מתודולוגיה Neuromodulation ביונים כימית של עכברוש הרשתיות עם ה עצבי גלוטמט במבחנה

המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא לאפשר נוירומודולציה חדשה מבוססת כימיקלים של נוירונים ברשתית באמצעות נוירוטרנסמיטורים, שעשויה להחליף את הפונקציונליות של תאי רשתית פגומים בחולים עם עיוורון נוירודגנרטיבי כדי להחזיר את הראייה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הראייה המלאכותית. כגון האם ניתן להשתמש בגלוטמט, נוירוטרנסמיטר ראשוני ברשתית, כדי לעורר טיפולית רשתית מנוונת של קולטני אור?

היתרון העיקרי של הטכניקה שלנו הוא שהיא ביומימטית, גירוי הרשתית בדרך זו מציע פוטנציאל לחדות ראייה גבוהה יותר וראייה טבעית יותר ממה שאפשרי עם גירוי חשמלי. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול בעיוורון, עקב מחלות ניווניות של קולטני אור מכיוון שהתערבות טיפולית מוקדמת של רשתית מנוונת יכולה להחזיר את הרגישות לגלוטמט בנוירונים ברשתית. כדי להתחיל בהליך זה, הנח את שתי העיניים הגרעיניות בצלחת פטרי בקוטר 60 מילימטר עם תמיסת איימס מדיום מחומצנת טרייה.

בעזרת מיקרוסקופ סטריאו דיסקציה, בצע חתך קטן בפנים הקרנית בעזרת אזמל או מספריים חדים. לאחר מכן, בצע חתך מהחתך הקטן הזה לקצה הקרנית. ולהאריך אותו בחתך היקפי סביב כל קצה הקרנית.

לאחר מכן, הסר את הקרנית המנותקת יחד עם העדשה, הומור מימי שקוף וזגוגית. תוך כדי החזקת גביעונית העיניים בעדינות עם זוג מלקחיים אחד, בצעי בזהירות שני חתכים קטנים בצדדים מנוגדים של גביעונית העין. לאחר מכן, השתמש בשני זוגות מלקחיים כדי לפרק בעדינות את העין בכל אחד מהחתכים.

ולהפריד את הרשתית מהסקלרה. הרם לאט את כל הרשתית מהסקלרה ומכוס העין וחתך את עצב הראייה אם הוא עדיין מחובר. לאחר מכן, בצע חתכים אורכיים ברשתית כדי להשיג חצי או רבע חלקים.

ואז מורחים בעדינות חלק אחד של הרשתית על רשת ניילון כאשר תאי הגנגליון פונים הרחק מהרשת. הנח את הרשת והרשתית על מערך MultiElectrode מחורר כאשר תאי הגנגליון נמצאים במגע עם משטח PMEA. ואז הניחו משקולת על גבי הרשת כדי לשמור על הרשתית במקומה.

בהליך זה, תחת תאורה אדומה עמומה, הנח את PMEA במגבר MEA וסגור את תפסי המגבר. מקם את יציאת הזילוף העליונה בתוך תא ה-PMEA והפעל את שסתום הזלוף העליון כדי להשיג קצב זלוף של כשלושה מיליליטר לדקה. לאחר מכן, מקם את כניסת היניקה העליונה ברמת ה-perfuse 8 הרצויה.

ודא שזה עובד. לאחר מכן, פתח את תוכנת רכישת הנתונים ולחץ על כפתור ההפעלה כדי להתחיל לקבל נתונים. ודא שכל ערוצי ה-PMEA נטולי רעש ומקליטים אותות עצביים.

אם לא, מקם מחדש את ה-PMEA בתוך המגבר כדי להשיג מגע טוב יותר בין פיני המגבר למגעי ה-PMEA. לאחר מכן, ודא שקו הזלוף התחתון נקי מכל בועות אוויר. הפעל את שסתום הזלוף התחתון כדי להבטיח שהרשתית מסופקת עם חמצן וחומרים מזינים.

לאחר מכן, הפעל את המצלמה המהירה המחוברת למיקרוסקופ האופטי ההפוך ופתח את תוכנת ההדמיה. לאחר אישור הזלוף התחתון זורם, הגבירו לאט את היניקה התחתונה על ידי סיבוב ידני של כפתור לחץ הוואקום בערכת פסולת הוואקום תוך התבוננות ברשתית דרך המיקרוסקופ ההפוך. ברגע שנצפה כוח יניקה הפועל על הרשתית, הפסק להגדיל את היניקה.

לאחר שווידאתם שהרשתית מוחזקת במקומה על ידי היניקה התחתונה, הסירו את המשקל מהרשתית באמצעות מלקחיים והסירו בעדינות את רשת הניילון על ידי קילוף פינה אחת בזהירות מהרשתית. שמור על הזלוף פועל במשך כ-30 דקות כדי לאפשר לרשתית להתייצב מהטראומה הניתוחית. בשלב זה, הכנס בזהירות מיקרופיפטה בקוטר 10 מיקרומטר שנמשכה מראש למחזיק פיפטה סטנדרטי המכיל אלקטרודת חוט כלוריד כסף-כסף בקוטר 50 מיקרומטר.

אם אתה משתמש במקום זאת במכשיר מיקרופלואידי מרובה יציאות, הכנס את מוט הנירוסטה המחובר למכשיר למחזיק פיפטה רגיל ללא אלקטרודת תיל. אם אתה משתמש במיקרופיפטה מזכוכית, ממשק את מחזיק הפיפטה עם תיקון clamp headstage וחבר את החיבור התחתון של יציאת הלחץ של מחזיק הפיפטה כדי לתעל את אחת ממערכות הזרקת הלחץ. לחלופין, אם אתה משתמש במכשיר מרובה היציאות, חבר את חיבורי יציאת הלחץ של כל אחת משמונה יציאות ההזרקה, עם ערוץ אחד עד שמונה של מערכת הזרקת הלחץ.

לאחר מכן, הפעל ידנית את מערכת הזרקת הלחץ והפעל את הערוץ הראשון. ודא שהמערכת מאווררת לאטמוספירה והגדר את לחץ ההזרקה ל-0.1 פאונד לאינץ' מרובע. לאחר מכן, הפעל את המיקרומניפולטור וכייל אותו על ידי לחיצה על כפתור הכיול בבקר המניפולטור.

מקם את המיקרומניפולטור כך שקצה המיקרופיפטה יהיה כ-30 מילימטרים מעל מגבר ה-MEA. לאחר מכן, מלאו צלחת פטרי קטנה בתמיסת גלוטמט והניחו אותה מתחת למיקרומניפולטור. הורד את קצה המיקרופיפטה לתוך התמיסה ומלא את המיקרו-פיפטה מזכוכית או את צינור ההתקן מרובה היציאות בכ-20 מילימטרים של תמיסה.

לאחר מכן, הרם את קצה המיקרופיפטה, או המכשיר, מהתמיסה. הסר את צלחת הפטרי ומקם את המיקרומניפולטור מעל תא ה-PMEA. בעזרת מיקרוסקופ סטריאו המותקן על מעמד בום, יישר את קצה המיקרופיפטה, או את פינות המכשיר, עם סימן ייחוס חרוט בטבעת תא ה-PMEA.

לאחר מכן, אחסן את מיקומי המניפולטור במשטח הבקרה באמצעות כפתורי הפניה לחנות A ואחסן הפניה B כדי למפות את מערכת הקואורדינטות של המניפולטור של אלקטרודות PMEA. לאחר מכן, השתמש בתוכנת בקרת המניפולטור. בחר אלקטרודת יעד PMEA עם פעילות ספונטנית חזקה ולחץ על כפתור המעבר לערוץ כדי ליישר את המיקרופיפטה מזכוכית עם אלקטרודת המטרה.

אם אתה משתמש בהתקן מרובה יציאות, יישר את המיקרו-יציאות של המכשיר עם אלקטרודות PMEA יעד עם פעילות ספונטנית חזקה באותו תהליך. אם מדידת עכבה זמינה, הפעל את תיקון clamp ampחיים יותר והפעל את תוכנת הדמיית העכבה על ידי לחיצה על כפתור ההתחלה כדי לדמיין את העכבה של אלקטרודת כלוריד כסף-כסף בתוך מחזיק הפיפטה. תוך כדי התבוננות באותות העכבה בזמן אמת, הורד לאט את המיקרו-פיפטה, או המכשיר, עד שהוא יוצר קשר עם משטח הרשתית כפי שמצוין על ידי עלייה מהירה באות העכבה.

לגירוי תת-קרקעי, הורד את הפיפטה ב-40 מיקרומטר נוסף עבור S334 טרה שלוש רשתיות, או 70 מיקרומטר עבור רשתית מסוג בר. בצע מספר זריקות קצרות באמצעות מערכת הזרקת הלחץ. לקבוע אם התאים ליד קצה המיקרופיפטה, או מיקרו-יציאות המכשיר, פתוחים לגירוי גלוטמט על ידי התבוננות באותות העצביים.

כעת, כוון את הנורית הירוקה לכיוון המשטח העליון של הרשתית. התחל להקליט באמצעות תוכנת רכישת הנתונים על ידי הקלדת שם הקובץ ולחיצה על כפתור ההקלטה. לאחר תחילת ההקלטה, פתח את תוכנית בקרת הגירוי וטען את קובץ הגירוי המוגדר כברירת מחדל על ידי לחיצה על כפתור קריאת קובץ הגירוי.

לאחר מכן, לחץ על כפתור הפעל קובץ גירוי כדי להפעיל את קובץ הגירוי המוגדר כברירת מחדל. לאחר השלמת קובץ הגירוי, עצור את ההקלטה כדי לשמור את הקובץ למיון ספייק עתידי וניתוח נתונים. להלן ההקלטות המייצגות מתשע אלקטרודות PMEA, המציגות את נתוני האלקטרודות המסוננות במעבר גבוה במהלך גירוי אור חזותי עם נורית LED ירוקה, כאשר כל מלבן מציג את הנתונים העצביים מאלקטרודה ייחודית.

כל הקלטת אלקטרודה ממחישה נתונים שנאספו בשנייה הראשונה לאחר הדלקת הנורית הירוקה. דוקרנים זוהו באמצעות מתח סף של 18 מיקרו-וולט שלילי. גירוי חזותי גרם לפרץ של קוצים בכל האלקטרודות מלבד המרכזית העליונה, שהייתה בעלת תגובה מעכבת לאור.

תרשים דומה לאותן אלקטרודות, המראה פעילות עצבית ספונטנית ללא גירוי חזותי או הזרקה. למרות שהתפרצויות קטנות יותר היו נוכחות, דפוסי הקוצים היו שונים מאוד מאלה שתועדו בתגובה לגירוי חזותי. להלן ההקלטות המייצגות מאותה תת-קבוצה של אלקטרודות שהוקלטו מיד לאחר הזרקת גלוטמט באלקטרודה המרכזית.

הגלוטמט המוזרק עורר פרץ של קוצים באלקטרודה המרכזית שהיה דומה מאוד להתפרצויות הספייק המעוררות חזותית. כל שאר האלקטרודות לא הושפעו מהזרקת הגלוטמט המדגימה את הרזולוציה המרחבית העדינה של טכניקת הגירוי הכימי. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך ארבע עד שש שעות אם היא מבוצעת כראוי.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לעקוב אחר הזלוף כדי להבטיח שהרשתית מסופקת באופן רציף עם חמצן וחומרים מזינים לאורך כל הניסוי. טכניקה זו יכולה לסלול את הדרך לחוקרים בתחום הראייה המלאכותית ופיתוח תותבות חזותיות לחקור נוירומודולציה מבוססת כימיקלים לטיפול בעיוורון ממחלות ניווניות של קולטני אור. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להשיג נוירומודולציה של נוירונים ברשתית באמצעות נוירוטרנסמיטורים.