הערכה של תפקוד כליות במודלים של העכבר של מחלת Glomerular

פרוטוקול זה מתאר של הכליה מלא עבודה מעלה כי צריך להתבצע במודלים של העכבר של מחלת glomerular. השיטות מאפשרים ניתוח פונקציונלי, מבניים מכניסטית מפורט של הפונקציה glomerular, אשר ניתן להחיל על כל הדגמים העכבר של המחלה glomerular.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המחלה הגלומרולרית לגבי הפנוטיפ התפקודי והמבני של הגלומרולוס ומאפשרת ניתוח מכניסטי של פתולוגיה של הכליות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא ניתנת להתאמה לכל המודלים המדורגים של מחלות גלומרולריות. להערכת יחס הקריאטינין של אלבומין בשתן, הכניסו עכבר זכר אחד בן שישה עד שמונה שבועות לכלוב עכבר מטבולי המכיל מים ומזון דיאטטי להעשרה בחדר שקט.

לאחר שש שעות, החזירו את העכבר לביתו הרגיל ואספו לפחות 50 מיקרוליטר מדגימת השתן הבסיסית מכל כלוב, וחזרו על איסוף השתן מפעם בשבוע לפעם בחודש. בסיום הניסוי, קצרו את הכליות מהבטן של כל בעל חיים ושטפו את האיברים ב-PBS קר כקרח. כדי לבחון את הגלומרולי בקליפת המוח, הסר וחתוך קוטב אחד של קליפת הכליה לחתיכות מילימטר מעוקב אחד.

כדי לבחון את הגלומרולי העמוק הסמוך, הסר וחתך חלק קטן מהמדולה לחתיכות מילימטר מעוקב אחד. לאחר מכן, הניחו את השברים מכל קטע רקמה לבקבוקוני מיקרוסקופ אלקטרונים בודדים המכילים חמישה מיליליטר של תמיסת גלוטרלדהיד 2.5% ואחסנו את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס. לצורך היסטולוגיה של הגלומרולי בקליפת המוח והסמיכות, הסר וקבע את השליש העליון של הכליה בחמישה מיליליטר של 4% פרפורמלדהיד בארבע מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.

לאחר מכן, העבירו את הרקמה הקבועה לחמישה מיליליטר של אתנול 70% למשך 24 שעות לפני ההטמעה בפרפין. לניתוח כימי אימונופלואורו של הגלומרולי בקליפת המוח והמדולרית, הנח שליש מהכליה בתבנית רקמה וטבל את הרקמה בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית. לאחר מכן, הניחו את התבנית על קרח יבש עד שהתרכובת קפואה ואחסנו את הדגימות בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס עד לחתכים.

לניתוח חלבון, הניחו שלוש על שניים חתיכות של קליפת הכליה לתוך צינורות פלסטיק של 0.5 מיליליטר והקפיאו את הדגימות בחנקן נוזלי לאחסון בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס. לאחסון רקמות לטווח ארוך לניתוח RNA, לאחר הקפאת הצמד של שלוש על שני חתיכות כליה מילימטר מעוקב כפי שהודגם זה עתה, הוסף חמישה נפחים של תמיסת ייצוב RNase לאחסון של 80 מעלות צלזיוס. לבידוד גלומרולי, פורסים את רקמת הכליה הנותרת ומניחים את חתיכות הרקמה בחמישה מיליליטר של תמיסת רינגר יונקים בתוספת אלבומין סרום בקר 1%, או BSA, על קרח לסינון מיידי.

כדי לבודד את הגלומרולי, ערמו מסננות עם גדלי נקבוביות מיקרון עולות על זכוכית והניחו את פרוסות הכליה על המסננת העליונה בגודל נקבוביות 425 מיקרון. לאחר מכן, השתמש בבוכנת מזרק ובתמיסת צלצול יונקים קרים טריים כקרח בתוספת 1% BSA כדי לרסק את רקמת הכליה דרך המסננת הראשונה. כאשר פיסות הכליה נדחפות דרכן, הסר את המסננת העליונה והמשך לדחוף את שברי הכליה דרך כל מסננת בתורו.

כאשר נותרו רק מסננות 100 ו-70 מיקרון, העבירו את הקציר הגלומרולרי שנשמר על ידי שתי המסננות האחרונות לצינור חרוטי של 50 מיליליטר עם 10 מיליליטר של תמיסת רינגר יונקים טריים בתוספת 1% BSA על קרח. פצלו שלושה מיליליטר של תרחיף הגלומרולי בין שני צינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר וגלולו את הגלומרולי על ידי צנטריפוגה. לאחר הסרת הסופרנטנט, הקפיאו את הגלומרולי בחנקן נוזלי לאחסון של 80 מעלות צלזיוס למיצוי חלבון ו-RNA מאוחר יותר.

לאחר מכן, הנח את תמיסת הגלומרולי הנותרת באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס להזרקה לאסדת חדירות מים גלומרולרית על במת מיקרוסקופ אור. לאחר לכידת גלומרולוס בודד שלם ושלם, שחררו קפסולת באומן ושברים צינוריים על ידי מיקרופיפטה, התחילו להקליט וחדרו את הגלומרולוס בתמיסת צלצול טרייה בתוספת 1% BSA. לאחר 30 שניות, העבר את הפרפוזה לתמיסת צלצול מרוכזת של 8% BSA.

לאחר 10 שניות של זילוף, העבר את הפרפוזה בחזרה לתמיסת צלצול BSA של 1% והפסק את ההקלטה. להדמיה מפורטת של התאים הגלומרולרים והמטריצה השיורית, יבש את דגימות קליפת הכליה הקבועות והמשובצות בפרפין ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה, ולאחר מכן דה-פרפיניזציה עם טבילות קסילן ואתנול יורדות. יש להחזיר את הדגימות למים מזוקקים למשך חמש דקות ולדגור את השקופיות בתמיסת חומצה תקופתית בארון אדים.

לאחר חמש דקות, שטפו את השקופיות בשלוש שטיפות של חמש דקות ב-100 מיליליטר מים מזוקקים, ולאחר מכן דגירה של 15 דקות במגיב של שיף. בתום הדגירה יש לשטוף את המגלשות במי ברז זורמים למשך חמש דקות ונגד כתמים עם המטוקסילין למשך שלוש שניות לפני שטיפה יסודית במי ברז זורמים למשך 15 דקות נוספות. לאחר מכן, ייבשו את המגלשות עם טבילות אתנול עולות ושתי טבילות קסילן רצופות של שלוש דקות.

לאחר ייבוש האוויר, ניתן להרכיב את השקופיות עם אמצעי הרכבה מבוסס קסילן להערכת המבנה הגלומרולרי שלהן על מיקרוסקופ אור בהגדלה של פי 400. גורם גדילה אנדותל כלי דם, או VEGF-A, עכברי נוקאאוט מפתחים אלבומינוריה מתקדמת ב-10 שבועות, בהשוואה לבקרות של בני זוג מסוג בר, בעוד שחיות נוקאאוט של VEGF165b מוגנות מפני מצב זה. לעכברי נוקאאוט VEGF-A יש חדירות מים גלומרולרית מוגברת משמעותית בהשוואה לבקרות מסוג בר, אשר ניצלת חלקית על ידי ביטוי יתר של VEGF-A165b.

צביעת חומצה שיף תקופתית של קטעי קליפת הכליה בעכברי נוקאאוט VEGF-A אינה מגלה חריגות מבניות גלומרולריות על ידי ניתוח מיקרוסקופ אור. עם זאת, לאחר ניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים, עכברי הנוקאאוט מדגימים רוחב קרום בסיס גלומרולרי מוגבר, ירידה במספר הפנסטרה האנדותלית, ירידה בכיסוי החלל של תת-פודוציטים ורוחב חריץ פודוציטים ממוצע מוגבר, בעוד שמספר החריצים הממוצע נותר ללא שינוי. ביטוי יתר של VEGF165b בחיות נוקאאוט VEGF-A מציל את השינויים בקרום הבסיס הגלומרולרי וברוחב החריץ.

עם זאת, ביטוי יתר של VEGF165b אינו משפיע על מספרי הפנסטרה שהשתנו או על כיסוי המרחב של תת-פודוציטים. RNA המופק מגלומרולי מסוננים מאשר ביטוי mRNA אנושי של VEGF165b בעכברי נוקאאוט עם ביטוי יתר של VEGF165b, בקורלציה עם ביטוי מופחת של VEGFR2 בעכברי נוקאאוט VEGF-A שניצל על ידי ביטוי יתר של VEGF165b בדפיקה בבעלי חיים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשלים בדיקת כליות מלאה להערכת מודל עכברי של מחלה גלומרולרי, כולל הערכה של החדירות הגלומרולרית הן לאלבומין והן למים.