מודל דוקסורוביצין-induced קרדיומיופתיה בדג זברה למבוגרים
June 7th, 2018
שיטה לייצר מודל קרדיומיופתיה דוקסורוביצין-induced למבוגרים דג זברה (רזבורה rerio) מתואר כאן. שתי דרכים חלופיות של הזרקת בקרום הבטן מוצגים ואת התנאים כדי להפחית וריאציות בין קבוצות שונות ניסיוני הנדונים.
שיטה זו יכולה לסייע בקביעת גורמי מפתח המשפיעים על סוכנים נגיפיים במהלך פיתוח מודל אדפטיבי לקטטוקסיות הנגרמת על ידי אנזוציקלין. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שמדובר במודל קטטוקסיות פשוט המושרה על ידי אנזוציקלין שניתן להשתמש בו לבדיקות גנטיות ומבוססות תרופות בתפוקה גבוהה. בעת הכנת תמיסת מלאי DOX, יש להמיס היטב את אבקת ה-DOX במים נטולי יונים עד שלא נראים גושים.
לבדיקת בקרת איכות, אסוף עוברי דג זברה מסוג בר משני זוגות דגים לפחות בשני אוספים נפרדים. יש לבצע דה-כוריוניזציה ידנית של העוברים 24 שעות לאחר ההפריה באמצעות מחטים עדינות. לאחר הדכוריון, רענן את מי העובר והסר את כל העוברים המתים.
כל אוסף עוברים חייב להכיל לפחות 36 עוברים לבדיקת בקרת איכות. כעת, יש לדלל את תמיסת ה-DOX במי עובר טריים לריכוז סופי של 100 מיקרומולר. הכינו לפחות 100 מיקרוליטר לשלושה עוברים.
מערבבים את הדילול בעזרת מערבולת. הדילול הסופי צריך להיות בצבע אדום בהיר. לאחר מכן, טען את הבארות של צלחת 96 בארות עם 100 מיקרוליטר של תמיסת DOX מדוללת.
הכינו באר אחת לכל שלושה עוברים. לאחר מכן, העבירו את העוברים לבארות באמצעות פיפטת העברה מפלסטיק. בזמן העברת עוברים, שמור את העוברים קרוב לקצה קצה הפיפטה.
לאחר מכן, הכניסו את קצה הפיפטה לתמיסה ואפשרו לעוברים לשחות באופן טבעי לתוך הבאר. אין להוציא את העוברים עם תמיסה מכיוון שהדבר ישנה את ריכוז ה-DOX. 48 שעות לאחר ההפריה, רענן את פתרון ה-DOX.
בשלב זה, הסתכל מתחת להגדלה של פי 10 כדי לזהות עוברים מתים, שאין להם פעימות לב ולזהות עוברים עם בצקת. מהר לספור ולהוציא עוברים מתים, אחרת גם העוברים הנותרים בבאר ימותו. חזור על ספירת המתים 72 שעות לאחר ההפריה.
אם יש לפחות 25% תמותה אז לתמיסת DOX יש יעילות תרופתית טובה וניתן להשתמש בה לניסוי. לפני הזרקת DOX לדג, צמו את הדג למשך 24 שעות. לאחר מכן, קבצו את הדגים.
בזמן ההרדמה, השתמשו בנייר סינון נקי כדי לייבש כל דג ולמדוד את משקל גופו. הכינו קבוצות של דגים שכולם נמצאים בטווח של 10% מאותו משקל גוף, כך שניתן יהיה להזריק לכל קבוצה את אותו מינון של DOX. לאחר מכן, חשב את ריכוז העבודה של DOX עבור כל קבוצה כך שלכל קבוצה מוזרקים חמישה מיקרוליטרים של תמיסה ומקבלת את אותו מינון של DOX לפי משקל גוף.
לאחר מכן, יש לדלל את מלאי ה-DOX ב-1X HBSS. מערבבים את הדילול עם מערבולת ולאחר מכן סובבו את הדילול כדי לשמור אותו מקורר יחד בצינור. להזרקה, הכינו פלטפורמת הזרקה.
בצלחת פטרי נקייה של 100 מיליליטר מניחים ספוג. בעזרת מיקרוסקופ דיסקציה חותכים חלל לספוג כדי להחזיק דג אחד. ארבעה סנטימטרים בדרך כלל עובדים.
לאחר מכן, למחט של 34 מד, חבר מזרק מיקרו של 10 מיקרוליטר. לאחר מכן, שטפו את המחט עם HBSS אחד 1X כדי להסיר בועות או בלוקים מהמזרק והצינורות. כעת, הרדימו לזמן קצר את הדג הבוגר עם טריקאין.
לאחר מכן, השרו את הספוג במי העובר עם טריקאין והעבירו דג על הספוג כשבטנו למעלה להזרקה. כעת, הזרקו תמיסת DOX תוך צפקית על ידי החדרה מהירה של המחט בזווית של 45 מעלות לקו האמצע בין סנפירי האגן בעומק של מילימטר עד שניים. לאחר מכן, שחררו לאט את כל תמיסת ה-DOX.
לפני החזרת המחט, המתן חמש שניות. לחלופין, ניתן למקם את הדג לרוחב, כאשר הקדמי מימין. לאחר מכן, הזריק בקו הצדדי מעל סנפיר האגן, כאשר השיפוע כלפי מעלה מצביע לכיוון השעה שבע בזווית של 45 מעלות ובעומק של שלושה עד ארבעה מילימטרים.
אם אחת משיטות ההזרקה הצליחה, יהיה גוון אדום בבטן. לאחר ההזרקה, העבירו במהירות את הדג למיכל מעבר נקי מלא במי מערכת טריים שם הוא יכול להתאושש. לאחר מכן, שטפו את המחט עם HBSS והמשיכו להזריק את הדג הבא.
מאוחר יותר, החזירו את הדגים המוזרקים למערכת עם מחזור ריצה, אך נפרדים מהמערכת הראשית כדי למנוע זיהום צולב. במשך 24 השעות הבאות, המשיכו לצום את הדגים. במהלך השבוע הראשון לאחר ההזרקה, הקפד לבדוק את הדגים מדי יום ולהסיר דגים מתים.
כאשר השתמשו בשיטת הזרקת ה-IP הקלאסית לבטן למעלה, צוין כי תמיסת ה-DOX המוזרקת עלולה לפעמים לזלוג החוצה מהמקום בו חדרה המחט. הזרקת ה-IP הרוחבית החלופית מנעה למעשה את הדליפה. הזרקת DOX במינון של 50 מיליגרם לק"ג הובילה לרעילות חמורה שבה רוב הדגים מתו תוך שבוע.
עם זאת, במינון נמוך יותר של 20 מיליגרם לקילוגרם, ניתן היה לשמור על דג הזברה המוזרק להשגחה כרונית. עם הזריקה החלופית, לא היה מוות של דגים במהלך השבועיים הראשונים, ורק כ-10% תמותה לאחר ארבעה שבועות. השיטה הקלאסית להזרקה באותו מינון הובילה לכ-30% מתים תוך ארבעה שבועות.
לאחר מכן, נעשה שימוש בדגים טרנסגניים עם רקע קספר המבטא DsRed וקרדיומיוציטים כדי להעריך את התקדמות תפקוד הלב במודל DIC. ניתן היה לראות את הלב האדום שלהם הן בשלב הסיסטולי והן בשלב הדיאסטולי תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לאחר הזרקה של 20 מיליגרם לק"ג DOX בשיטת ההזרקה הרוחבית החלופית, זוהתה ירידה בתפקוד החדרים החל מארבעה שבועות.
לאחר השליטה, ניתן לבצע מתן דוקסורוביצין בכל אחת מהטכניקות על כ-30 עד 50 דגים בשעה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו אקו לב, אלקטרוקרדיוגרפיה או חיבור תפקוד לב ex vivo על מנת לאפיין את תפקוד הלב של מודל DIC זה בשלבים שונים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשתמש בדוקסורוביצין טרי שהוכן ולבדוק את יעילות התרופה שלו לאחר אחסון ארוך טווח, לפני ההזרקה.
כמו כן, יש לטפל תמיד בדוקסורוביצין תוך נקיטת אמצעי הזהירות המתאימים.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה לייצור מודל של קרדיומיופתיה הנגרמת על ידי דוקסורוביצין בדגי זברה בוגרים (Danio rerio). הוא מתאר שתי טכניקות להזרקה לחלל הבטן ודן באסטרטגיות למזעור השונות בין קבוצות הניסוי.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- נוירולוגיה
- קרדיולוגיה
- פרמקולוגיה
רקע
- דוקסורוביצין הוא סוכן כימותרפי הידוע כגורם לקרדיוטוקסיות.
- דגי זברה הם אורגניזם מודל יקר ערך לחקר תפקוד הלב והשפעות התרופות.
- הבנת יעילות התרופה והרעילות שלה חיונית לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות בטוחות יותר.
- שונות בתוצאות הניסוי יכולה לנבוע מהבדלים בטכניקות ההזרקה.
מטרת המחקר
- לבסס מודל זברה אמין לחקר קרדיומיופתיה הנגרמת על ידי דוקסורוביצין.
- להשוות את היעילות של שתי שיטות הזרקה לחלל הבטן.
- להעריך את ההשפעה של דוקסורוביצין על תפקוד הלב לאורך זמן.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת תמיסת דוקסורוביצין וביצוע בדיקות בקרת איכות על עוברי זברה.
- טכניקות הזרקה לחלל הבטן למתן דוקסורוביצין.
- מעקב אחר דגים אחר סימנים לרעילות ותפקוד לקוי של הלב.
- שימוש בזברה מהונדסת כדי להמחיש את תפקוד הלב תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
תוצאות עיקריות
- שיטת ההזרקה הצדדית האלטרנטיבית הפחיתה דליפה ושיפרה את שיעורי ההישרדות בהשוואה לשיטה הקלאסית.
- במינון נמוך יותר של 20 מ"ג/ק"ג, הדגים שמרו על תצפית כרונית עם תמותה מינימלית.
- תפקוד לקוי של הלב נצפה החל מארבעה שבועות לאחר ההזרקה.
- שתי שיטות ההזרקה אפשרו מתן יעיל של דוקסורוביצין למספר דגים.
מסקנות
- שיטת ההזרקה הצדדית מומלצת לתוצאות טובות יותר במודלי זברה של קרדיומיופתיה.
- מעקב ארוך טווח הוא חיוני להערכת השפעות התרופה על תפקוד הלב.
- מודל זה יכול לאפשר סינון במעבר גבוה עבור רעילות לב ולהתערבויות טיפוליות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
The adult zebrafish doxorubicin-induced cardiomyopathy model enables mechanistic de-risking of cardiotoxicity in early discovery by capturing both acute and chronic phases of drug-induced cardiac dysfunction. This supports predictive confidence in target validation and lead identification for cardioprotective strategies. The model’s amenability to high-throughput genetic and drug screening enhances translational continuity from discovery to preclinical evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to cardiomyopathy mechanisms and pathway clarification in a vertebrate system.
- Operational Value: Supports biological de-risking and functional target validation through dose-dependent cardiac dysfunction readouts.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by identifying compounds with reduced cardiotoxic potential early in discovery.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a disease-relevant system for preparing validated biological models for downstream compound screening.
- Operational Value: Enables assay standardization and reproducibility through controlled intraperitoneal injection and quality control of drug efficacy.
- Scalability: Supports high-throughput screening readiness with delivery of doxorubicin to 30–50 fish per hour.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Offers disease relevance and translational biomarker alignment via fluorescent visualization of cardiomyocyte dysfunction over time.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical validation by modeling stage-dependent cardiac progression.
- Risk Mitigation: Supports risk-adjusted advancement decisions by detecting ventricular function decline beginning at four weeks post-injection.
Pipeline & Workflow Integration
The model integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical cardiotoxicity assessment, enabling stage-specific mechanistic insights.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in cardiomyopathy mechanisms using inducible cardiac dysfunction.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs via survival rates, edema scoring, and fluorescent cardiac imaging.
- Analytics: Enables comparison of conditions through mortality rates, cardiac imaging, and dose-response relationships.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling chronic cardiomyopathy progression observable over weeks.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for cardiotoxicity screening and modifier discovery across multiple campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in cardiotoxicity assessment, reduction of mechanistic ambiguity in drug-induced heart failure.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability through defined injection techniques and quality control steps.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in cardiovascular programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on chronic cardiotoxicity profiling.
Implementation Considerations
- Required expertise in zebrafish handling, anesthesia, and intraperitoneal injection techniques.
- Need for fluorescent microscopy setup to assess transgenic cardiac reporters.
- Standardization of doxorubicin preparation, dosing, and fasting protocols across operators.
- Adaptation considerations for different zebrafish strains and genetic backgrounds.
- Practical limitation: variability in outcomes necessitates strict quality control and technician training to ensure reliability.
