In Vivo Fiber-Coupled Pre-Clinical Confocal Laser-Scanning Endomicroscopy (pCLE) של נימי היפוקמפוס בעכברים ערים

בעוד שדימות מולטיפוטונים יעיל רק בעומקים מוגבלים מפני השטח של הרקמה, ניתן להשיג הדמיה ברזולוציה של 3 מיקרומטר בכל עומק באמצעות pCLE. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביצוע הדמיית pCLE למדידת דינמיקה מיקרו-וסקולרית בהיפוקמפוס של עכברי איקטל ועכברי בר.

פרוטוקול זה אפשר לנו להשתמש באנדומיקרוסקופ סיב אופטי סורק לייזר קונפוקלי כדי לבצע הדמיה בו זמנית והקלטות אלקטרופיזיולוגיות in vivo במשך מספר שעות ממבנים עצביים בכל עומק של המוח בחיה ערה או מורדמת יחסית. פיתחנו שיטת ריסון ללא כאב המאפשרת דימות מוחי עמוק בבעלי חיים ערים בשיטות דומות לאלה ששימשו בעבר לרישומים אלקטרופיזיולוגיים. שיטה זו שימשה לחקר הפרעות כלי דם תפקודיות במודלים של מכרסמים של אפילפסיה וניוון מקולרי הקשור לגיל.

זוהי טכניקה קיימא כדי להעריך את התרומה של זרימת הדם פתולוגיה רבים, אם לא רוב האיברים של המחלות. בעוד שטכניקה זו פותחה עבור מחקר בזמן אמת של דינמיקת זרימת הדם במוח, השתמשנו בה כדי לחקור את זרימת הדם ברשתית in vivo. זה לא מוגבל למחקרי כלי דם ברקמה עצבית.

מי שידגים את ההליך יהיה חוזה מריה גונזלס מרטין, טכנאי מוסמך מאוד מהמעבדה שלי. לאחר אישור חוסר תגובה לרפלקס עלי הכותרת, הניחו את השיניים בתוך החור של מוט הנשיכה, וייצבו את ראש העכבר במסגרת סטריאוטקסית של מכרסמים. הדקו את מהדק האף עד שהוא צמוד.

המיקום של הגוף צריך להיות ישר ככל האפשר. השתמש במוטות אוזניים עם אזיקי מחזיק לסת כדי לאבטח את הראש כך שהתהליכים הזיגומטיים של הגולגולת נמצאים בתוך המהדק. לאחר ניקוי ועיקור הקרקפת, יש לבצע חתך של 12 עד 15 מ"מ לאורך קו האמצע מבסיס הגולגולת ועד בין העיניים לאורך קו האמצע של הגולגולת, ולהשתמש בארבעה מהדקים עדינים של בולדוג בקוטר 28 מ"מ כדי לסגת מגבולות הקרקפת, לחשוף את הגולגולת ולמקסם את אזור העבודה.

מגרדים את הפריאוסטאום עד לשולי החתך, ומייבשים את החלק העליון של הגולגולת. מדדו את גובה הגולגולת בכל מרחק אחורי לברגמה, ושני מרחקים שווים לרוחב מקו האמצע משני צדי הגולגולת. זהה את נקודת המטרה, ההיפוקמפוס הימני בעזרת אטלס סטריאוטקסי.

על הגולגולת, מצאו את קואורדינטות נקודת המטרה ביחס לברגמה עם הסטריאוטקס, והשתמשו בסמן כירורגי כדי לסמן ארבע פינות של חלון הדמיה בגודל 1.4 על שני מילימטר שמרכזו סביב נקודת המטרה ישירות מעל ההיפוקמפוס. השתמש בטוש הניתוחי כדי לצייר סימן נוסף מעל עצם הקודקוד השמאלית העליונה, וסימן נוסף מעל העצם הקדמית הימנית עבור ברגי העצם. השתמש בטוש כדי לצייר מילימטר אחד בכל צד של קו האמצע, ונקודה אחת על קו האמצע מילימטר אחד מאחורי למבדה כדי לציין את נקודות החדרת האלקטרודות האפידורליות של רישום EEG.

כדי להתקין את מכסה הראש, ציידו מקדחה דנטלית עם בור בקוטר 0.7 מילימטר, וקדחו בזהירות שני חורים קטנים בגולגולת בנקודות מיקום בורג העצם. לאחר מכן, בורג עצם מחורץ מפלדת אל-חלד בקוטר 70% עד 80% אתנול בקוטר 4 מילימטר בקוטר 0.85, תוך הקפדה על כך שקצות הבורג לא יבלטו מעבר לתחתית העצם לתוך חלל הגולגולת. לאחר מכן השתמש בחתיכת יישור מותאמת אישית בצורת L המהודקת למיקרו-כונן המורכב להתקן הסטריאוטקסי כדי ליישר את כובע הראש לאורך קו האמצע עם הרכס הקדמי שמעל הברגמה, והכנס שני ברגי כונן מחורצים בראש פיליסטר מעל הברגמה עד שהברגים שוכבים שטוחים על הגולגולת, תוך הקפדה לא להפעיל לחץ רב מדי על הגולגולת.

כדי להגדיר את חלון ההדמיה, קדח חור בור בקוטר 0.7 מילימטר בכל אחד מהמיקומים של סימני הייחוס של הקרניוטומיה עבור פינות חלון ההדמיה לפני השימוש במקדח כדי לתחום בעדינות את הפריפריה של חלון קרניוטומיה בגודל 1.4 על שני מילימטר עם חתכים עמוקים יותר באופן איטרטיבי. כסו את החלון הפתוח בשעוות עצם, והשתמשו בבור בקוטר 0.9 מילימטר כדי לקדוח את חורי אלקטרודת ה-EEG האפידורלית, תוך הקפדה שלא לחתוך את הדורמטר. מכסים את שלושת החורים בשעוות עצם, ובונים קיר מלט דנטלי המקיף את חלון ההדמיה וחורי EEG כדי לקשור את הקיר לכובע הראש.

לאחר שהמלט התייבש, השתמשו במשי קלוע שחור 4.0 או 5.0 ובתפרים קטועים פשוטים כדי לסגור את שולי הפצע הרופפים, והשתמשו באפליקטור עם קצוות כותנה כדי למרוח לידוקאין ומשחות אנטיבקטריאליות על העור החשוף. לאחר מכן הניחו את העכבר בכלוב חם עם ניטור עד להחלמה מלאה. יום לאחר סקר השתלת כובע הראש, חבר את כובע הראש למוט הרכבה מותאם אישית המחובר למסגרת הסטריאוטקסית כדי למקם את העכבר הער בבטחה למסגרת לאורך כל סשן ההדמיה.

הכניסו את אלקטרודות רישום ה-EEG האפידורליות לתוך החור המרכזי האחורי, והכניסו את אלקטרודות ההקלטה לחורים הקדמיים השמאלי והימני. קצות החוטים בצורת L, וממוקמים בין הגולגולת לדורמטר. כדי לדמיין את זרימת הדם בתוך ההיפוקמפוס, אבטחו את הזנב בשתי אצבעות כדי לאתר את הווריד המרכזי, והחזיקו מזרק אינסולין דק במיוחד המצויד במחט משולבת של 30 מד במקביל לזנב, הכניסו את צד המחט המשופע לווריד בערך במחצית הדרך לשני שלישים מבסיס הזנב כדי לספק 200 מיקרוליטר של דקסטרן 5% פלואורסצאין ירוק הניתן לקיבוע ליזין.

לאחר מכן השתמש בקצה הכפוף של מחט מזרק כדי להסיר את הדורה וליזום את הקלטת סריקת לייזר קונפוקלית. מיד לאחר הזרקת וריד הזנב, הדקו את צרור הסיב האופטי המשופע 300 מיקרון לזרוע הניידת של הכונן הסטריאוטקסי הרובוטי בכיוון מטה. מערכת הריסון מאפשרת רישום יציב של זרימת דם של מיקרו-כלי דם עמוקים במוח, כולל נימים ותאי הקיר הפרוקסימליים שלהם במשך שעות ארוכות.

בניתוח מייצג זה של כלי דם שלמים, התרחשו הפסקות זרימת דם בתאי הקיר המסומנים. ניתן לקבוע את כמות רישומי הסיבים על ידי השוואת רישומי הדמיה של שני פוטונים ברזולוציה גבוהה של זרימת הדם לואזוספאזמות שוות ערך ברקמת קליפת המוח. ניתוח אימונוהיסטוכימי באתרי ההקלטה ממחיש כי תאי קיר בהיפוקמפוס ממוקדים נכון בשיטה זו, לא רק מתכווצים בתגובה לטיפול, אלא גם מתקשרים מרחבית עם צרות בכלי מיקרו מרוחקים מהעורקים.

מיומנות בניתוח סטריאוטקסי ובהזרקת וריד זנב לטרלי היא חיונית לביצוע פרוטוקול זה. תרגול יסודי הוא חיוני כדי להפחית שגיאות ולשפר את הדיוק. הטכניקה מאפשרת הדמיה בזמן אמת של דינמיקת זרימת הדם במבני מוח עמוקים, מה שהופך אותה למתאימה לחקר פתולוגיות של מערכת כלי הדם ולהערכת יעילות הטיפולים המכוונים אליהן.