Assay Phagocytosis עבור תאים אפופטוטיים ב תסיסנית עוברים

אנו כאן לתאר assay phagocytosis באמצעות תאים עובריים מפוזרים של תסיסנית . זה מאפשר לנו בקלות ובמדויק לכמת רמות phagocytosis vivo , וכדי לזהות מולקולות חדשות הנדרשות phagocytosis של תאים אפופטוטיים.

המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד פגוציטוזיס in vivo בדרוזופילה כדי להעריך את מעורבותם של גנים ספציפיים בעלי עניין בבליעת תאים אפופטוטיים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי האימונולוגיה והביולוגיה ההתפתחותית לגבי המנגנונים המעורבים בבליעת תאים אפופטוטיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש בתאים בקלות ובדייקנות ברמות פגוציטוזיס in vivo.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול בהפרעות דלקתיות ומחלות אוטואימוניות שכן תא אפופטוטי על ידי פגוציטוזיס הכרחי להסרת תאים מסוכנים הגורמים לדלקת. התחל בהוספת 200 נקבות בוגרות ו -200 זבובי פירות זכרים בוגרים וצלחת אגר מיץ ענבים טרי על שמרים לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר. סגור את הצינור עם מכסה ספוג ודגר את הזבובים באור בטמפרטורה של 16 מעלות צלזיוס למשך יומיים-שלושה.

בתום הדגירה מעבירים את הזבובים ל -25 מעלות צלזיוס בחושך למשך שעה ומחליפים את הצלחת הישנה בצלחת חדשה ללא שמרים. אפשר לזבובים להטיל ביצים במשך שעתיים. לאחר מכן דגרו את הצלחת בחום של 16 מעלות צלזיוס למשך 26 שעות.

למחרת, השתמש במברשת צבע כדי להעביר את העוברים למיליליטר אחד של PBS בתוספת 0.2% טריטון X-100. לאחר שתי כביסות, הוסף 1.2 מיליליטר תמיסת נתרן היפוכלוריט לעוברים כדי להסיר את הכוריון. לאחר שלוש דקות, שטפו את העוברים ארבע פעמים ב-PBS טרי בתוספת Triton X-100.

העבירו את העוברים השטופים לצלחת אגרוז של שישה סנטימטרים והניחו את הצלחת מתחת למיקרוסקופ מנתח. זהה עוברים בשלב 16 באמצעות קצה מיקרו. השתמש במיקרו פיפטה כדי להעביר כ-50 מעוברי שלב 16 למיקרו מבחנה של 1.5 מיליליטר.

כדי לבודד את התאים העובריים, יש לשטוף תחילה את העוברים פעמיים עם 150 מיקרוליטר PBS. העבירו את העוברים למבחנה מיקרו חדשה של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן מוסיפים 200 מיקרוליטר קולגנאז והומוגניזציה של העוברים 30 פעמים בעזרת מערבל גלולות.

בתום ההומוגניזציה, יש לשלש את התאים העובריים 10 פעמים ולהעביר את תרחיף התאים לצינור חדש של 1.5 מיליליטר. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת. לאחר מכן יש לשלש את התאים 10 פעמים נוספות ולהחזיר אותם לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך דקה נוספת.

בתום הדגירה השנייה מוסיפים לתאים 800 מיקרוליטר PBS ואוספים את התאים באמצעות צנטריפוגה. השעו מחדש את הגלולה ב-200 מיקרוליטר טריפסין לפני סינון תרחיף התאים דרך מסננת תאים של 70 מיקרון. עצרו את הפעילות האנזימטית עם 40 מיקרוליטר של סרום בקר עוברי מומת בחום ב-800 מיקרוליטר PBS ואספו את התאים על ידי צנטריפוגה.

השעו מחדש את התאים המשקעים ב -200 מיקרוליטר של PBS טרי ואספו את התאים בעזרת צנטריפוגה נוספת. השעו מחדש את הגלולה ב-30 מיקרוליטר PBS והרכיבו את התאים על מגלשת זכוכית מצופה אמינופרופילטריאתוקסילן. כאשר התאים התחברו, השתמש בפיפטה כדי להסיר את עודפי ה-PBS מהשקף ולתקן את התאים עם 60 עד 70 מיקרוליטר של 4% פרפורמלדהיד.

לאחר 10 עד 15 דקות, הסר את הקיבוע ושטוף את התאים ב- PBS למשך דקה אחת. כדי להכתים את התאים בנוגדנים נגד קרוקמורט, תחילה יש להשרות את השקופית במתנול באופן סדרתי ולאחר מכן PBS בתוספת 0.2% טריטון X-100 ואחריו PBS בלבד. לאחר מכן, חסום את הקישור הלא ספציפי עם 20 מיקרוליטר של 5% סרום חזירים שלם ב-PBS בתוספת 0.2% טריטון X-100 למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.

הסר את תמיסת החסימה העודפת וסמן את התאים ב-20 מיקרוליטר של אנטי-קרוקמורט בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת בבוקר, שטפו את המגלשה ב-PBS בתוספת Triton X-100 למשך חמש דגירות של 10 דקות. לאחר הכביסה האחרונה, שטפו את השקופית ב-PBS למשך 10 דקות.

לאחר מכן סמנו את התאים ב-20 מיקרוליטר של IgG נגד חולדות אלקליין בטמפרטורת החדר למשך שעה. בתום הדגירה, שטפו את המגלשה חמש פעמים ב-PBS בתוספת Triton X-100 כפי שהודגם ולאחר מכן השרייה של 10 דקות בתמיסת חיץ. לאחר מכן סמן את התאים בתמיסת מצע פוספטאז והתבונן בתאים תחת מיקרוסקופ אור.

כאשר מופיעים אותות סגולים חזקים בגרגירי ההמוציטים, הסר את המצע העודף והשרו את השקופית במאגר בתוספת EDTA למשך חמש עד 10 דקות. בתום הדגירה יש לשטוף את התאים בשתי שטיפות PBS של חמש דקות ולטפל בהם במאגר שיווי משקל למשך 10 דקות. לאחר הסרת התמיסה, סמן את התאים ב-20 מיקרוליטר של תמיסת דאוקסי-נוקלאוטידיל טרנספראז טרמינלית ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה.

לאחר מכן הסר את התמיסה מהמגלשה והשרה את התאים ב 0.5 מיליליטר עצור את מאגר הכביסה ב -17 מיליליטר מים למשך 10 דקות. לאחר מכן, שטפו את התאים בשלוש שטיפות PBS של חמש דקות וסמנו אותם ב-20 מיקרוליטר של אנטי-דיגוקסיגנין פרוקסידאז למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. בתום הדגירה, שטפו את התאים ארבע פעמים ב-PBS כפי שהודגם והשרו את השקופית במצע פרוקסידאז למשך 30 שניות עד שהתאים האפופטוטיים הופכים לחומים.

כאשר הושגה צביעה אופטימלית, יש להשרות את המגלשה במים כדי לעצור את תגובת הפרוקסידאז. בתמונות אלה, מקרופאגים של דרוזופילה הנקראים המוציטים נצבעו עבור סמן ההמוציטים Croquemort ועבור נוכחותם של תאים אפופטוטיים פגוציטוזיים על ידי TUNEL בתאים עובריים מפוזרים כפי שהודגם זה עתה. תאים חיוביים של קרוקמורט מציגים אותות סגולים בגרגירים הקטנים של התאים שלהם בעוד שתאים חיוביים ל-TUNEL הפגינו אות חום בכל הגופים שלהם.

לחלופין, ניתן לצבוע המוציטים בנוגדנים נגד GFP אשר מכתים את כל ההמוציט במקום רק את הגרגירים. בניסוי זה, נותח היחס בין המוציטים של פגוציטוזינג לסך ההמוציטים בעוברים מסוג בר או מוטציה בודדת, והראה כי האינדקס הפגוציטי היה נמוך יותר בשני הזנים המוטנטיים הבודדים מאשר בזבובים מסוג בר, בעוד שהמספר הכולל של המוציטים ותאי האפופטוטיקה היה דומה, מה שמצביע על דרישת הגנים המוטנטיים לבליעת תאים אפופטוטיים. הפלת RNAi של גנים בודדים מפחיתה גם את האינדקס הפגוציטי בעוד שהמספר הכולל של המוציטים ותאי אפופטוטיקה נותר בר השוואה, מה שמדגיש עוד יותר את מעורבותם של קולטני הפגוציטוזיס שנחקרו בפגוציטוזיס בתיווך תאים אפופטוטיים.

לאחר השליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך כ-15 שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להימנע מעודף סמן המוציטים וצביעה של TUNEL להערכה אופטימלית של היכולת הפגוציטוטית של התאים. לאחר הליך זה, ניתן לבצע בדיקת פגוציטוזיס באתרה של כל עוברי הדרוזופילה כדי לענות על שאלות נוספות לגבי אתר הבליעה או התפלגות ההמוציטים.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האימונולוגיה לחקור את המנגנונים של בליעת תאים אפופטוטיים בדרוזופילה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד למדוד פגוציטוזיס in vivo בעוברי דרוזופילה.