בידוד והפקת RNA של נוירונים, מקרופאגים מיקרוגלייה מן המוח זחל דג זברה

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לבודד נוירונים, מקרופאגים ומיקרוגליה ממוחות של דגי זברה ולחלץ RNA באיכות גבוהה לביצוע ניתוח במורד הזרם כגון qPCR וטרנסקריפטומיקה. דגי זברה טרנסגניים הם כלי רב עוצמה להדמיה חיה ומספקים לנו את ההזדמנות לצפות בתאים בודדים כמו מיקרוגליה בסביבת המחיה שלהם לאורך זמן. עם זאת, כדי לקבל הבנה מפורטת של תפקידיהם עלינו להבין את פרופיל ביטוי הגנים שלהם, ופרוטוקול הבידוד והמיון שלנו נועד למטרה זו.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יכולה לבודד סוגים שונים של תאים ממערכת העצבים המרכזית עם שינוי מינימלי בפרופיל ביטוי הגנים שלהם, כך שניתן יהיה לאפיין את תפקודי התא ותכונותיו. יעילותו של פרוטוקול זה באה לידי ביטוי ביעילותו. עם פרוטוקול זה, ניתן לייצר כמויות מספיקות של RNA תוך פרקי זמן קצרים עבור יישומים שונים במורד הזרם.

לאחר גידול עוברי דג הזברה במדיום E3 המכיל PTU על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש בסטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לסנן זחלים בשני dpf עבור מקרופאגים חיוביים ל-GFP ומיקרוגליה בנוירונים חיוביים ל-DsRED. כדי להומוגניזציה של העוברים בשלב מסוים חמישה מ"ל של טריקאין 15 מילי-מולרי לכל 50 מ"ל של זחלים בינוניים עד 50 להכנת הרדמה. לאחר מכן השתמש בפיפטה של פסטר של שלושה מ"ל כדי להעביר 10 זחלים בכל פעם לצלחת פטרי של 55 מ"ל מלאה במדיום E3 קר כקרח עם טריקאין כדי להרדים אותם סופית.

תחת מיקרוסקופ סטרומיקרוסקופ, יישר 10 זחלים במרכז צלחת הפטרי, ולאחר מכן בעזרת מיקרו-מספריים כירורגיים חוצה את ראשי הזחלים מעל שק החלמון. בעזרת פיפטת פסטר של שלושה מ"ל, קחו את כל הראשים ועם כמה שפחות נוזלים, העבירו אותם להומוגנייזר זכוכית על קרח המכיל מ"ל אחד של מדיה קרה כקרח. החלף את המדיה A הקרה כקרח בהומוגנייזר הזכוכית כאשר הצבע מתחיל לדעוך.

לאחר איסוף כל קבוצת הראשים, הסר את כל המדיה A מההומוגנייזר של הזכוכית והחלף אותה במ"ל אחד של מדיה A קרה כקרח. לאחר מכן הוסף שני מ"ל של מדיה A לתרחיף התאים כדי לדלל את התאים ולהפחית את הצטברות שלהם עם מיאלין. מנעו הצטברות תאים על ידי העברת תרחיף התאים דרך מסננת תאים של 40 מיקרון לתוך שפופרת בז קרה של 50 מ"ל על קרח.

חזור על שלב זה שלוש פעמים. העבירו מ"ל אחד של תרחיף תאים לצינורות קרים של נקודה אחת של חמישה מ"ל, וסובבו אותם ב -300 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר מכן, בעזרת מזרק של 10 מ"ל עם מחט בגודל 23 אינץ' הסר את הסופרנטנט.

עם מ"ל אחד של מדיום שיפוע קר כקרח בצפיפות של 22 אחוז המכוסה בעדינות בנקודת אפס חמש מ"ל של 1X dbps קר כקרח, השהה מחדש בעדינות את כדור התא. סובב את הצינורות ב-950 פעמים גרם ללא הפסקה בתאוצה איטית בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר הסיבוב, השליכו את תווך שיפוע צפיפות ה-dbps במיאלין הכלוא בשלב הביניים שלהם.

לאחר מכן השתמש באפס נקודה חמש מ"ל של מדיה A עם שני אחוז NGS כדי לשטוף את התאים, וסובב את הצינורות ב-300 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הסר כמה שיותר סופרנטנט, ואז משוך את כדוריות התא מאותו מצב ניסוי יחד במ"ל אחד של מדיה A עם שני אחוז NGS. אם התאים המעניינים מבטאים חלבון פלואורסצנטי, העבירו את תרחיף התאים דרך מכסה מסננת תאים של 35 מיקרון והעבירו אותם לצינורות FACS קרים של 5 מ"ל על קרח מוגן מאור.

כדי לפגוע במיקרוגליה, השתמש באפס נקודה שלוש מ"ל של מדיום A בתוספת שני אחוז NGS כדי להשעות מחדש את כדורית התא, ואז לפצל את התאים בין שלושה צינורות של נקודה וחמישה מ"ל, אחד לתאים לא מוכתמים למדידת אוטופלואורסצנטיות, אחד למדידת הקישור הלא ספציפי של נוגדן משני למיקרוגליה ושלישי כבדיקה. לכל הצינורות, הוסף אחוז אחד נמוך של אנדוטוקסין נטול אזיד או עלה כדי לחסום אינטראקציות CD16, CD32 עם תחום ה-FC של אימונוגלובולינים. לאחר מכן דגרו על התאים למשך 10 דקות בתסיסה עדינה כל חמש דקות.

לאחר מכן, לצינור השלישי הוסיפו את נוגדן 4C4 ודגרו אותו למשך 30 דקות עם תסיסה עדינה כל 10 דקות. ואז סובב את הצינורות ב -300 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר השלכת הסופרנטנט, שטפו את הגלולה פעם אחת עם אפס נקודה חמישה מ"ל של מדיה A בתוספת שני אחוז NGS לפני סיבוב הצינורות שוב.

השעו מחדש את כדור התא עם אפס נקודה חמש מ"ל של מדיה A בתוספת שני אחוז NGS, ואז הוסיפו עלה של אחוז אחד ודגרו על התאים למשך 10 דקות עם תסיסה עדינה כל חמש דקות. לשפופרות שתיים ושלוש, הוסיפו נוגדנים משניים והניחו את הצינורות בחושך. לאחר סיבוב הצינורות והשלכת הסופרנטנט, השתמש באפס נקודה חמש מ"ל של מדיה A בתוספת שני אחוז NGS כדי לשטוף את הדגימות פעמיים, ואז השהה מחדש את כדורי התא עם מ"ל אחד של מדיום A ועוד שני אחוז NGS.

העבירו את תרחיף התא דרך מכסה מסננת תאים של 35 מיקרון והעבירו אותו לצינורות FACS קרים של חמישה מ"ל על קרח מוגן מפני אור. לבסוף, בצע מיון FACS וחילוץ RNA על פי פרוטוקול הטקסט. במחקר זה, נוירונים ומקרופאגים בתוספת מיקרוגליה בודדו משמונה זחלים חיוביים ל-dpf mpeg1 NBT dsRED.

נעשה שימוש ב-FACS כדי להפריד את התאים מהפסולת לפי פונקציה של גודלם וגרעיניותם. לאחר מכן הופרדו תאים בודדים מכפילים או מצברי תאים. מאוכלוסיית התאים הבודדים, נמשך שער לחיסול תאים מתים.

תרשים הנקודות המקביל גילה כי פרוטוקול ניסיוני זה שומר על שלמות קרום הפלזמה של התא מכיוון ששיעור התאים המתים הוא רק 26.7 אחוזים. כפי שמוצג כאן, נוירונים ומקרופאגים בתוספת מיקרוגליה הופרדו בקלות משערי אוכלוסיית התאים החיים. בתוך המוח, נראה שאוכלוסיית הנוירונים בולטת יותר מאוכלוסיית המקרופאגים והמיקרוגליה.

במחקר שני, נעשה שימוש במיון FACS כדי לבודד מיקרוגליה חיה ממוחות זחלים עם 4C4, נוגדן שמסמן באופן ספציפי מיקרוגליה. כפי שמסוכם בטבלה זו של נתוני בידוד מיקרוגליה ומיצוי RNA, מספר המיקרוגליה במוחם של זחלי דג הזברה משתנה ונמוך מאוד בשלושה dpf. לבסוף, תוצאות מיצוי RNA שהתקבלו בניסוי אחד ממיקרוגליה של חמישה מוחות של דג זברה זחלי dpf מוצגות בעקבות אלקטרופורזה זו עם הדמיה ברורה של RNA ריבוזומלי.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 12 שעות בהתאם למספר הראשים הדרושים לכל מצב. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על הכל קר ועל ניקיון המשטחים כדי למנוע פירוק RNA. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום מדעי המוח המשתמשים בדג הזברה כמודל לחקר פרופילי ביטוי גנים של תאים שונים בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים.

לאחר הצפייה בסרטון, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד נוירונים, מקרופאגים ומיקרוגליה ממוחות של דגי זברה זחלים, וכיצד לחלץ RNA באיכות גבוהה כדי לבצע ניתוח במורד הזרם כמו qPCR ותעתיק.