Name: בידוד והפקת RNA של נוירונים, מקרופאגים מיקרוגלייה מן המוח זחל דג זברה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: למד לבודד נוירונים, מקרופאגים ומיקרוגליה ממוחות זחלי דג זברה ולהפיק RNA איכותי לניתוחי qPCR וטרנסקריפטומיקה. שיטה זו מאפשרת חקר פרופילי ביטוי גנים בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים ד ר קלייר דיוויס, ד ר ורוניק מירון (של המלכה Medical Research Institute, אדינבורו, נמצאת בליבה יונייטד) על דיונים הגישה ניסיוני ואת QMRI Flow Cytometry התא מיון מתקן ועזרה ראשונית. עבודה זו נתמכה על ידי סרטן מחקר בבריטניה הקריירה הממסד פרס כדי ד ר דרק Sieger.

1. מדגם והכנות מדיה
<ol><li>להכין העובר בינוני (E3) על ידי המסת 6.4 מ מ אשלגן כלורי, 0.22 מ מ NaCl, מ"מ 0.33 CaCl2 2 H2O, 0.33 מ מ MgSO4 7 שעות2O H2O.</li>
	<li>לאסוף דג זברה העוברים מיד לאחר ההפריה (0 dpf).<ol>
<li>פצל דג זברה עוברי 50 90 מ מ צלחת פטרי. העלאת עוברי ב 28.5 ° C ב- 50 מ של העובר בינוני (E3) שטופלו מיקרומטר 200 1-phenyl 2-thiourea (פרופילתיואוראציל), בסוף היום הראשון של פיתוח (0 dpf) משך זמן הניסוי כדי לעכב פיגמנטציה.</li>
		<li>שינוי E3 + פרופילתיואוראציל בינוני מדי יום משך זמן הניסוי.</li>
		<li>מסך mpeg1:eGFP וזחלים NBT:DsRed-dpf 2 באמצעות stereomicroscope נמכרות עבור ביטוי חיובי transgene, המקרופאגים GFP+ /מיקרוגלייה DsRed+ נוירונים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין כל המדיה יום לפני הניסוי ברדס תרביות רקמה כדי למנוע זיהום, ולאחר מכן לאחסן אותם ב 4 º C.<ol>
<li>להכין מדיה A על ידי המסת 15 מ מ Hepes ו- 25 מ מ D-גלוקוז HBSS 1 x.</li>
		<li>הכן דחיסות צבע בינונית (100%) על ידי ערבוב 9 כרכים של המדיום הדרגתיות צפיפות 1 ףקיהב HBSS 10 x.</li>
		<li>הכן המדיום הדרגתיות צפיפות (22 אחוז) על ידי דילול 22 מ של דחיסות צבע בינונית (100%) ב- 88 מ של DPBS 1 x.</li>
		<li>להכין DPBS 1 x.</li>
		<li>הכן E3 בינוני + Tricaine על ידי ערבוב בינונית E3 עם 450 μM Tricaine.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. המגון
הערה: כל השלבים הינם בביצוע 4 ° C.
<ol><li>להוסיף 1.5 mL Tricaine (15 מ מ) ל- 90 מ מ פטרי המכילות הזחלים 50 ב 50 מ של E3 העובר בינוני שטופלו 200 מיקרומטר פרופילתיואוראציל כדי סופני עזים ומתנגד להם.<ol>
<li>להתחנף 10 הזחלים מרדימים צלחות פטרי עם 3 מ ל פסטר פלסטיק בתפזורת פיפטה.</li>
		<li>העברת ומורדמת הזחלים 10 ב-10 לתוך צלחת פטרי 55-מ מ מלא קפואים E3 העובר בינוני + Tricaine.</li>
		<li>תחת stereomicroscope, ישר הזחלים 10 במרכז הפטרי. ואז transect ראשים זחל מעל שק החלמון באמצעות מיקרו-מספריים כירורגיים (לא לכלול שלפוחית אוויר כדי למנוע הצפה ראשי).</li>
		<li>לספוג את ראשיכם צלחות פטרי עם 3 מ ל פסטר פלסטיק בתפזורת פיפטה. לחכות עד כל ראשי מתאספים בעוד קצהו פיפטה ולאחר מכן להעביר אותם לתוך מהמגן זכוכית המכיל A Media כקרח 1 מ"ל (העברה באמצעי אחסון מינימלי כדי להפחית את המדיה לדילול ידי E3 + Tricaine). שמור את מהמגן זכוכית על קרח. השתמש מהמגן אחד לכל תנאי הניסוי.</li>
		<li>להחליף כל פטרי קטן המכיל קרח קר E3 + Tricaine חדשה כל 30 דקות כדי להבטיח את חיתוך מתבצע ב- E3 קר + Tricaine בינונית.</li>
		<li>החלף A Media כקרח ב מהמגן זכוכית הפעלת הצבע דוהה. הערה: דילול של המדיה יכול לשנות את הרקמה ראש עקב שינויי טמפרטורה.</li>
		<li>לאחר שנאסף כל ראשי (600 ראשי/תנאי), להסיר את הנפח המרבי של מדיה A מהמגן זכוכית ולהחליף אותו עם 1 מ"ל של טרי א מדיה קר כקרח</li>
		<li>לשבש את רקמת המוח עם מהמגן זכוכית צר על קרח. לבצע סיבובים 40 של ריסוק, והופך את הזחלים dpf 3-5, 50 עבור הזחלים dpf 7 ו- 8.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להוסיף 2 מ"ל של מדיה A תא ההשעיה (1 מ"ל מדיה A / 200 ראשי), זה תאים למהול ולהפחית שלהם הצטברות המיאלין כדי להקל על הפירוד שלהם במהלך צנטריפוגה דחיסות צבע בינוני.<ol>
<li>כדי למנוע הצטברות תאים, לרוץ התליה תא דרך מסננת תא 40 µm להציב על גבי צינור בז קר 50 מ ל שמר על קרח. חזור על פעולה זו 3 פעמים.</li>
		<li>להעביר 1 מ"ל של השעיה תא קר mL 1.5 צינורות ולסובב אותם ב 300 גרם 10 דקות ב 4 º C.</li>
		<li>להסיר את תגובת שיקוע באמצעות מזרק 10-mL + מחט 23G x 1''.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מחדש להשעות בגדר תא עם 1 מ"ל כקרח 22% צפיפות צבע בינוני בשכבות בעדינות על ידי 0.5 מ של קרח DPBS 1 x (do לא לערבב אותם, לאטמוספרה בין שני פתרונות יראו).<ol>
<li>ספין צינורות ב 950 g ללא בלימה והאצה איטי למשך 30 דקות ב 4 º C. הערה: שלב זה מפריד את המיאלין של תאים אחרים על-ידי sequestering זה-לאטמוספרה של DPBS 1 x ו- 22% צפיפות בינונית הדרגתיות, ואילו תאים גלולה בתחתית הצינורית. המיאלין הסרת יעיל יותר כאשר התא ריכוז אינו גבוה מדי.</li>
		<li>באמצעות על מזרק 10-mL + מחט 23G x 1'' להשליך המרבי של DPBS, צפיפות בינונית הדרגתיות המיאלין לכוד ב שלהם לאטמוספרה.</li>
		<li>לשטוף תאים עם 0.5 מ"ל של מדיה A + 2% של סרום עז רגילה (הגדרות), ואז לסובב צינורות-300 גרם 10 דקות ב 4 º C.</li>
		<li>למחוק את המקסימום של תגובת שיקוע ולאחר מכן מאגר כל כדורי תא לפי מצב ניסיוני באותו יחד 1 מ"ל של מדיה A + 2% המיתרים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>אם התאים של ריבית מבטאים חלבון פלואורסצנטי כמו מקרופאגים/מיקרוגלייה מ mpeg1:eGFP או נוירונים NBT:DsRed הטרנסגניים דגים (הקרנת לראות דגים הטרנסגניים 1.1.3), לרוץ התליה תא דרך מסננת תא מיקרומטר 35 קאפ ולהעביר אותם לתוך צינורות קר 5 מ"ל FACS בקרח, מוגן מפני אור. הערה: לחלופין, מכתים חיסונית של מיקרוגלייה יכולה להתבצע.</li>
</ol>3. מיקרוגלייה חיסונית מכתים
הערה: כל הצעדים מבוצעים ב 4 º C.
<ol><li>מחדש להשעות בגדר תא עם mL 0.3 של מדיה A + 2% המיתרים. לפצל אותם צינורות 3 x 1.5 mL: אחד עבור תאים וללא רבב למדוד אוטומטי-זריחה מתאי מעניינים, שנית הנוגדן המשני (1/200) למדוד את הכריכה לא ספציפית של הנוגדן משני כדי מיקרוגלייה ושלישית כמבחן (4C 4 העכבר monoclonal נוגדנים (מיקרוגלייה ספציפי) (1/20) + נוגדנים משניים (1/200)).<ol>
<li>הוסף אנדוטוקסין נמוכה, ללא אזיד (עלה)-1% תאים (כל צינורות) כדי לחסום את CD16/CD32 אינטראקציות עם התחום Fc של immunoglobulins. דגירה תאים עבור 10 דקות עם עצבנות עדין כל 5 דקות.</li>
		<li>הוסף את 4 4C נוגדן (1/20) על תאים (צינור 3) דגירה למשך 30 דקות עם עצבנות עדין כל 10 דקות.</li>
		<li>ספין צינורות-300 גרם 10 דקות ב 4 ° C, ואז למחוק את תגובת שיקוע.</li>
		<li>לשטוף לאחר 0.5 מ של מדיה A + 2% המיתרים, ואז לסובב צינורות-300 גרם 10 דקות ב 4 º C.</li>
		<li>צניפה תא מחדש להשעות 0.5 מ של מדיה A + 2% המיתרים דגירה תאים עם עלה ב-1% למשך 10 דקות עם עצבנות עדין כל 5 דקות.</li>
		<li>להוסיף נוגדנים משניים (1/200) לתאים (הצינור 2 ו- 3). דגירה תאים למשך 30 דקות עם עצבנות עדין כל 10 דקות והגנה אור.</li>
		<li>ספין צינורות-300 גרם 10 דקות ב 4 ° C, ואז למחוק את תגובת שיקוע.</li>
		<li>תשטוף פעמיים עם 0.5 מ של מדיה + 2% המיתרים, בזמנו, מחדש להשעות תא גלולה עם 1 מ"ל של מדיה A + 2% המיתרים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>תריץ תא ההשעיה כובע מסננת 35 מיקרומטר תא ולהעביר אותם אל תוך קר 5 מ"ל FACS צינורות בקרח, מוגן מפני אור.</li>
</ol>4. תא מיון (FACS)
הערה: בצע את כל השלבים ב 4 º C.
<ol><li>למיין נוירונים, מקרופאגים/מיקרוגלייה מיקרוגלייה באמצעות FACS. הערה: שלב זה מתבצע בדרך כלל על ידי איש צוות של המתקן FACS, הגדרות תלויות בסוג ציוד.<ol>
<li>להוסיף דאפי ריכוז של µg/mL 1 ב כל שפופרת FACS לסמן תאים מתים.</li>
		<li>להגדיר את הנוירונים FACS ומיון, מקרופאגים/מיקרוגלייה או מיקרוגלייה מכל התאים במוח. בתאים נפרדים מפני פסולת תפקודה של צפיפות רשת ובגודל שלהם, ואז שער חד-תאים על ידי פיזור קדימה ופיזור בצד. הכללת תאים מתים מאת דאפי labelling מתוך תאים חיים. לזהות נוירונים, מקרופאגים/מיקרוגלייה או מיקרוגלייה מאת שלהם מכתים חיוביות בהתאמה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>איסוף תאים צינורות 1.5 mL המכיל 1 מ"ל של מדיה A + 2% קר כקרח המיתרים על קרח. השתמש צינורות שונים עבור כל סוג התא.<ol>
<li>ספין צינורות-300 גרם 10 דקות ב 4 ° C ולאחר מכן למחוק את תגובת שיקוע.</li>
		<li>לשטוף לאחר 0.5 מ של מדיה אז למחוק את המקסימום של תגובת שיקוע.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. RNA החילוץ
<ol><li>לחלץ RNA סוגי התאים מופרדים על-ידי FACS. לחילוץ RNA להשתמש ערכת ספציפיים, פעל לפי ההנחיות של היצרן. ודא עובד בסביבה RNase חינם על-ידי ניקוי סביבת פיפטות עם מוצר טיהור RNase ולהשתמש מסנן טיפים.<ol>
<li>להכין טרי 1 מ"ל של פירוק מאגר בתוספת 50 מיקרומטר β-mercaptoethanol. הערה: כאן, β-mercaptoethanol נוספת כדי להפחית את ה-RNA השפלה.</li>
		<li>להכין פתרון אתנול 70% ו- 80% באמצעות RNase מים חינם.</li>
		<li>Lyse תאים עם 75 µL מאגר פירוק בתוספת 50 מיקרומטר β-mercaptoethanol. לאחר מכן להשתמש מגרסה והשמד לשיפור לשבירת תאים.</li>
		<li>המשך במדריך של החילוץ-RNA לפי יצרן.</li>
		<li>בסוף הפרוטוקול, elute את ה-RNA עם 14 µL של מים בחינם RNase בריכוז ה-RNA מספיקות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Chrast, R., Scott, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mouse+Brain+Transcriptome+by+SAGE%3A+Differences+in+Gene+Expression+between+P30+Brains+of+the+Partial+Trisomy+16+Mouse+Model+of+Down+Syndrome+%28Ts65Dn%29+and+Normals%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">The Mouse Brain Transcriptome by SAGE: Differences in Gene Expression between P30 Brains of the Partial Trisomy 16 Mouse Model of Down Syndrome (Ts65Dn) and Normals.</a> Genome Research. 10 (12), 2006-2021 (2000).</li>
<li>Beis, D., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cell+biology%3A+following+the+zebrafish+trend%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo cell biology: following the zebrafish trend.</a> Trends in Cell Biology. 16 (2), 105-112 (2006).</li>
<li>Shiau, C. E., Kaufman, Z., Meireles, A. M., Talbot, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Requirement+for+irf8+in+Formation+of+Embryonic+and+Adult+Macrophages+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Differential Requirement for irf8 in Formation of Embryonic and Adult Macrophages in Zebrafish.</a> PLoS ONE. 10 (1), 0117513-0117515 (2015).</li>
<li>Mazaheri, F., Breus, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+for+BAI1+and+TIM-4+in+the+engulfment+of+dying+neurons+by+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Distinct roles for BAI1 and TIM-4 in the engulfment of dying neurons by microglia.</a> Nature Communications. 5, 1-11 (2014).</li>
<li>Oosterhof, N., Holtman, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+conserved+and+acute+neurodegeneration-specific+microglial+transcriptome+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Identification of a conserved and acute neurodegeneration-specific microglial transcriptome in the zebrafish.</a> Glia. 65 (1), 138-149 (2016).</li>
<li>Hamilton, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Zebrafish+Live+Imaging+Model+Reveals+Differential+Responses+of+Microglia+Toward+Glioblastoma+Cells+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A Zebrafish Live Imaging Model Reveals Differential Responses of Microglia Toward Glioblastoma Cells In Vivo.</a> Zebrafish. , (2016).</li>
<li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117 (4), 49-56 (2011).</li>
<li>Peri, F., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+Neuronal+Degradation+by+Microglia+Reveals+a+Role+for+v0-ATPase+a1+in+Phagosomal+Fusion+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of Neuronal Degradation by Microglia Reveals a Role for v0-ATPase a1 in Phagosomal Fusion In Vivo.</a> Cell. 133 (5), 916-927 (2008).</li>
<li>Sieger, D., Moritz, C., Ziegenhals, T., Prykhozhij, S., Peri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+Ca2%2B+waves+transmit+brain-damage+signals+to+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+cell%22%5BJournal%5D)">Long-range Ca2+ waves transmit brain-damage signals to microglia.</a> Developmental cell. 22 (6), 1138-1148 (2012).</li>
<li>Becker, T., Becker, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerating+descending+axons+preferentially+reroute+to+the+gray+matter+in+the+presence+of+a+general+macrophage%2Fmicroglial+reaction+caudal+to+a+spinal+transection+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+comparative+neurology%22%5BJournal%5D)">Regenerating descending axons preferentially reroute to the gray matter in the presence of a general macrophage/microglial reaction caudal to a spinal transection in adult zebrafish.</a> The Journal of comparative neurology. 433 (1), 131-147 (2001).</li>
<li>Ohnmacht, J., Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+motor+neurons+are+regenerated+after+mechanical+lesion+and+genetic+ablation+in+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Spinal motor neurons are regenerated after mechanical lesion and genetic ablation in larval zebrafish.</a> Development. 143 (9), Cambridge, England. 1464-1474 (2016).</li>
<li>Roy-Carson, S., Natukunda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+transcriptomic+landscape+of+the+developing+enteric+nervous+system+and+its+cellular+environment%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Defining the transcriptomic landscape of the developing enteric nervous system and its cellular environment.</a> BMC Genomics. 18 (1), 1-24 (2017).</li>
<li>Khuansuwan, S., Gamse, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+differentially+expressed+genes+during+development+of+the+zebrafish+pineal+complex+using+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Identification of differentially expressed genes during development of the zebrafish pineal complex using RNA sequencing.</a> Developmental biology. 395 (1), 144-153 (2014).</li>
<li>Schmid, C. D., Melchior, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+gene+expression+in+LPS%2FIFN%CE%B3+activated+microglia+and+macrophages%3A+in+vitroversus+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Differential gene expression in LPS/IFNγ activated microglia and macrophages: in vitroversus in vivo.</a> Journal of Neurochemistry. 109, 117-125 (2009).</li>
<li>Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Tucker, A. F., Collins, H. Y., Mulinyawe, S. B., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+Requirements+for+Microglial+Survival%2C+Specification%2C+and+Function+Revealed+by+Defined-+Medium+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined- Medium Cultures.</a> Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).</li>
<li>Khan, A., Ju, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+analysis+reveals+differential+activation+of+microglial+genes+after+ischemic+stroke+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic analysis reveals differential activation of microglial genes after ischemic stroke in mice.</a> Neuroscience. 348, 212-227 (2017).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול נסיוני המתוארים כאן מייצג שיטה חזקה ויעילה כדי לבודד תאי מוח של דג זברה הזחלים 3 כדי 8 dpf. חשוב, זה הפרוטוקול הראשון המאפשר הבידוד ספציפי של מיקרוגלייה מן המוח דג זברה זחל. הפרוטוקול נועד כדי לשמר את שלמות קרום התא כדי למזער את השינויים פוטנציאלי של ביטוי גנים שאירעו במהלך העיבוד. הנקודה האחרונה חיונית הרלוונטיות של תוצאות בהתבסס על הניתוח של פרופילים מבודדים אלה גנומית הסלולר. אכן, קיטוב מיקרוגלייה ו מקרופאג חריפה מושפעים microenvironment שלהם. ב 37 מעלות צלזיוס, תאים אלה הייתי משנה שלהם פרופיל ביטוי גנטי בתגובה לתנאי הניסוי (פציעה (חיתוך) תגובה). לכן, זה היה חיוני לבצע את הניסוי הזה ב 4 ° C לפני החילוץ RNA, להאט תהליכים תאיים ופעילויות מטבולית. יתר על כן, המגון רקמת המוח מכני ב 4 ° C נבחר במקום עיכול אנזימטי רקמות ב 37 ° C כדי למנוע כל השפעה על ביטוי גנים פרופילים.
חשוב להדגיש כי שיטה זו היא מהירה מאוד; תוך יום מספר אוכלוסיות של תאי המוח יכול להיות מבודד לפחות שני תנאים ניסויים שונים ו- RNA שלהם שחולצו. האורך הכולל של הפרוטוקול תלוי המספר של הזחלים משמש עבור כל תנאי חיתוך של ראשי הזחל הוא הצעד המגביל (∼ 350 ראשי/h). באופן כללי, כדי לעבוד עם מיקרוגלייה 3, 5 ו-7 dpf מומלץ transect ∼ ראשי 600 לכל מבחן כדי לקבל מספיק RNA לחלץ (טבלה 1). מיקרוגלייה מייצגים את סוג התא עם הנמוך ביותר תשואה (כ – 112 תאים לכל ראש-7 dpf), ניתן לצמצם את מספר ראשי עבור סוגי תאים אחרים כולל מקרופאגים (כ – 170 תאים לכל ראש-7 dpf).
יתרון נוסף של פרוטוקול זה הוא כי ברגע הגדרות ב סדרן FACS הוקמו, באותן ההגדרות יכול לשמש לניסויים שונים. נצפתה כי אוכלוסיות תאים מתאימים באופן מושלם מהניסוי אחד אחר עם שערים תוכנן בעבר, מציג את הפארמצבטית הניסויים בשיטה זו.
חיסרון קל של שיטה זו הוא כמות נמוכה יחסית של RNA האיסוף. אולם, מגבלה זו היא יותר עניין ביולוגי מאשר בעיה טכנית, כמו מספר מיקרוגלייה נמוכה מאוד בשלבים המוקדמים של התפתחות המוח (טבלה 1). בגלל זה כמות נמוכה של RNA שנאספו, הגברה צעדים שצריך לקחת בחשבון כדי לבצע ניתוח ביטוי גנטי רחב הגנום. למרבה המזל, השלבים הגברה לייצר כמויות מספיקות של cDNA באיכות גבוהה. לפיכך, שינויים כלליים של ביטוי גנים פרופילים של תאים מבודדים ניתן יהיה ללמוד.
לסיכום, פרוטוקול זה מספק שיטה חזקה לבודד וללמוד סוגים שונים של תאים CNS מן המוח דג זברה זחל. זה ניתן להחיל כדי לרכוש הבנה מעמיקה יותר של תאים אלה במהלך הפיתוח גם כדי ללמוד את התפקיד שלהם למחלה.

ידע על התפתחות המוח, המוח מחלות השתפרה במידה ניכרת בעשור האחרון מאז כימות הראשון של העכבר-המוח-transcriptomes-1. אכן, ניתוח ביטוי גנטי רחב הגנום נותן לנו גישה למידע גנטי מפורט על רקמת המוח ותאי זה יכול להשלים ולשפר את תצפיותיו עם טכניקות וכלים אחרים.
דג זברה היא דוגמנית ביולוגי חזק, קל להתרבות וכדי לשנות גנטית; שקיפותו אופטי בשעה שדרגות מאפשרת חיים תצפיות הדמיה2. למרבה הצער, בהשוואה ל אנושי, עכבר, המספר של נוגדנים זמינים לביצוע מכתים חיסונית נמוכות למדי. כדי לתקן זאת, קווים דגים דג זברה מהונדס בקלות מתבצעים על-ידי שינוי גנטית דג אקספרס חלבונים פלורסנט תחת התא סוג ספציפי היזמים. דג זברה מהונדס קווים שימשו בעבר ללמוד את התפקיד של מקרופאגים מיקרוגלייה בזמן מחלה3,4,5,6ופיתוח של מערכת העצבים המרכזית (CNS). עם זאת, כדי להשיג הבנה מפורטת של תהליכים אלה אנחנו צריכים להבין שינויים בביטוי הגנים סוגי תאים המתאימים. לכוונה זו, פיתחנו שיטה ניסיונית במיוחד בידוד תאי כמו נוירונים, מקרופאגים מיקרוגלייה 3 8 ימים לאחר ההפריה (dpf) זחל דג זברה המוח. להקמתה של הפרוטוקול, עבדנו עם קווים דגים הטרנסגניים המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ב מקרופאגים/מיקרוגלייה תחת הגן בא לידי-ביטוי מקרופאג יזם (mpeg1:eGFP) ו- DsRed בנוירונים תחת ß-טובולין עצבית יזם (NBT:DsRed)7,8,9. יתר על כן, ביצענו מכתים חיסונית של מיקרוגלייה באמצעות 4C 4, נוגדן חד שבטי העכבר זה במיוחד כתמי דג זברה מיקרוגלייה10,11. לאחר מכן, חומצה ריבונוקלאית (RNA) מופק מן התאים האלה עוד יותר כמותיים תגובת שרשרת פולימראזית (qPCR) או transcriptome ניתוחים. פרוטוקול זה תוכנן כדי homogenize ביעילות רקמת מוח של דג זברה הזחלים; לאסוף את הנוירונים, מקרופאגים/מיקרוגלייה מיקרוגלייה ללא שינוי של שלמות קרום פלזמה שלהם ולחלץ סוף סוף RNA של תאים אלה באיכות גבוהה (RIN > 7) וכמות לבצע אנליזה גנומית. בניגוד מחקרים שפורסמו בעבר להשתמש טריפסין טיפול ב 37 מעלות צלזיוס לעכל12,של רקמת המוח13, פרוטוקול זה מקדם את העבודה ב 4 ° C עד השלב החילוץ RNA כדי להפחית את השינויים של פרופיל ביטוי גנטי. שלב זה הוא קריטי כמו מיקרוגלייה ו מקרופאגים הם תאים רגישים אשר מגיבים לשינויים microenvironment שלהם מיד על ידי שינוי שלהם ג'ין ביטוי פרופיל של קיטוב14,15, 16.
הפרוטוקול, המתוארים כאן בפירוט, מראה שהבידוד של נוירונים, מקרופאגים מיקרוגלייה מן מוח זחל דג זברה, אך למעשה, זה ניתן להתאים לכל תא אחר להציג בתוך המוח - גם באמצעות דגים הטרנסגניים שורות או בלוחיות הסבר נוגדנים ספציפיים. שיטה זו יאפשר אפיון טוב יותר של תאי מערכת העצבים המרכזית דרך את בדיקותיהם ביטוי הגן רחב של הגנום, תסייע לך להבין את תפקידם במהלך התפתחות המוח מחלות.

<table><tbody><tr><td>1-פניל 2-תיאוריאה (PTU)</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>D-גלוקוז</td><td>Sigma</td><td>G8644-100ML</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 1X</td><td>Gibco</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-02</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 10X</td><td>Gibco</td><td>14180-046</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 1X</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>טריקאין (MS222)</td> <td>Sigma</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>סטרילין סטנדרטי 90 מ"מ צלחות פטרי</td><td>ThermoFisher</td><td>101VIRR</td><td></td></tr><tr><td>מספריים מיקרו כירורגיות</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>3 מ"ל פסטר פלסטיק בתפזורת פיפטה</td><td>SLS</td><td>PIP4206</td><td></td></tr><tr><td>הומוגנייזר זכוכית</td><td>Wheaton</td><td>357538</td><td></td></tr><tr><td>סטרילין סטנדרטי 55 מ"מ צלחות פטרי</td><td>ThermoFisher</td><td>P55V</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-02</td><td></td></tr><tr><td>40 ומיקרו; מסננת תאים m</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינור חרוטי פוליפרופילן</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td>5804 R</td><td></td></tr><tr><td>10 mL מזרק</td><td>BD</td><td>302188</td><td></td></tr><tr><td>מחט 23G x 1''</td><td>BD</td><td>300800</td><td></td></tr><tr><td>סרום עיזים רגיל (NGS)</td><td>איתות תאים</td><td>5425S</td><td></td></tr><tr><td>35 &mu; פקק מסננת תאים m</td><td>BD</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>צינורות FACS</td><td>BD</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>אנדוטוקסין נמוך, נטול אזידים (LEAF)</td><td>Biolegend</td><td>101321</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 עז נגד עכבר IgG (H+L)</td> <td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Anti-4C4</td><td>באדיבות קתרינה בקר (אוניברסיטת אדינבורו)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סדרן FACS FACSAria II</td><td>BD</td><td>QMRI, FACS מתקן</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus מיקרו קיט</td><td>QIAGEN</td><td>74034</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-מרקפטואתנול</td><td>Gibco</td><td>&nbsp; 31350-010</td><td></td></tr><tr><td>QIAמגרסה</td><td>QIAGEN</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>SsoAdvanced אוניברסלי SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1725271</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III מערכת סינתזה של גדיל ראשון</td><td>Invitrogen</td><td>18080-051</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 96 מערכת PCR בזמן אמת&nbsp;</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ovation RNA-Seq System V2</td><td>NuGEN</td><td>7102-32</td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 פיקו ריאגנטים</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Ambion</td><td>AM9780</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד והפקת rna של נוירונים, מקרופאגים מיקרוגלייה מן המוח זחל דג זברה

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

כדי לקבל הבנה מפורטת של התפקיד של תאים שונים CNS במהלך פיתוח או הקמת והתקדמות של פתולוגיות במוח, חשוב לבודד תאים אלה מבלי לשנות פרופיל ביטוי גנטי. המודל דג זברה מספק מספר רב של קווים דגים מהונדס שבו לוחיות ההסבר סוגי תאים ספציפיים; לדוגמה הנוירונים NBT:DsRed קו או מקרופאגים/מיקרוגלייה בקו mpeg1:eGFP. יתר על כן, פותחו נוגדנים כתם תאים ספציפיים, כגון מיקרוגלייה עם 4C 4 נוגדן.
כאן, אנו מתארים את הבידוד של נוירונים, מקרופאגים מיקרוגלייה מן המוח דג זברה זחל. מרכזי פרוטוקול זה הוא ההתרחקות עיכול אנזימטי רקמות ב 37 מעלות צלזיוס, אשר יכול לשנות פרופילים הסלולר. במקום זה משמש מערכת מכנית של רקמות המגון ב 4 ° C. פרוטוקול זה כרוך המגון המוח לתוך התא ההשעיה, מכתים חיסונית שלהם, הבידוד של נוירונים, מקרופאגים מיקרוגלייה מאת FACS. לאחר מכן, אנו מופק RNA תאים אלה, להעריך את האיכות/כמות. הצלחנו להשיג RNA באיכות גבוהה (RNA תקינות מספר (RIN) > 7) כדי לבצע qPCR על ניתוח מקרופאגים/מיקרוגלייה נוירונים, ואת transcriptomic על מיקרוגלייה. גישה זו מאפשרת אפיון טוב יותר של תאים אלה, כמו גם הבנה ברורה יותר על התפקיד שלהם בתחום הפיתוח פתולוגיות.

הפרוטוקול המתואר היא גישה ישירה לבודד את הנוירונים, מאקרופאגים מיקרוגלייה מן המוח זחל דג זברה. אלה מבודדים תאים, כמויות משמעותיות של איכות גבוהה (RIN &gt; 7) RNA חולצו. המטרה של פרוטוקול זה נועד לבודד סוגים שונים של תאים של מערכת העצבים, בשינוי מינימלי של שלהם פרופיל ביטוי גנטי לאבחן ולאפיין את מאפייני תא ופונקציות. לכן, פרוטוקול כולו מתבצע ב 4 ° C עם המגון רקמות המוח מכני. שיטה זו שימש בהצלחה במשך שני מחקרים שבוצעו במעבדה. במחקר הראשון, נוירונים ו מקרופאגים/מיקרוגלייה הם בודדו אותנו מהמתרחש 8 dpf mpeg1:eGFP+/NBT:DsRed+ הזחלים (איור 1). FACS מורשה למחקר מפני פסולת תפקודה של גודלם (FSC-A), צפיפות (האס-A) (איור 1א'). תאים בודדים הופרדו אז doublets או תא agglomerates (איור 1B). מן האוכלוסייה תא בודד, שער צוירה לסלק תאים מתים (דאפי+). העלילה נקודה המתאימה חשף כי פרוטוקול נסיוני זה שומר על תאי פלזמה הקרומיות, כמו הקצב של תאים מתים רק 26.7% (איור 1C). לבסוף, נוירונים (DsRed+) ו מקרופאגים/מיקרוגלייה (GFP+) היו בקלות הפרדה בין השערים אוכלוסיית תאים חיים. האוכלוסייה נוירון (23.1%) נראה בולט יותר מאשר באוכלוסיה מקרופאגים/מיקרוגלייה (1.56%) בתוך המוח (איור 1D). פרוטוקול זה אפשרה לבודד RNA של תאים אלה כדי לבצע ניתוח qPCR עוקבות. להשוות את הביטוי של גנים ספציפיים בין הנוירונים מקרופאגים/מיקרוגלייה. איור 2 מופעים עצביים, מקרופאגים/מיקרוגלייה ג'ין רמות הביטוי של מתרבים תאים גרעיניים אנטיגן (pcna)נגד הגן משק בית β-אקטין כדוגמה.
לצורך המחקר השני בשיטה זו התמקדו מיקרוגלייה בידוד מן המוח זחל dpf 3, 5, 7. בניגוד הניסוי המתואר לעיל, התאים היו מבודדים על ידי מכתים חיסונית באמצעות 4C 4, נוגדנים אשר במיוחד תוויות מיקרוגלייה (איור 3 A-D). כאמור תיאר, מיקרוגלייה (4C 4+) נבחרו מתוך תאים חיים ואסף (איור 3ד'). מיקרוגלייה בתוך המוח זחל דג זברה המספרים משתנה (טבלה 1), נמוך מאוד-dpf 3 (∼ 25 לכל דג). האיכות והכמות של RNA שחולצו מן תאים אלה נמדדו באמצעות מערכת אלקטרופורזה מיקרו-נים מבוסס. התוצאות המתקבלות של RNA שחולצו מן מיקרוגלייה 5 מוח של דג זברה זחל dpf סופקו להדגמת של RNA ניתוח (טבלה 1 (5 dpf; ניסוי 4)). איור 4 מציג את האיתור אלקטרופורזה וייצוג גרפי שלו השיג עבור דוגמה זו עם פריט חזותי ברור של ribosomal RNA (28s ו- 18s). נתונים אלה יש צורך לחשב לדוגמה רין וכדי לקבוע ריכוז ה-RNA. טבלה 1 מסכמת מספר מיקרוגלייה מבודד לכל הכמות של RNA לכל מיקרוגלייה ודגים, התוצאה רין השיג עבור ניסוי שונות-dpf 3, 5, 7. הכמות והאיכות של RNA שחולצו מן מיקרוגלייה מבודדים באמצעות שיטה זו אפשר לנו להגביר את הרנ א לתוך cDNA באמצעות ערכת. בדיקות איכות וכמות שסופקו על-ידי אדינבורו גנומיקה לאשר cDNA מוגבר באיכות מספקת עבור ספריית הכנה ורצף עוקבות. איור 5 מציג את התפלגות גודל של קטעי cDNA והכמות שלהם נמדד באמצעות מערכת electrophoretic. במדגם זה, cDNA היה בגודל אכזרי של 299bp-ריכוז 36100 pmol/ל' בטבלה 2 מדגים בהתאמה בדיקות איכות וכמות ב cDNA מוגבר מדגימות RNA (טבלה 1 (5 dpf; ניסוי 4)). CDNA מוגבר שימש בהצלחה עבור רצף.
מספר מחקרים שבוצעו במעבדה אישרו כי האיכות והכמות של RNA שחולצו מן הנוירונים, מקרופאגים מיקרוגלייה יכול לשמש qPCR הבאים וניתוחים ביטוי הגן רחב הגנום. לכן, פרוטוקול נסיוני זה ניתן לבודד אמינה סוגים שונים של תאי מערכת העצבים המרכזית ללא שינוי שלהם הקרומיות והגבלת שינוי של הפרופיל שלהם ביטוי גנים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig1.jpg"> איור 1 : FACS מיון נוירונים ו מקרופאגים/מיקרוגלייה מן mpeg1:GFP+/NBT:DsRed+ 8 dpf דג זברה הזחלים. (א-ג) Gating רצופים מציגה מבחר רציף של תאים כל המוח (א), תאים בודדים על-ידי פיזור קדמי וצד פיזור (B). (ג) מתים התאים היו לא נכלל בשל labelling דאפי. (ד) נוירונים ו מקרופאגים/מיקרוגלייה אותרו בהתאמה על ידי DsRed ו- GFP מכתים חיובי. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig2.jpg"> איור 2 : הביטוי מפענוח pcna ו β-אקטין נוירונים ו מקרופאגים/מיקרוגלייה. יכול להיות עיבד RNA נוירונים בודדים, מקרופאגים/מיקרוגלייה לתוך cDNA לשימוש בניתוח ה-PCR כמותי. mRNA רמות הביטוי של pcna נגד β-אקטין ג'ין משק בית מבודד נוירונים ו מקרופאגים/מיקרוגלייה נקבעים על-ידי qPCR (N = 3). קיפול שינוי נמדדה באמצעות השיטה השוואתי (ΔΔCT). שגיאה בר לייצג זאת אומרת ± ב- SEM <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig3.jpg"> איור 3 : FACS מיון עבור מיקרוגלייה מ 3 dpf דג זברה הזחלים. (א-ג) תאים רצופים המגביל הצג רציפים מבחר כל המוח (א), תאים בודדים על-ידי פיזור קדמי וצד פיזור (B). (ג) מתים התאים היו לא נכלל בשל labelling דאפי. (ד) מיקרוגלייה זוהו על ידי 4C 4 מכתים חיובי. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig4.jpg"> איור 4 : מיקרו-נים תוצאות אלקטרופורזה של RNA שחולצו מן מיקרוגלייה דג זברה dpf 5. שתי הפסגות גבוה הן ribosomal RNA 18S, 28S. RNA תקינות מספר (RIN) היה מחושבים באופן אוטומטי על ידי תוכנת bioanalyzer באמצעות היחס שנוצר את 18S, 28S ribosomal subunits וניתוח של האיתור electrophoretic כולו. מיקרוגלייה RNA יש של 8.6 רין. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig5.jpg"> איור 5 : בדיקות האיכות והכמות של cDNA מוגבר מהדגימה RNA של 5 dpf דג זברה מיקרוגלייה. התמונה מציגה cDNA פרגמנט גודל להתפלגות המדגם שנותחה בגודל אכזרי של 299 bp. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>תנאי</td>
			<td>ניסוי</td>
			<td>מספר דגים</td>
			<td>מספר הטלפון הנייד</td>
			<td>מספר הטלפון הנייד לכל דג</td>
			<td>ריכוז ה-RNA (pg/ul)</td>
			<td>סה כ RNA (עמוד)</td>
			<td>כמות ה-RNA בכל תא (עמוד)</td>
			<td>רין ניקוד</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>1</td>
			<td>700</td>
			<td>11922</td>
			<td>17.03</td>
			<td>126</td>
			<td>1512</td>
			<td>0.13</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>2</td>
			<td>600</td>
			<td>22527</td>
			<td>37.55</td>
			<td>253</td>
			<td>3036</td>
			<td>0.13</td>
			<td>7.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>3</td>
			<td>600</td>
			<td>18688</td>
			<td>31.15</td>
			<td>255</td>
			<td>3060</td>
			<td>0.16</td>
			<td>7.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>4</td>
			<td>600</td>
			<td>11121</td>
			<td>18.54</td>
			<td>189</td>
			<td>2268</td>
			<td>0.20</td>
			<td>7.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>5</td>
			<td>600</td>
			<td>15581</td>
			<td>25.97</td>
			<td>131</td>
			<td>1572</td>
			<td>0.10</td>
			<td>8.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>6</td>
			<td>600</td>
			<td>11965</td>
			<td>19.94</td>
			<td>256</td>
			<td>3072</td>
			<td>0.26</td>
			<td>8.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>1</td>
			<td>600</td>
			<td>58629</td>
			<td>97.72</td>
			<td>362</td>
			<td>4344</td>
			<td>0.07</td>
			<td>7.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>2</td>
			<td>600</td>
			<td>32510</td>
			<td>54.18</td>
			<td>348</td>
			<td>4176</td>
			<td>0.13</td>
			<td>8.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>3</td>
			<td>600</td>
			<td>77884</td>
			<td>129.81</td>
			<td>594</td>
			<td>7128</td>
			<td>0.09</td>
			<td>8.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>4</td>
			<td>600</td>
			<td>50755</td>
			<td>84.59</td>
			<td>305</td>
			<td>3660</td>
			<td>0.07</td>
			<td>8.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>5</td>
			<td>600</td>
			<td>44967</td>
			<td>74.95</td>
			<td>134</td>
			<td>1608</td>
			<td>0.04</td>
			<td>7.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>6</td>
			<td>600</td>
			<td>51031</td>
			<td>85.05</td>
			<td>163</td>
			<td>1956</td>
			<td>0.04</td>
			<td>7.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>1</td>
			<td>600</td>
			<td>60496</td>
			<td>100.83</td>
			<td>183</td>
			<td>2196</td>
			<td>0.04</td>
			<td>7.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>2</td>
			<td>450</td>
			<td>55517</td>
			<td>123.37</td>
			<td>183</td>
			<td>2196</td>
			<td>0.04</td>
			<td>7.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>3</td>
			<td>600</td>
			<td>88897</td>
			<td>148.16</td>
			<td>465</td>
			<td>5580</td>
			<td>0.06</td>
			<td>8.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>4</td>
			<td>600</td>
			<td>63008</td>
			<td>105.01</td>
			<td>356</td>
			<td>4272</td>
			<td>0.07</td>
			<td>8.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>5</td>
			<td>350</td>
			<td>34956</td>
			<td>99.87</td>
			<td>245</td>
			<td>2940</td>
			<td>0.08</td>
			<td>8.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>6</td>
			<td>600</td>
			<td>63887</td>
			<td>106.48</td>
			<td>341</td>
			<td>4092, שעות</td>
			<td>0.06</td>
			<td>7.8</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: סיכום של בידוד מיקרוגלייה ו RNA חילוץ נתונים הזחלים דג זברה dpf 3, 5, 7.
<table fo:font-size="7" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>מזהה דגימה פנימי</td>
			<td>זיהוי הדגימה חיצוני</td>
			<td>קיוביט (ng/ul)</td>
			<td>Qubit(ng/ul)</td>
			<td>ריכוז ממוצע (ng/ul)</td>
			<td>נפח (ul)</td>
			<td>ug התקבל</td>
			<td>עובר או נכשל עבור ריכוז מינימלי</td>
			<td>עובר או נכשל עבור כמות minimim</td>
			<td>עובר או נכשל עבור הכמות המומלצת</td>
		</tr>
<tr>
<td>10907SD0010</td>
			<td>5 dpf (ניסוי 4)</td>
			<td>58.8</td>
			<td>58.4</td>
			<td>58.6</td>
			<td>30</td>
			<td>1.76</td>
			<td>לעבור</td>
			<td>לעבור</td>
			<td>לעבור</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="10">דרישות לדוגמה עבור הספרייה במכינה:</td>
		</tr>
<tr>
<td>הספרייה במכינה</td>
			<td>כמות מינימלית (ng)</td>
			<td>הכמות המומלצת (ng)</td>
			<td>Ng ריכוז מינימלי/uL...</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>ננו TruSeq ג'ל חינם 350 bp הוסף ספריית cDNA</td>
			<td>600</td>
			<td>1100</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 2: כמות בדיקות של cDNA מוגבר מהדגימה RNA של 5 dpf דג זברה מיקרוגלייה.

אנו מציגים פרוטוקול לבודד את הנוירונים, מאקרופאגים מיקרוגלייה מן המוח דג זברה הזחל בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים. על בידוד, RNA מופק מן התאים האלה כדי לנתח את פרופיל ביטוי גנטי. פרוטוקול זה מאפשר האוסף של RNA באיכות גבוהה עבור ביצוע ניתוח במורד הזרם כמו qPCR ו- transcriptomics.

בידוד והפקת RNA של נוירונים, מקרופאגים מיקרוגלייה מן המוח זחל דג זברה

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לבודד נוירונים, מקרופאגים ומיקרוגליה ממוחות של דגי זברה ולחלץ RNA באיכות גבוהה לביצוע ניתוח במורד הזרם כגון qPCR וטרנסקריפטומיקה. דגי זברה טרנסגניים הם כלי רב עוצמה להדמיה חיה ומספקים לנו את ההזדמנות לצפות בתאים בודדים כמו מיקרוגליה בסביבת המחיה שלהם לאורך זמן. עם זאת, כדי לקבל הבנה מפורטת של תפקידיהם עלינו להבין את פרופיל ביטוי הגנים שלהם, ופרוטוקול הבידוד והמיון שלנו נועד למטרה זו.היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יכולה לבודד סוגים שונים של תאים ממערכת העצבים המרכזית עם שינוי מינימלי בפרופיל ביטוי הגנים שלהם, כך שניתן יהיה לאפיין את תפקודי התא ותכונותיו. יעילותו של פרוטוקול זה באה לידי ביטוי ביעילותו. עם פרוטוקול זה, ניתן לייצר כמויות מספיקות של RNA תוך פרקי זמן קצרים עבור יישומים שונים במורד הזרם.לאחר גידול עוברי דג הזברה במדיום E3 המכיל PTU על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש בסטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לסנן זחלים בשני dpf עבור מקרופאגים חיוביים ל-GFP ומיקרוגליה בנוירונים חיוביים ל-DsRED. כדי להומוגניזציה של העוברים בשלב מסוים חמישה מ"ל של טריקאין 15 מילי-מולרי לכל 50 מ"ל של זחלים בינוניים עד 50 להכנת הרדמה. לאחר מכן השתמש בפיפטה של פסטר של שלושה מ"ל כדי להעביר 10 זחלים בכל פעם לצלחת פטרי של 55 מ"ל מלאה במדיום E3 קר כקרח עם טריקאין כדי להרדים אותם סופית.תחת מיקרוסקופ סטרומיקרוסקופ, יישר 10 זחלים במרכז צלחת הפטרי, ולאחר מכן בעזרת מיקרו-מספריים כירורגיים חוצה את ראשי הזחלים מעל שק החלמון. בעזרת פיפטת פסטר של שלושה מ"ל, קחו את כל הראשים ועם כמה שפחות נוזלים, העבירו אותם להומוגנייזר זכוכית על קרח המכיל מ"ל אחד של מדיה קרה כקרח. החלף את המדיה A הקרה כקרח בהומוגנייזר הזכוכית כאשר הצבע מתחיל לדעוך.לאחר איסוף כל קבוצת הראשים, הסר את כל המדיה A מההומוגנייזר של הזכוכית והחלף אותה במ"ל אחד של מדיה A קרה כקרח. לאחר מכן הוסף שני מ"ל של מדיה A לתרחיף התאים כדי לדלל את התאים ולהפחית את הצטברות שלהם עם מיאלין. מנעו הצטברות תאים על ידי העברת תרחיף התאים דרך מסננת תאים של 40 מיקרון לתוך שפופרת בז קרה של 50 מ"ל על קרח.חזור על שלב זה שלוש פעמים. העבירו מ"ל אחד של תרחיף תאים לצינורות קרים של נקודה אחת של חמישה מ"ל, וסובבו אותם ב -300 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר מכן, בעזרת מזרק של 10 מ"ל עם מחט בגודל 23 אינץ' הסר את הסופרנטנט.עם מ"ל אחד של מדיום שיפוע קר כקרח בצפיפות של 22 אחוז המכוסה בעדינות בנקודת אפס חמש מ"ל של 1X dbps קר כקרח, השהה מחדש בעדינות את כדור התא. סובב את הצינורות ב-950 פעמים גרם ללא הפסקה בתאוצה איטית בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר הסיבוב, השליכו את תווך שיפוע צפיפות ה-dbps במיאלין הכלוא בשלב הביניים שלהם.לאחר מכן השתמש באפס נקודה חמש מ"ל של מדיה A עם שני אחוז NGS כדי לשטוף את התאים, וסובב את הצינורות ב-300 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הסר כמה שיותר סופרנטנט, ואז משוך את כדוריות התא מאותו מצב ניסוי יחד במ"ל אחד של מדיה A עם שני אחוז NGS. אם התאים המעניינים מבטאים חלבון פלואורסצנטי, העבירו את תרחיף התאים דרך מכסה מסננת תאים של 35 מיקרון והעבירו אותם לצינורות FACS קרים של 5 מ"ל על קרח מוגן מאור.כדי לפגוע במיקרוגליה, השתמש באפס נקודה שלוש מ"ל של מדיום A בתוספת שני אחוז NGS כדי להשעות מחדש את כדורית התא, ואז לפצל את התאים בין שלושה צינורות של נקודה וחמישה מ"ל, אחד לתאים לא מוכתמים למדידת אוטופלואורסצנטיות, אחד למדידת הקישור הלא ספציפי של נוגדן משני למיקרוגליה ושלישי כבדיקה. לכל הצינורות, הוסף אחוז אחד נמוך של אנדוטוקסין נטול אזיד או עלה כדי לחסום אינטראקציות CD16, CD32 עם תחום ה-FC של אימונוגלובולינים. לאחר מכן דגרו על התאים למשך 10 דקות בתסיסה עדינה כל חמש דקות.לאחר מכן, לצינור השלישי הוסיפו את נוגדן 4C4 ודגרו אותו למשך 30 דקות עם תסיסה עדינה כל 10 דקות. ואז סובב את הצינורות ב -300 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר השלכת הסופרנטנט, שטפו את הגלולה פעם אחת עם אפס נקודה חמישה מ"ל של מדיה A בתוספת שני אחוז NGS לפני סיבוב הצינורות שוב.השעו מחדש את כדור התא עם אפס נקודה חמש מ"ל של מדיה A בתוספת שני אחוז NGS, ואז הוסיפו עלה של אחוז אחד ודגרו על התאים למשך 10 דקות עם תסיסה עדינה כל חמש דקות. לשפופרות שתיים ושלוש, הוסיפו נוגדנים משניים והניחו את הצינורות בחושך. לאחר סיבוב הצינורות והשלכת הסופרנטנט, השתמש באפס נקודה חמש מ"ל של מדיה A בתוספת שני אחוז NGS כדי לשטוף את הדגימות פעמיים, ואז השהה מחדש את כדורי התא עם מ"ל אחד של מדיום A ועוד שני אחוז NGS.העבירו את תרחיף התא דרך מכסה מסננת תאים של 35 מיקרון והעבירו אותו לצינורות FACS קרים של חמישה מ"ל על קרח מוגן מפני אור. לבסוף, בצע מיון FACS וחילוץ RNA על פי פרוטוקול הטקסט. במחקר זה, נוירונים ומקרופאגים בתוספת מיקרוגליה בודדו משמונה זחלים חיוביים ל-dpf mpeg1 NBT dsRED.נעשה שימוש ב-FACS כדי להפריד את התאים מהפסולת לפי פונקציה של גודלם וגרעיניותם. לאחר מכן הופרדו תאים בודדים מכפילים או מצברי תאים. מאוכלוסיית התאים הבודדים, נמשך שער לחיסול תאים מתים.תרשים הנקודות המקביל גילה כי פרוטוקול ניסיוני זה שומר על שלמות קרום הפלזמה של התא מכיוון ששיעור התאים המתים הוא רק 26.7 אחוזים. כפי שמוצג כאן, נוירונים ומקרופאגים בתוספת מיקרוגליה הופרדו בקלות משערי אוכלוסיית התאים החיים. בתוך המוח, נראה שאוכלוסיית הנוירונים בולטת יותר מאוכלוסיית המקרופאגים והמיקרוגליה.במחקר שני, נעשה שימוש במיון FACS כדי לבודד מיקרוגליה חיה ממוחות זחלים עם 4C4, נוגדן שמסמן באופן ספציפי מיקרוגליה. כפי שמסוכם בטבלה זו של נתוני בידוד מיקרוגליה ומיצוי RNA, מספר המיקרוגליה במוחם של זחלי דג הזברה משתנה ונמוך מאוד בשלושה dpf. לבסוף, תוצאות מיצוי RNA שהתקבלו בניסוי אחד ממיקרוגליה של חמישה מוחות של דג זברה זחלי dpf מוצגות בעקבות אלקטרופורזה זו עם הדמיה ברורה של RNA ריבוזומלי.לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 12 שעות בהתאם למספר הראשים הדרושים לכל מצב. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על הכל קר ועל ניקיון המשטחים כדי למנוע פירוק RNA. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום מדעי המוח המשתמשים בדג הזברה כמודל לחקר פרופילי ביטוי גנים של תאים שונים בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים.לאחר הצפייה בסרטון, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד נוירונים, מקרופאגים ומיקרוגליה ממוחות של דגי זברה זחלים, וכיצד לחלץ RNA באיכות גבוהה כדי לבצע ניתוח במורד הזרם כמו qPCR ותעתיק.

isolation-rna-extraction-neurons-macrophages-microglia-from-larval

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

סרטון זה מתאר את הטכניקה של מיקרודיסקציה של המוח מדג זברה בוגר. שיטה זו מסייעת בהשגת נויאורוספירות שמקורן במוח שלם שניתן ללמוד עוד יותר.

דיסקציה מוחית של דגי זברה: טכניקה של נוירוביולוגיה של דגים

סרטון זה מתאר פרוטוקול לבידוד נוירונים, מקרופאגים ותאי מיקרוגליה ממוחות של דגי זברה זחלים על-ידי שיבוש מכני של רקמת המוח. אוכלוסיות התאים המטוהרים יכולות לשמש גם לניתוח גנומי.

בידוד תאי מוח מזחלי דגי זברה: שיטה להשגת נוירונים, מקרופאגים ותאי מיקרוגליה שלמים מרקמת המוח של דגי הזברה

בסרטון זה אנו מבודדים תאי מיקרוגליאה של דגי זברה באמצעות מיון תאים מצומדים למערכת החיסון. תאי מיקרוגליה מבודדים יכולים לשמש בניסויים במורד הזרם כדי להבין את תפקידם בפתולוגיות מוחיות.

בידוד תאי מיקרוגליה על ידי צביעה חיסונית מיון תאים מצומדים: שיטת צביעה חיסונית לבידוד תאי מיקרוגליה מתאי מוח של דגי זברה באמצעות מיון תאים מופעלים פלואורסצנטיים

ניתוח ביטוי גנים של תת-קבוצה של תאים ברקמה ספציפית מהווה אתגר גדול. מאמר זה מתאר כיצד לבודד RNA הכולל באיכות גבוהה מאוכלוסיית תאים ספציפית על ידי שילוב של שיטת immunolabeling מהירה עם microdissection ללכוד לייזר.

בידוד RNA מן אוכלוסיות תאים ספציפיות באמצעות Microdissection לייזר ללכוד בשילוב עם ראפיד immunolabeling

כאן אנו מספקים שיטה לשחזור לבחון neurogenesis למבוגרים באמצעות assay neurosphere נגזר מתוך הכלל המוח או מאחד את telencephalic, tectal או אזורים של המוח הקטן של המוח דג הזברה מבוגר. בנוסף, אנו מתארים את ההליך כדי לתפעל ביטוי גני neurospheres דג הזברה.

בידוד והתרבות של דג זברה למבוגרי מוח נגזר Neurospheres

פרוטוקול זה מציג גישה לניתוח transcriptome כל מעוברים דג זברה, הזחלים, או תאים ממוינים. אנו כוללים בידוד של RNA, מסלול ניתוח של נתוני RNASeq, המבוססות על לרביעיית-PCR אימות של שינויים בביטוי הגנים.

הכנת הדוגמא וניתוח של נתונים ביטוי גנים מבוססת RNASeq דג זברה

אנו מציגים פרוטוקול יעיל, קל לשימוש עבור הכנת תרביות תאים הראשי של דג זברה העוברים על תרביות תאים, תא חי הדמיה, כמו גם פרוטוקול להכין ראשי תאים מהמוח דג זברה למבוגרים.

תרבות, תרביות תאים תאים ראשי דג זברה

אנו מספקים פרוטוקול עבור בידוד של מיקרוגלייה מאזורים בגזור שונים של המוח העכבר באמצע המחצית, ואחריו הכנה חצי אוטומטי הספריה לרצף העמוק של RNA תא בודד של טרנססקריפט באורך מלא. שיטה זו תסייע להבהיר טרוגניות תפקודית של מיקרוגלייה בריאות ומחלות.

בידוד של אזור-מיקרוגליה ספציפי מתוך חצי הכדור השני של המוח העכבר עבור רצפי RNA של תא יחיד בודד

פרוטוקול זה מדגים את המיקרו-הזרקה של ליפופוליסכריד לאזור חדר המוח במודל של זחל דג זברה כדי לחקור את התגובה הנוירו-דלקתית והרעילות העצבית המתקבלות כתוצאה מכך.

מיקרו-הזרקות חדריות למוח של ליפופוליסכריד לדגי זברה זחליים להערכת דלקת עצבית ורעילות עצבית

במאמר זה אנו מתארים שיטה לבידוד מעיים מזחלי דגי זברה 5 ימים לאחר ההפריה, לצורך ניתוח ריצוף RNA חד-תאי.

בידוד מעיים מזחלי דגי זברה לריצוף RNA חד-תאי

אנו מדגימים שיטה המנצלת סריקה מהירה של מיקרוסקופ קונפוקלי כדי לבצע הדמיה חיה של תאי מיקרוגליה בטקטום האופטי המתפתח של דגי זברה, המאפשר ניתוח של הדינמיקה של תאים אלה in vivo.

הדמיה חיה ואפיון דינמיקה של תאי מיקרוגליה בעובר דג הזברה

למד לבודד נוירונים, מקרופאגים ומיקרוגליה ממוחות זחלי דג זברה ולהפיק RNA איכותי לניתוחי qPCR וטרנסקריפטומיקה. שיטה זו מאפשרת חקר פרופילי ביטוי גנים בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים.

בידוד והפקת RNA של נוירונים, מקרופאגים מיקרוגלייה מן המוח זחל דג זברה

גלה סרטונים נוספים