואת העיניים הניסיונית לחקור פתולוגיה של הרשתית במכרסמים קטנים in vivo.