השרשה בצינורית לתוך המלון Cisterna של מכרסמים
23 במאי 2018
כאן נתאר פרוטוקול לבצע cisterna מגנה תעלות (CMc), דרך פולשנית כדי לספק קליעים נותבים, מצעים, מולקולות איתות לתוך נוזל מוחי שדרתי (CSF). CMc בשילוב עם שיטות הדמיה שונות, מאפשרת המערכת glymphatic CSF dynamics הערכה, וכן משלוח המוח ברוחב של תרכובות שונות.
המטרה הכוללת של הליך כירורגי זה היא לאפשר אספקה ישירה של עוקבים, סובסטרטים ומולקולות איתות לנוזל השדרה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במדעי המוח שהוגשו לגבי דינמיקת CSF ו-ISF במוח. שיטה זו מאפשרת העברת מולקולות שונות, עקבות, מצעים מטבוליים פעילים לתוך ה- CSF, נוזל השדרה, תא מבלי לפגוע בגולגולת או בפרנכימה המוחית.
ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על מחלות נוירולוגיות מכיוון שהיא מאפשרת הערכה של שטפי CSF-ISF במוח וגם פינוי מטבוליטים וחלבונים רעילים מהפרנכימה המוחית. אז שיטה זו מספקת תובנה לגבי הדינמיקה של שטפי CSF-ISF ובנוסף אנו יכולים להשתמש בה כנתיב העברה מהיר וכלל מוחי לאיתות מולקולות ומצעים מולקולריים שלא יכלו לעבור אחרת את מחסום הדם-מוח. להכנת הצינורית, יש לשבור את קצה המתכת המשופע של מחט שיניים בגודל 30 באמצעות מחזיק מחט.
לאחר מכן, הכנס את קצה המתכת המשופע באורך 30 סנטימטר של צינורות PE-10 מלאים ב-aCSF. לאחר מכן, השתמש במזרק מיליליטר אחד המצויד במחט בגודל 30 כדי לשטוף את הצינורית בנוזל מוחי מלאכותי. לאחר מכן הצינורית מוכנה לשימוש בניתוח.
לאחר הרדמת העכבר, מקם את החיה מעל כרית חימום על מכשיר סטריאוטקסי. בדוק אם אין רפלקס דוושה עם צביטה בבוהן, והמתן עד שהנשימה של החיה תהיה איטית ויציבה. לאחר מכן, גלחו את הראש והצוואר.
לאחר מכן, נגב את הפרווה ועקר את העור החשוף. ראשית, שפשפו את העור באלכוהול. לאחר מכן בצע שתי מריחות של 0.5 אחוז כלורוהקסידין או שני אחוז תמיסת יוד.
עבור קנולציות כרוניות, יש לתת גם משככי כאבים באתר הקנולציה. כעת, תקן את העכבר במסגרת הסטריאוטקסית, תוך שימוש בקשת התוך-עצבית או בקשת הזיגומטית. לאחר מכן, הטה מעט את הראש כך שייווצר זווית של 120 מעלות לגוף.
לאחר מכן, יש למרוח משחת עיניים ולמרוח אותה מחדש לפי הצורך במהלך הניתוח. מצא את הפסגה העורפית, שהיא החלק של הגולגולת הבולט מיד מעל שרירי הצוואר. הרם את העור שמעליו בעזרת פינצטה וחתוך פיסת עור בצורת שקד של כסנטימטר אחד לאורך קו האמצע.
לאחר מכן, תוך שימוש בפסגה העורפית כנקודת ייחוס, משוך את רקמת החיבור השטחית כדי לחשוף את שרירי הצוואר שמתחת. השתמש בצמר גפן או בחניתות עיניים כדי לשלוט בכל דימום שנוצר. כדי להמשיך, הפרד את השרירים בקו האמצע על ידי העברת הפינצטה בזהירות באמצע אתר החתך בציר הקדמי לאחורי.
לאחר מכן, עם זוג מלקחיים מעוקלים בכל יד, חבר את הקצוות באמצע ליד תחתית הגולגולת ומשוך את השרירים הצידה כדי לחשוף את בור המים. בור המים נראה כמו משולש הפוך זעיר, המתוחם על ידי המוח הקטן למעלה והמדולה למטה. בעזרת חנית עיניים כירורגית או צמר גפן, נגב את הממברנה הדוראלית המכסה את ה-CM.לאחר מכן, עם פינצטה מעוקלת ביד הדומיננטית, אחוז בצינורית ליד המחט המכוסה בצינור.
לאחר מכן, הנח את האצבע האמצעית של היד השנייה על מוט האוזן כדי ליצור מנוחה יציבה לצינורית. כעת, במרכז ה-CM, נקב את הדורה ב-45 מעלות ביחס לראש העכבר. הכנס את המחט רק למקום שבו השיפוע נמצא מתחת לדורה כדי למנוע חדירה לתוך המוח הקטן או המדולה.
במידת הצורך, נקה כל CSF שדלף בעזרת חנית או ספוגית. לאחר מכן, מרחו כמה טיפות של ציאנואקרילט על הממברנה הדוראלית המקיפה את הצינורית והוסיפו טיפת מאיץ דבק כדי לרפא את הדבק באופן מיידי. לאחר מכן, שלבו מלט שיניים ודבק ציאנואקרילט.
לאחר מכן, כסו את כל מקום החתך ומרחו במהירות טיפת מאיץ דבק לריפוי. להזרקה בעכברים עם קנולציה חריפה של צינורית ציסטרנה מגנה, המשך ישירות להזרקת עוקבי CSF בעזרת משאבת הזרקה. עבור קנולציה כרונית, חתוך את הצינור לשניים או שלושה סנטימטרים ואטום אותו בריתוך כירורגי כדי לשמור על רמות הלחץ הבין גולגולתי.
לאחר מכן, תן קרפרופן. כעת, הכניסו את העכבר לבד והשאירו את הכלוב מעל כרית חימום עד שהעכבר יחזור לשכיבה על עצם החזה. להכנת הצינורית, נתק את קצה המתכת המשופע של מחט שיניים בגודל 30 באמצעות מחזיק מחט.
לאחר מכן, הכנס את קצה המתכת המשופע באורך 30 סנטימטר של צינורות PE-10 מלאים ב-aCSF. בעזרת מחט בגודל 30 יש לשטוף את הצינור. חבר את המחט בגודל 30 למזרק של 100 מיקרוליטר מלא במים מזוקקים ולאחר מכן חבר אותה למשאבת מזרק.
בעזרת המשאבה, משוך מספיק אוויר כדי ליצור בועה של סנטימטר אחד בצינורית. לאחר מכן, טבלו את המחט בתמיסת העוקב CSF ומשכו 12 מיקרוליטר לתוך הצינורית. חותכים את הצינור המחובר לצינורית באורך של עד שלושה עד ארבעה סנטימטרים ומחברים במהירות את הצינור המלא במעקב CSF עם הצינורית המושתלת בעזרת מלקחיים עדינים.
כדי להזריק עוקבי CSF לתוך ה-CM של בעלי חיים מורדמים, השתמש במשאבת מזרק כדי לספק עוקבים במיקרוליטר אחד לדקה למשך חמש עד עשר דקות. לאחר מכן אפשר לעוקבים להסתובב במשך 30 דקות מבלי להזיז את הצינורית. רסנו בעדינות את החיה וחתכו כסנטימטר אחד מהצינור מהצינורית המושתלת.
לאחר מכן, חבר במהירות את שתי הצינוריות, בעזרת מלקחיים עדינים וזוג פינצטה מעוקלת במידת הצורך. כעת, הזריק מיקרוליטר אחד של עוקב לדקה במשך שבע עד שתים עשרה דקות, באמצעות משאבת מזרק. לאחר ההזרקה, הניחו לעוקב להסתובב במשך 30 דקות תוך נקיטת האמצעים הדרושים כדי להבטיח שהצינורית תישאר ללא הפרעה והצינור יישאר מחובר.
ואז המשך בקצירת המוח. מוחות של עכברים הוזרקו עם עוקבי CSF לתוך ה-CM כפי שתואר. מבט גבי מקרוסקופי מראה את התפלגות העוקבים בבורות התת-עכבישיים של אזור המוח הקטן בנורת הריח ובחלל הפרה-וסקולרי לאורך עורקי המוח האמצעיים.
בחלק הגחוני של המוח, תצוגה מקרוסקופית מראה את התפלגות העוקב אחר CSF לאורך מעגל וויליס. קטעים היסטולוגיים של מוחות מוזרקים CM חושפים עוד יותר את ההתפלגות הפרה-וסקולרית של עוקבים בתוך פרנכימת המוח. לעכברים שהוזרקו בהרדמה או בזמן שינה הייתה פיזור הרבה יותר עוקב מאשר לעכברים שהוזרקו כשהם ערים ונעים בחופשיות בכלוב הביתי שלהם.
לאחר צפייה בסרטון זה, עליכם לרכוש ידע טוב כיצד לבצע קנולציה של בור מים שיאפשר לכם להעביר כימיקלים או מולקולות מעניינות לתא נוזל המוח ללא כל נזק ניתוחי לגולגולת או לפרנכימה המוחית. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 20 עד 30 דקות אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ביצוע הליך זה, חשוב להפעיל את כמות הלחץ הנכונה בעת ניקוב הדורה מאטר כדי למנוע דליפת CSF גדולה שעלולה להפריע ללחץ הבין גולגולתי.
לאחר פיתוחו, קנולציה זו של בור מים זו סללה את הדרך למחקרים בפינוי CSF-ISF במוח באמצעות מה שמכונה מערכת הלימפה שכיום נמצאת בשימוש נרחב במודלים שונים של בעלי חיים של מחלות נוירולוגיות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לקניולציה של הציסטרנה מגנה (cisterna magna cannulation - CMc), טכניקה זעיר-פולשנית להחדרת מולקולות אל נוזל המוח והשדרה (CSF). שיטה זו מאפשרת להעריך את הדינמיקה של מערכת הגלימפטית ומאפשרת הזרקה של תרכובות לכל רחבי המוח מבלי לפגוע ברקמות הסובבות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- נוירו-אנטומיה
- טכניקות כירורגיות במודלים של בעלי חיים
רקע
- קניולציה של ה-Cisterna magna מספקת נתיב ישיר לנוזל ה-CSF.
- גישה זו מקלה על חקר הדינמיקה של ה-CSF וה-ISF במוח.
- יש לכך השלכות על הבנת מחלות נוירולוגיות.
- CMc מאפשרת הערכה ופינוי של מטבוליטים מהמוח.
מטרת המחקר
- לאפשר הובלה ישירה של סובסטרטים מולקולריים לנוזל החוט השדרה (CSF).
- לחקור את דינמיקת הזרימה בין ה-CSF ל-ISF.
- לשפר את ההבנה של מחלות נוירולוגיות ושל דינמיקת המוח.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- השיטה כוללת קניולציה כירורגית של ה-cisterna magna במודל של עכברים.
- העכברים מורדמים, ומתבצעת חתך מדויק כדי לגשת ל-cisterna magna.
- בעקבות השחלת הקניולה, מוזרקים סמנים (tracers) באמצעות משאבת מזריקה.
- שלבים אנטומיים וכירורגיים מפורטים מסופקים עבור הפרוצדורה.
תוצאים עיקריים
- CMc מאפשרת התפצת סומנים בכל רחבי המוח, ובכך מדגישה את הדינמיקה של זרימת ה-CSF.
- פרוטוקול זה שופך אור על מנגנוני הפינוי של מטבוליטים וחלבונים מהמוח.
- הוא מסייע להבנה מעמיקה יותר של תפקידו של המערכת הגלימפטית בהומאוסטזיס של המוח.
מסקנות
- המחקר מבסס את CMc כטכניקה בעלת ערך למחקרי מדעי המוח.
- היא מאפשרת הערכה בזמן אמת של התפקוד הגלימפטי ושל דינמיקת ה-CSF.
- תובנות שיירכשו באמצעות שיטה זו יכולות לשפר את הבנתנו לגבי מנגנוני מחלות נוירולוגיות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
קניולציה של ה-Cisterna magna מספקת נתיב זעיר-פולשני לגישה ישירה לנוזל התחומי (CSF), המאפשרת הערכה של דינמיקת הזרימה של CSF-ISF החיונית לתיקוף מטרות במודלים של מחלות ניווניות של מערכת העצבים. הטכניקה תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי מתן אפשרות להגעה של מולקולות איתות ומצעים מטבוליים לכל רחבי המוח, אשר אינם מסוגלים לחצות את מחסום הדם-מוח, ובכך משפרת את הביטחון החזותי במחקרי מעורבות מטרות (target engagement) פרה-קליניים. הדבר ממצב את השיטה ככלי תרגומי להערכת תפקוד מערכת הגלימפטית והפצת סממנים ביולוגיים במסלולי פיתוח פרה-קליניים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של היפותים טיפוליים הקשורים לחילוף בין נוזל המוח והשדרה (CSF) לנוזל הבין-תאי (ISF) ומנגנוני פינוי גלימפטי במודלים של מחלה.
- ערך תפעולי: מספק גישה הדירה ל-CSF לצורך הולכת סומנים ללא פגיעה בגולגולת או בפרנכימה, ובכך מפחית את השונות במדדי פרמקוקינטיקה.
- ערך ניבוי: תומך בתיקוף של יעדים טיפוליים על ידי כימות התפלגות הסומנים בחללים פרי-ססולריים, ובכך מספק מידע על חילוף מומסים עם הנוזל הבין-תאי.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מכין מערכות ביולוגיות מתוקשפות להערכת זרימת CSF ותובעת מומסים באמצעות אפלואורסצנציה, מיקרוסקופיה דו-פוטונית או קריאות MRI.
- ערך תפעולי: מאפשר הזרקה סטנדרטית וכמותית של סומנים בקצבים מבוקרים באמצעות משאבת מזרקים, ובכך תומך בחזרתיות של הבדיקה בין מחקרים שונים.
- יכולת הרחבה: מאפשר השתלה כרונית למחקרים אורכיים במכרסמים ערים הנעים בחופשיות, דבר המשפר את התפוקה עבור קמפיינים של סריקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מגשר בין שלב הגילוי לאישור פרה-קליני על ידי אפשור ניתוח של התפלגות חומרי מעקב ב-CSF, הקשור להחלפת נוזלים בינתיים ונתיבי פינוי מטבוליים.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מאפשר הערכה של שינויים בזרימה בין CSF ל-ISF במודלים של מחלות נוירולוגיות, ומספק מידע על מעורבות המטרה (target engagement) וביסוס של ויסות נתיבים.
- ביטחון חיזוי: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון באמצעות קורלציה בין קינטיקה של חומרי מעקב לבין תפקוד המערכת הגלימפטית ופינוי סממנים ביולוגיים.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מאישור יעד מוקדם ועד להערכה פרה-קלינית, ומאפשרת קריאות תלויות-CSF המספקות מידע על מעורבות היעד ו modulate של מסלולים במודלים של מחלות ניורודגנרטיביות.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות של דינמיקת CSF-ISF ותפקוד הגלימפטי, תוך הבהרת המנגנונים הביולוגיים העומדים בבסיס המעורבות עם המטרה.
- סריקה: מאפשר מוכנות לבדיקה באמצעות הזרקה סטנדרטית של סומן והדמיה כמותית של פיזור פרי-ווסקולרי בפרנכימה של המוח.
- אנליטיקה: מספק קריאות כמותיות של זרימת הסומן ופיזורו, המאפשרות השוואה בין תנאים המשפיעים על זרימת ה-CSF ופינויו.
- מחקר תרגומי: מקשר לרצף פרה-קליני על ידי הערכת תנועת הסומן מהחלל הסוב-ארכנואידי לחללים הפרי-ווסקולריים, דבר הרלוונטי להתאמת סממנים ביולוגיים ותיקוף מטרות.
- שימוש חוזר ארגוני: מהווה יכולת כירורגית ניתנת לשימוש חוזר לגישה ל-CSF במגוון פרויקטים החוקרים מנגנוני מחלות נוירולוגיות והולכת תרופות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי מתן אפשרות להערכה ישירה של חילופי CSF-ISF ומנגנוני פינוי גלימפטיים.
- ערך תפעולי: מספק גישה סטנדרטית וניתנת לשחזור לנוזל החוט השדרה תוך גרימת נזק מינימלי לרקמה, ובכך תומך בתוצאות ניסיוניות עקביות.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) על ידי מתן תובנות מנגנוניות לגבי השפעות מתווכות-מטרה על פינוי חלבונים ומטבוליטים ברחבי המוח.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מטרות מותאם סיכון, בהתבסס על השפעתן על התפקוד הגלימפטי ונתיבי מחלות נוירודגנרטיביות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקות נוירוכירורגיות במכרסמים ושמירה על שטח סטרילי למניעת זיהומים ולהבטחת פתיחות הקנולה.
- תלוי בציוד מיקרוכירורגי, הכולל פינצטות מעוקלות, מחטי עיניים (eye spears) ומשאבות מזרקים להחדרה מדויקת של הקנולה ולהזרקת חומרי סימון.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים כדי להבטיח מיקום עקבי של הקנולה, זווית ניקוב של הקרומיות (dura) וטיפול פוסט-כירורגי להבטחת הדירות (reproducibility).
- כולל שיקולי התאמה להשתלה אקוטית לעומת כרונית, כולל התאמות באורך הצינוריות ובשיטות האיטום לשמירה על הלחץ התוך-גולגולתי.
- מגבלות מעשיות כוללות אתגרים טכניים בניקוב הקרומיות ללא חדירה למדולה או לדגילי המוח (cerebellum), ואת הצורך בניהול קפדני של דליפות נוזל CSF למניעת ארטיפקטים של לחץ.
שאלות נפוצות בביו-פארמה
Chapters in this video
0:04
Title
1:17
Cannula Preparation
1:53
Insertion of the Cannula into the Cisterna Magna for Chronic Injections of CSF Tracers
5:52
Injection of CSF Tracers
6:43
Injecting CSF Tracers in Anesthetized Mice with Chronic Cisterna Magna Cannulation
7:20
Injecting CSF Tracers in Awake Mice with Chronic Cisterna Magna Cannulation
8:05
Results: Analysis of CSF Tracer Distribution
9:02
Conclusion
