Name: הערכה של תפקוד כליות במודלים של העכבר של מחלת Glomerular (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: למדו הערכה מקיפה של תפקוד כליות במודלי עכברים למחלות גלומרולריות. שיטה זו כוללת ניתוח פונקציונלי, מבני ומכני של הגלומרולוס, עם יישום למחקר VEGF ופתולוגיות כלייתיות שונות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי קרן לב הבריטי ריצ'רד ברייט VEGF מחקר לבטוח, את MRC.

<ol><li>Humtstrom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+structural+kidney+damage+in+spontaneously+hypertensive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hypertension%22%5BJournal%5D)">Development of structural kidney damage in spontaneously hypertensive rats.</a> Journal of Hypertension. 30 (6), 1087-1091 (2012).</li>
<li>Kitada, M., Ogura, Y., Koya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+of+diabetic+nephropathy%3A+their+utility+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nephrology+and+Renovascular+Disease%22%5BJournal%5D)">Rodent models of diabetic nephropathy: their utility and limitations.</a> International Journal of Nephrology and Renovascular Disease. 14 (9), 279-290 (2016).</li>
<li>Tesch, G. H., Lim, A. K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21147843">Recent insights into diabetic renal injury form the db/db mouse model of type 2 diabetic nephropathy.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (2), F301-F310 (2011).</li>
<li>Fogo, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+FSGS%3A+lessons+for+pathogenesis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Animal models of FSGS: lessons for pathogenesis and treatment.</a> Seminars in Nephrology. 23 (2), 161-171 (2003).</li>
<li>Stevens, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28574576">VEGF-A165b protects against proteinuria in a mouse model with progressive depletion of all endogenous VEGF-A splice isoforms from the kidney.</a> Journal of Physiology. 595 (19), 6281-6298 (2017).</li>
<li>Cosgrove, D., Kalluri, R., Miner, J. H., Segal, Y., Borza, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choosing+a+mouse+model+to+study+the+molecular+pathobiology+of+Alport+glomerulonephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Kindey+International%22%5BJournal%5D)">Choosing a mouse model to study the molecular pathobiology of Alport glomerulonephritis.</a> Kindey International. 71 (7), 615-618 (2007).</li>
<li>Kujal, P., Vernerova, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5%2F6+nephrectomy+as+an+experimental+model+of+chronic+renal+failure+and+adaptation+to+reduced+nephron+number%5BTitle%5D)+AND+%22Ceskoslenska+Fysiologuie%22%5BJournal%5D)">5/6 nephrectomy as an experimental model of chronic renal failure and adaptation to reduced nephron number.</a> Ceskoslenska Fysiologuie. 57 (4), 104-109 (2008).</li>
<li>Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ureteral+obstruction+as+a+model+of+renal+interstitial+fibrosis+and+obstructive+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy.</a> Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).</li>
<li>Oltean, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF165b+overexpression+restores+normal+glomerular+water+permeability+in+VEGF164-overexpressing+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">VEGF165b overexpression restores normal glomerular water permeability in VEGF164-overexpressing adult mice.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (7), F1026-F1036 (2012).</li>
<li>Salmon, A. H., Neal, C. R., Bates, D. O., Harper, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+growth+factor+increases+the+ultrafiltration+coefficient+in+isolated+intact+Wistar+rat+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial growth factor increases the ultrafiltration coefficient in isolated intact Wistar rat glomeruli.</a> Journal of Physiology. 570 (Pt 1), 141-156 (2006).</li>
<li>Zheng, F., Striker, G. E., Esposito, C., Lupia, E., Striker, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain+differences+rather+than+hyperglycemia+determine+the+severity+of+glomerulosclerosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Strain differences rather than hyperglycemia determine the severity of glomerulosclerosis in mice.</a> Kidney International. 54 (6), 1999-2007 (1998).</li>
<li>Betz, B., Conway, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update+on+the+use+of+animal+models+in+diabetic+nephropathy+research%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Diabetes+Reports%22%5BJournal%5D)">An update on the use of animal models in diabetic nephropathy research.</a> Current Diabetes Reports. 16 (18), (2016).</li>
<li>Savin, V. J., Terreros, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filtration+in+single+isolated+mammalian+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Filtration in single isolated mammalian glomeruli.</a> Kidney International. 20 (2), 188-197 (1981).</li>
<li>Neal, C. R., Crook, H., Bell, E., Harper, S. J., Bates, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+glomeruli+by+electron+microscopy+reveals+a+distinct+restrictive+urinary+subpodocyte+space%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of glomeruli by electron microscopy reveals a distinct restrictive urinary subpodocyte space.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 16 (5), 1223-1235 (2005).</li>
<li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blot%3A+technique%2C+theory%2C+and+trouble+shooting%5BTitle%5D)+AND+%22North+American+Journal+of+Medicine+%26+Science%22%5BJournal%5D)">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> North American Journal of Medicine & Science. 4 (9), 429-434 (2012).</li>
<li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).</li>
<li>Adembri, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sepsis+induces+albuminuria+and+alterations+in+the+glomerular+filtration+barrier%3A+a+morphofunctional+study+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Sepsis induces albuminuria and alterations in the glomerular filtration barrier: a morphofunctional study in the rat.</a> Critical Care. 15 (6), R277(2011).</li>
<li>Ma, S. T., Liu, D. L., Deng, J. J., Niu, R., Liu, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+arctiin+on+glomerular+filtration+barrier+damage+in+STZ-induced+diabetic+nephropathy+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Phytotherapy+Research%22%5BJournal%5D)">Effect of arctiin on glomerular filtration barrier damage in STZ-induced diabetic nephropathy rats.</a> Phytotherapy Research. 27 (10), 1474-1480 (2013).</li>
<li>Oltean, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+growth+factor-A165b+is+protective+and+restores+endothelial+glycocalyx+in+diabetic+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial growth factor-A165b is protective and restores endothelial glycocalyx in diabetic nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 26 (8), 1889-1904 (2015).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocyte-specific+overexpression+of+GLUT1+surprisingly+reduces+mesangial+matric+expansion+in+diabetic+nephropathy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Podocyte-specific overexpression of GLUT1 surprisingly reduces mesangial matric expansion in diabetic nephropathy in mice.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 299 (1), F91-F98 (2010).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול זה מתאר של הכליה מלא עבודה מעלה כי צריך להתבצע במודלים של העכבר glomerular המחלה, הפעלת כמות עצומה של מידע לגבי הכליה ובפונקציה glomerular כדי לקבל עכבר אחת. השלבים הקריטיים בכל שיטה לאפשר ניתוח פונקציונלי, מבניים מכניסטית מפורט של הפונקציה glomerular, כולל הערכה של החדירות של הכליות בכללותה (uACR ופלסמה קריאטינין מידות), החדירות של glomeruli בודדים (glomerular LpA / Vאני), בדיקה של שינויים מבניים (PAS Trichrome כחול, EM), חלבון לוקליזציה (אם), וכן ביטוי גנים glomerular (RT-PCR ו סופג המערבי). שיטות אלה הם המפתח אישיותי של הפונקציה glomerular במודלים של העכבר של מחלת כליות.
כאשר מעריכים את החדירות של GFB, מחקרים רבים שבחרו להשתמש קונבנציונלית uACR או 24 שעות אלבומין הפרשה קצב אמצעי יעיל17,18. למרות שיטות אלה מאפשרות הערכת החדירות GFB בכללותה, זה אינו מאפשר הערכת הפרט חדירות glomerular והגיוון בין glomeruli. מחקרים קודמים מצאו מדידה של glomerular LpA / Vi להיות מדד רגיש יותר לשינויים GFB חדירות5,9. אכן, בתוצאות נציג הפגינו בעיתון הזה, ב- 14 שבועות לכתוב אינדוקציה של קו VEGF-A, VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b עכברים יש של uACR נמוך באופן משמעותי בהשוואה ל- VEGF-A KO עכברים; אולם, תוצאה זו אינה משתקפת במלואה בתביעות glomerular LpA / Vאני מדידות, איפה VEGF-A165b לא משמעותית מנעו מגדילה GFB חדירות (איור 1 ואיור 2)5. זה מראה את החשיבות של שימוש מבחני מרובים כדי להעריך את החדירות הכליות וגם את החדירות של glomeruli בודדים. יתר על כן, glomerular LpA / Vאני oncometric assay מרמז כי החדירות של הפרט glomeruli מן הכליה באותו יכול להשתנות במידה רבה, במיוחד מחלות מודלים5,10, 19. מגבלה אחת כדי למדוד את glomerular LpA / Vאני הוא כי זה ניתן לבצע אך ורק במובילים ניסיוני; לפיכך, מדידות uACR רגילה נדרשים לתת אינדיקציה מובילים ניסיוני.
בנוסף הערכת של פנוטיפ פונקציונלי, השיטה הנוכחי מעודד גם הערכה של פנוטיפ ultrastructural מבניים. ניתן לבצע זאת באמצעות מבחר של כתמים כגון PAS, trichrome, כתמי כסף; כל אחד כדי להעריך היבטים שונים של המורפולוגיה glomerular. במודלים חריפה של מחלת glomerular, שבדרך כלל המקרה במודלים של העכבר, הוא יכול להיות קשה לזהות חריגות מבנית הגדולות באמצעות הכתמים האלה אלא אם כן אתה פתולוג מיומן כליות. לכן, בביצוע EM הוא הציע כדי להעריך את ultrastructure של GFB, אשר מאפשר את המדידה כמותית של פרמטרים כגון GBM, אנדותל fenestrae גודל, מספר וכן המאפיינים podocyte. מדידות כאלה דורשים הכשרה מינימלית כדי לבצע ומאפשר החוקר לקבוע את-הסוגים/מבנה התא מושפע מודל המחלה. כך, בדוגמה המוצגת בתוצאות נציג, העכבר VEGF-A KO נמצאה להיות דוגמנית מתון של מחלת glomerular, אין מומים מבניים עיקריים היו נוכחים בעת צביעת PAS. עם זאת, ספציפית podocyte VEGF-A קו זירוז את שינויים GBM, podocytes, תאי אנדותל כשבוחנים את אולטרה-מבנה glomerular5. למרבה הצער, ההכנה של הכליה EM שמתואר בשיטת ההווה אינו מאפשר זיהוי של glycocalyx אנדותל, אשר ידוע גם להיות השפעות משמעותיות על החדירות של GFB19. כדי למדוד במדויק את העומק glycocalyx, הכליות צריך להיות perfuse-קבועה עם 2.5% גלוטראלדהיד עם 1% Alcian כחול glycocalyx אנדותל labelling, כפי שמתואר ואחOltean19.
פעם היה להעריך את פנוטיפ פונקציונלי ומבניים, וצריך להעריך את דפוסי ביטוי/הפעלה של גנים שונים מסלולים ואז בפרט glomeruli. הערכת אולטרה מבניים מוקדמת יכול לתת מידע על התא מעורב, המציין אם podocyte אנדותל ספציפיים או גנים/מסלולים צריך להיבדק glomerular/סוגי מבנים. לדוגמה, בתוצאות נציג של העכברים VEGF-A KO, ירידה במספר fenestrae אנדותל נצפתה (איור 3D); לכן, הביטוי glomerular חלבון של סמן אנדותל ידוע להיות מעורב מסלול VEGF-A נבחנה; VEGFR-2 (איור 4B)5. בנוסף הביטוי של חלבונים ב glomeruli, לוקליזציה שלהם גם להיות visualized באמצעות אם. במחקר על-ידי ג'אנג ואח20, ביטוי ספציפי podocyte של GLUT1 אושרה podocytes על ידי אם שותף ההתאמה לשפות אחרות של GLUT1 מוגברת עם podocin.
לעומת שיטות אלטרנטיביות הציג בספרות כדי להעריך את הפונקציה glomerular, השימוש בשיטת המתוארות במאמר זה כדי להעריך את תפקוד הכליות במודלים של העכבר של מחלת glomerular מאפשר את פנוטיפ glomerular להערכה מלאה של היבטים מרובים. באמצעות שיטה זו, החוקר הוא מסוגל לקבוע את פנוטיפ הכליה של הדגם ולהעריך את המנגנון באשר למה מפתחת פנוטיפ. זה מידע חיוני על המנגנון של המחלה נדרש בעת בחינת אפיקים טיפולית פוטנציאל במודלים אלה. בשיטה זו ניתן בקלות ליישם בעתיד חקירות פונקציה glomerular הערכה של המחלה פנוטיפים ואת הרפוי פוטנציאליים.
לסיכום, פרוטוקול זה כלליים וישימה מתאר כליות מלא עבודה-up עבור העכבר מודלים של המחלה glomerular, הפעלת כמות עצומה של מידע לגבי הכליה ובפונקציה glomerular כדי לקבל עכבר אחת. השיטות מאפשרים ניתוח פונקציונלי, מבניים מכניסטית מפורט של הפונקציה glomerular, אשר ניתן להחיל על כל הדגמים העכבר של המחלה glomerular.

השימוש של מודלים מאתר לחקות מחלת כליות האדם הופך נפוץ יותר ויותר. הדגמים מאתר כזה כוללים מודלים ספונטנית כגון באופן ספונטני עם יתר לחץ דם עכברושים (שומר)1, streptozotocin (STZ)-induced סוכרתית חולדות, עכברים2והקלד db/db בעכברים סוכרתיים II3, מודלים מהונדס גנטית כגון ראשי ספציפי podocyte מוקד סגמנטלי glomerular טרשת נפוצה (FSGS) מודלים4, podocyte ספציפיים כלי הדם צמיחה אנדותל (VEGF-A) הנוק-אאוט (קו VEGF-A) דגם5, תסמונת אלפורט מודלים6והיא רכשה מודלים כגון כריתת כליה 5/67 ו- ureteral חד צדדית את החסימה (UUO) מודל8. על מנת להעריך את ההיבטים השונים של הפונקציה glomerular במודלים אלה, מספר טכניקות זמינים. מטרת הנייר בשיטה זו היא להדגים מקיף העבודה מעלה כי יש לבצעו במודלים של העכבר של מחלת כליות כדי להעריך באופן מלא פונקציה glomerular.
הרציונל מאחורי השימוש בשיטה זו הוא שהם מאפשרים את פנוטיפ glomerular להערכה מלאה היבטים מרובים. זה כולל הערכת את החדירות glomerular, חלבון וגם כדי מים, מומים מבניים glomerular ו שינויים הביטוי/שחבור של mRNAs, חלבונים חיוניים לתפקוד נורמלי glomerular. באמצעות שיטה זו, החוקר הוא מסוגל לקבוע את פנוטיפ הכליה של הדגם ולהעריך את המנגנון באשר למה מפתחת פנוטיפ. זה מידע חיוני על המנגנון המחלה, אשר נדרש בעת בחינת אפיקים טיפולית פוטנציאל במודלים אלה.
בספרות, זה תופעה שכיחה יוצגו עם דגם העכבר של מחלת glomerular איפה פנוטיפ נקבעת על-ידי רמה מוגברת של אלבומין בשתן. עם זאת, אין עדות לכך כי שיטה אחת לקביעת glomerular פונקציה אינה תמיד יעילה; מדידת קצב הפרשת אלבומין בדרכי השתן או על יחס השתן אלבומין קריאטינין (uACR) רק מספק מידע על תפקוד הכליות הכולל, ולא מתוך glomeruli בודדים. מחקרים קודמים הראו כי החדירות יכול להשתנות glomeruli שונה מן באותה כליה5,9,10. בנוסף, הערכה של החדירות של הפרט glomeruli היא דרך רגישה יותר להעריך פונקציית glomerular; הטכניקה של מדידה של חדירות מים glomerular בודדים (LpA / Vאני) הראתה להיות רגיש יותר לשינויים בתפקוד glomerular מאשר מדידה uACR9. Assay הזה הוא מועיל במודלים עכבר, כי הם עמידים בפני פרוטאינוריה, כגון אלה על רקע c57BL/611. היתרון של המאמר הנוכחי של השיטה היא כי זה בוחן הן את החדירות כליות מוחלטת כדי אלבומין, כמו גם את החדירות glomerular בודדים למים.
בחינה של מומים מבניים glomerular מוערך לעתים קרובות על ידי סוללה של כתמים כגון חומצה המחזורית שיף (PAS), trichrome, ואת כתמי כסף. אלה מאפשרים כליות פתולוג מיומן להעריך את הרמה של מחלת כליות באמצעות שיטת הניקוד. למרות כל שיטות טובות, שינויים במבנה-המאקרו glomerular הם לא תמיד נצפו אי-ספיקת כליות חריפה מודלים12. שיטה זו מציעה כי בנוסף בביצוע טכניקות היסטולוגיה כליות שתוארו לעיל, האולטרה-המבנה glomerular גם וצריך להעריך באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים (EM). פקעית מוכתם יכול להיראות נורמלי יחסית במיקרוסקופ אור רגיל; עם זאת, בעת הערכת עם EM, שינויים קטנים רוחב גלומרולרי במרתף (GBM), podocyte הרגל תהליך הצטנעות, fenestrations אנדותל וכיסוי של sub-podocyte שטח ניתוח. לכן חיוני כי glomerular אולטרה-מבנה והן -מבנה שקובעת כדי לקבוע המנגנון של תפקוד glomerular.
בנוסף להערכת מומים מבניים glomerular, שינויים ב- mRNA, ביטוי חלבונים שחבור, וכן הפעלת חלבון (למשל, זרחון), צריך להיבדק להבהיר עוד יותר על מנגנוני המחלה glomerular. כאשר מסתכלים על מחלת glomerular, או, לדוגמה, כאשר קו/over-expressing גן בפרט glomerular תאים, כגון ספציפי podocyte VEGF-A KO העכבר5, זה חשוב כי השינויים חלבון ה-mRNA נבדקים רק בהישג תאים glomerular, לא כל הכליה. פרוטוקול זה מתאר שיטה שבה glomeruli מבודדים מן קליפת הכלייה העכבר, ולאחר מכן החלבון/רנ א הם מבודדים. זה מאפשר ניתוח ספציפי של dysregulation חלבון/mRNA glomeruli של מודל המחלה.
פרוטוקול זה מתאר של הכליה מלא עבודה מעלה כי צריך להתבצע במודלים של העכבר glomerular המחלה, הפעלת כמות עצומה של מידע לגבי הכליה ובפונקציה glomerular כדי לקבל עכבר אחת. השיטות מאפשרים ניתוח פונקציונלי, מבניים מכניסטית מפורט של הפונקציה glomerular, אשר ניתן להחיל על כל הדגמים העכבר של המחלה glomerular.

<table><tbody><tr><td>כלובים מטבוליים</td><td>מנגנון הרווארד</td><td>52-6731</td><td></td></tr><tr><td>Tris buffered מלח (10x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5912-1L</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין עכבר ELISA סט כימות</td><td>מעבדות Bethyl</td><td>E90-134</td><td></td></tr><tr><td>TMB ELISA תמיסת מצע</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>34028</td><td></td></tr><tr><td>חומצה גופרתית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>339741</td><td></td></tr><tr><td>SPECTRstar nano</td><td>BMG Labtech</td><td>SPECTRstar nano או שווה ערך</td><td></td></tr><tr><td>RNAפתרון ייצוב מאוחר יותר</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM7020</td><td></td></tr><tr><td>4-15% ג'ל חלבון טרומי</td><td>BIORAD</td><td>4568084</td><td></td></tr><tr><td>4x Laaemmli מאגר דגימה</td><td>BIORAD</td><td>161-0747</td><td></td></tr><tr><td>מיני תא טרנס-כתם</td><td>BIORAD</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris מאגר ריצה</td><td>BIORAD</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie צבע כחול מבריק</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>Creatinine Companion</td><td>Exocell</td><td>1012 רצועה צלחת</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת גלוטראלדהיד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>נתרן קקודילאט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0250</td><td></td></tr><tr><td>10x פוספט חוצץ מלח</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אצטט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>342483</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום גופרתי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>D(+) גלוקוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>EDTA צינורות איסוף דם</td><td>BD</td><td>367835</td><td></td></tr><tr><td>23-25G מחט</td><td>BD</td><td>PMC0735</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקון זכוכית 10 מ"ל</td><td>תומאס סיינטיפיק</td><td>0914X10</td><td></td></tr><tr><td>פלקון 10 מ"ל צינורות פוליפרופילן</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10110101</td><td></td></tr><tr><td>0.5 מ"ל צינורות</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10681894</td><td></td></tr><tr><td>תבניות רקמות חד פעמיות</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22-363-553</td><td></td></tr><tr><td>ערכת חיתוך כירורגי לעכבר</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13-005-204</td><td></td></tr><tr><td>חיתוך אופטימלי בינוני</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyde</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>צינורות נימי זכוכית</td><td>מכשיר הרווארד</td><td>EC1 64-0770</td><td></td></tr><tr><td>אסדת חדירות גלומרולרית</td><td>שנבנתה באוניברסיטת בריסטול - לא זמינה באופן מסחרי</td><td>ציטוט של אסדת LpA: Salmon et al. 2006; J. מסננות</td> נירוסטה פיזיול <td></td></tr><tr><td></td><td>Cole-Parmer</td><td>WZ-59984</td><td></td></tr><tr><td>מערכת צביעה תקופתית של חומצה-שיף (PAS)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>395B-1KT</td><td></td></tr><tr><td>המטוקסילין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H3136</td><td></td></tr><tr><td>קסילן</td><td>MerckMillipore</td><td>108298</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות פולי-הכנה</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P0425-72EA</td><td></td></tr><tr><td>הרכבה בינונית</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>8030</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת טטרוקסיד אוסמיום</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>75632</td><td></td></tr><tr><td>שרף רדיט</td><td>אגר מדעי</td><td>CY212</td><td></td></tr><tr><td>אורניל אצטט</td><td>אגר מדעי</td><td>AGR1260A</td><td></td></tr><tr><td>עופרת ציטראט</td><td>אגר AGR1210</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>לדוגמה 957000H</td><td></td></tr><tr><td>עט הידרופובי</td><td>Abcam</td><td>ab2601</td><td></td></tr><tr><td>Nephrin (1243-1256) נוגדן</td><td>Acris</td><td>BP5030</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Podocin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0372-200UL</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>550274</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor נוגדן משני</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A32732</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield הרכבה מדיום עם DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>NP40 מאגר ליזה תאים</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FNN0021</td><td></td></tr><tr><td>עצירת מעכב פרוטאז ופוספטאז קוקטייל</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78437X4</td><td></td></tr><tr><td>10x מאגר העברה</td><td>BIORAD</td><td>1610734</td><td></td></tr><tr><td>PVDF ממברנה</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC2002</td><td></td></tr><tr><td>נוגדנים משניים מצומדים HRP</td><td>Abcam</td><td>ab6721</td><td></td></tr><tr><td>ECF מצע למערב ספוג</td><td>פישר</td><td>10713387</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>M-MLV טרנסקריפטאז הפוך ניו</td><td>אינגלנד Biolabs</td><td>M053S</td><td></td></tr><tr><td>Oligo dT</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18418012</td><td></td></tr><tr><td>פריימרים אקראיים</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>48190011</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18427088</td><td></td></tr><tr><td>מעכב ריבונוקלאז</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>DEPC Water</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9915G</td><td></td></tr><tr><td>מיזרוסקופ אור פלואורסצנטי</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J Analysis Software</td><td>Image J</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR Thermocycler</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM מיקרוסקופ</td><td>בריטניקה</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הערכה של תפקוד כליות במודלים של העכבר של מחלת glomerular

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

השימוש של מודלים מאתר לחקות מחלת כליות האדם הופך נפוץ יותר ויותר. המחקר שלנו מתמקדת להערכת הפונקציה glomerular סוכרת כלייתית ועכברים podocyte ספציפיים של VEGF הנוק-אאוט; לכן, פרוטוקול זה מתאר כליות מלא העבודה לשימוש במעבדה שלנו לצורך הערכת מודלים אלה העכבר glomerular המחלה, הפעלת כמות עצומה של מידע לגבי הכליה ובפונקציה glomerular כדי לקבל עכבר אחת. לעומת שיטות אלטרנטיביות הציג בספרות כדי להעריך את הפונקציה glomerular, השימוש בשיטת המתוארים במאמר זה מאפשר את פנוטיפ glomerular להערכה מלאה היבטים מרובים. באמצעות שיטה זו, החוקר יכול לקבוע את פנוטיפ הכליה של הדגם ולהעריך את המנגנון באשר למה מפתחת פנוטיפ. זה מידע חיוני על המנגנון של המחלה נדרש בעת בחינת אפיקים טיפולית פוטנציאל במודלים אלה. השיטות לאפשר להערכה תפקודית מפורט של המכשול glomerular סינון באמצעות מדידה של השתן אלבומין קריאטינין יחס חדירות מים glomerular בודדים, וכן בדיקה מבנית והן אולטרה מבנית באמצעות חומצה המחזורית שיף הכתם מיקרוסקופ אלקטרונים. יתר על כן, ניתוח של dysregulated גנים ברמת mRNA, חלבון מאפשר ניתוח מכניסטית של הפונקציה glomerular. פרוטוקול זה מתאר את השיטות כלליים אבל יכולת הסתגלות ניתן להחיל על כל הדגמים העכבר של המחלה glomerular.

שתן נאסף באמצעות כלובים מטבוליים פראי סוג (WT), inducible podocyte ספציפיים של VEGF מדהימה (קו VEGF-A), VEGF-A קו X Neph-VEGF165b עכברים (VEGF-A KO עכברים המבטאים יתר על המידה את isoform b VEGF-A אנושי165ב podocytes ב אופן המכונן). על מדידה של יחס השתן אלבומין קריאטינין שבועות 0, 4, 10 ו- 14 לאחר דוקסיציקלין אינדוקציה של VEGF-A קו, קו VEGF-A עכברים שפיתח albuminuria מתקדמת 10 שבועות לעומת WT littermate שולט. ניתן לראות את הערכים המוחלטים איור 2A, ו מנורמל לקו הבסיס של כל הערכים העכבר איור 2B. עם זאת, albuminuria, לא נצפו בעכברים VEGF-A X Neph-VEGF-A165b (איור 2), המציין את VEGF-A165b הוא מגן הדגם של albuminuria5.
Glomerular LpAVאני נמדד glomeruli בודדים sieved מ- WT, קו VEGF-A ו VEGF-A X Neph-VEGF-A165b הכליות. דוגמה איך נתפסת פקעית הצטמקות נצפתה כאשר perifused עם 8% BSA מוצג איור 3 א. הצטמקות זה משמש לאחר מכן כדי לקבוע את glomerular LpA / Vאני עבור כל פקעית (איור 3B). עכברים KO VEGF-A היה משמעותי מוגברת glomerular LpA / Vאני בגיל 14 שבועות להציב אינדוקציה VEGF-קו בהשוואה WT שליטה glomeruli. למרות התחתון בעכברים VEGF-A X Neph-VEGF-A165b, מוגברת glomerular LpA / Vאני לא סוכלה ע י ביטוי יתר של VEGF-A165b ב- 14 שבועות5.
צביעת PAS סעיפים קליפת הכלייה 14 שבועות לאחר אינדוקציה של VEGF-A קו שלא גילתה שום מומים מבניים glomerular בעכברים VEGF-A קו או VEGF-A X Neph-VEGF-A165b (איור 4A). עם זאת, לאחר ניתוח של האולטרה-מבנה glomerular ויה EM, עכברים VEGF-A קו היה שפותחה על רוחב GBM גדל ירד מספר fenestrae אנדותל, ירד SPS כיסוי, עלה הממוצע podocyte חתך רוחב (איור 4C-4F ). כף הרגל podocyte הממוצע לעבד רוחב ומספר חריצים נותר ללא שינוי (איור 3B ו- 3g). ביטוי יתר של VEGF-A165b בעכברים VEGF-A KO מנעה את השינויים כדי GBM ולאחר חתך רוחב (איור 4C ו- 4F). עם זאת, VEGF-A165b לא היתה השפעה על fenestrae שינו את המספר של SPS כיסוי (איור 4D ו- 4E)5.
RT-PCR שבוצעה ב- RNA מופק sieved glomeruli גילה כי האדם VEGF-165לחצ mRNA קיים רק בעכברים VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b (איור 5A). בעת חילוץ חלבון sieved glomeruli והערכה רמות חלבונים באמצעות סופג המערבי, ביטוי חלבונים glomerular של VEGFR-2 נמצאה הניתנות להפחתה בעכברים VEGF-A קו, אשר נמנעה על ידי ביטוי יתר של VEGF-A165b ( איור 5B ו- 5 C)5.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig1.jpg"> איור 1. Diagrammatic הקים של המתקן glomerular חדירות (Lpא). (א) פקעית נתפס (ב') micropipette בתוך מחזיק באמצעות שאיבה, אשר היא להדק על הר ליציבות. (ג) microslide מלבני. (ד) 4 X מטרת מיקרוסקופ עם מצלמת וידאו. (ה) 1% פתרון BSA התחמם עד 37 מעלות צלזיוס. (נ) 8% BSA פתרון התחמם עד 37 מעלות צלזיוס. (G) מרחוק הקש על שורות המכילות perifusate שני לה להתנהגות, מה שמקנה exchange perifusate מהירה. המסלול (H) של perifusate לכיוון microslide, אשר לאחר מכן מתרחץ של פקעית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig2.jpg"> באיור 2. השתן אלבומין קריאטינין יחס. (א) הערכים uACR שבועות 0, 4, 10 ו- 14 לאחר אינדוקציה של VEGF-A KO בעכברים b165WT, קו VEGF-A ו VEGF-A X Neph-VEGF-A. (ב') אותם ערכים uACR מנורמל לערך בסיסית (לשבוע 0) של כל עכבר בודדות. UACR גדל באופן משמעותי בעכברים VEGF-A KO שבועות 10 ו- 14 לעומת WT littermate שולט, אשר נמנעה בעכברים b165VEGF-A X Neph-VEGF-A (* p &lt; 0.05; אנובה דו-כיווני, תיקון להשוואה בין זוגות; n = 4-12 עכברים לכל נקודת זמן; קווי שגיאה: שגיאת התקן של הממוצע [SEM]). איור זה השתנה מ סטיבנס ואח5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig3.jpg"> איור 3. מידת חדירות מים glomerular. (א) פקעית נתפס. את micropipette באמצעות שאיבה; perifusate הוא החליף מ- 1% BSA (Ai) 8% BSA (כל), התכווצות glomerular נצפית. (B) מדידות נלקח לפני ואחרי הבורר BSA 8% משמשים כדי לקבוע את glomerular LpA / Vאני. (ג) עכברים VEGF-A KO לפתח של מוגברת glomerular LpA / Vאני בגיל 14 שבועות להציב אינדוקציה של VEGF-A קו לעומת WT שולט. זה לא היה משמעותי מנעה בעכברים VEGF-A X Neph-VEGF-A, b165(* p &lt; 0.05; דרך אחת ANOVA, Bonferroni תיקון להשוואה בין זוגות; n = 4-9 עכברים, glomeruli 15-30; קווי שגיאה: SEM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig4.jpg"> באיור 4. ניתוח מבנה glomerular. (א) צביעת PAS של קליפת הכלייה לא מצביעים על חריגות מבנית ב glomeruli מ- WT, קו VEGF-A ו VEGF-A X Neph-VEGF-A165b עכברים (Ai - iii). EM גילה מומים מבניים אולטרה ב glomeruli VEGF-A KO (Aiv - vi). (ב') FPW הממוצע לא השתנו בין קבוצות. (ג) ה GBM גדל glomeruli VEGF-A KO, אשר נמנעה על ידי VEGF-A165ב' (ד) מספר fenestrae ירדו ב VEGF-A KO glomeruli, אשר נותרה שהודעה על ידי VEGF-A165 (E) נולד ב- SPS הכיסוי היתה ירידה ב VEGF-A KO glomeruli, אשר גם נשאר ללא שינוי על ידי VEGF-A165ב' (נ) הממוצע חתך רוחב הוגדל ב VEGF-A KO glomeruli, אשר נמנעה על ידי VEGF-A165ב' (G) המספר שסע היה ללא שינוי בין שלוש הקבוצות (* p &lt; 0.05; דרך אחת ANOVA, Bonferroni תיקון להשוואה בין זוגות; n = 3 עכברים, 9 glomeruli; קווי שגיאה: SEM). איור זה השתנה מ סטיבנס ואח5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig5.jpg"> איור 5. ביטוי mRNA וחלבון סמנים. (א) RT-PCR הראה כי הביטוי mRNA b165VEGF-A האנושי היה רק ניכר glomeruli sieved מ- VEGF-A קו X Neph-VEGF-A165b עכברים. (B) סופג המערבי ציין כי ביטוי חלבון VEGFR-2 היה למטה מוסדר ב VEGF-A KO glomeruli, אשר נמנעה ב VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b glomeruli (* p &lt; 0.05; דרך אחת ANOVA, Bonferroni תיקון להשוואה בין זוגות; n = 3 - 6 עכברים; קווי שגיאה: SEM). איור זה השתנה מ סטיבנס ואח5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

פרוטוקול זה מתאר של הכליה מלא עבודה מעלה כי צריך להתבצע במודלים של העכבר של מחלת glomerular. השיטות מאפשרים ניתוח פונקציונלי, מבניים מכניסטית מפורט של הפונקציה glomerular, אשר ניתן להחיל על כל הדגמים העכבר של המחלה glomerular.

הערכה של תפקוד כליות במודלים של העכבר של מחלת Glomerular

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המחלה הגלומרולרית לגבי הפנוטיפ התפקודי והמבני של הגלומרולוס ומאפשרת ניתוח מכניסטי של פתולוגיה של הכליות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא ניתנת להתאמה לכל המודלים המדורגים של מחלות גלומרולריות. להערכת יחס הקריאטינין של אלבומין בשתן, הכניסו עכבר זכר אחד בן שישה עד שמונה שבועות לכלוב עכבר מטבולי המכיל מים ומזון דיאטטי להעשרה בחדר שקט.לאחר שש שעות, החזירו את העכבר לביתו הרגיל ואספו לפחות 50 מיקרוליטר מדגימת השתן הבסיסית מכל כלוב, וחזרו על איסוף השתן מפעם בשבוע לפעם בחודש. בסיום הניסוי, קצרו את הכליות מהבטן של כל בעל חיים ושטפו את האיברים ב-PBS קר כקרח. כדי לבחון את הגלומרולי בקליפת המוח, הסר וחתוך קוטב אחד של קליפת הכליה לחתיכות מילימטר מעוקב אחד.כדי לבחון את הגלומרולי העמוק הסמוך, הסר וחתך חלק קטן מהמדולה לחתיכות מילימטר מעוקב אחד. לאחר מכן, הניחו את השברים מכל קטע רקמה לבקבוקוני מיקרוסקופ אלקטרונים בודדים המכילים חמישה מיליליטר של תמיסת גלוטרלדהיד 2.5% ואחסנו את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס. לצורך היסטולוגיה של הגלומרולי בקליפת המוח והסמיכות, הסר וקבע את השליש העליון של הכליה בחמישה מיליליטר של 4% פרפורמלדהיד בארבע מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.לאחר מכן, העבירו את הרקמה הקבועה לחמישה מיליליטר של אתנול 70% למשך 24 שעות לפני ההטמעה בפרפין. לניתוח כימי אימונופלואורו של הגלומרולי בקליפת המוח והמדולרית, הנח שליש מהכליה בתבנית רקמה וטבל את הרקמה בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית. לאחר מכן, הניחו את התבנית על קרח יבש עד שהתרכובת קפואה ואחסנו את הדגימות בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס עד לחתכים.לניתוח חלבון, הניחו שלוש על שניים חתיכות של קליפת הכליה לתוך צינורות פלסטיק של 0.5 מיליליטר והקפיאו את הדגימות בחנקן נוזלי לאחסון בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס. לאחסון רקמות לטווח ארוך לניתוח RNA, לאחר הקפאת הצמד של שלוש על שני חתיכות כליה מילימטר מעוקב כפי שהודגם זה עתה, הוסף חמישה נפחים של תמיסת ייצוב RNase לאחסון של 80 מעלות צלזיוס. לבידוד גלומרולי, פורסים את רקמת הכליה הנותרת ומניחים את חתיכות הרקמה בחמישה מיליליטר של תמיסת רינגר יונקים בתוספת אלבומין סרום בקר 1%, או BSA, על קרח לסינון מיידי.כדי לבודד את הגלומרולי, ערמו מסננות עם גדלי נקבוביות מיקרון עולות על זכוכית והניחו את פרוסות הכליה על המסננת העליונה בגודל נקבוביות 425 מיקרון. לאחר מכן, השתמש בבוכנת מזרק ובתמיסת צלצול יונקים קרים טריים כקרח בתוספת 1% BSA כדי לרסק את רקמת הכליה דרך המסננת הראשונה. כאשר פיסות הכליה נדחפות דרכן, הסר את המסננת העליונה והמשך לדחוף את שברי הכליה דרך כל מסננת בתורו.כאשר נותרו רק מסננות 100 ו-70 מיקרון, העבירו את הקציר הגלומרולרי שנשמר על ידי שתי המסננות האחרונות לצינור חרוטי של 50 מיליליטר עם 10 מיליליטר של תמיסת רינגר יונקים טריים בתוספת 1% BSA על קרח. פצלו שלושה מיליליטר של תרחיף הגלומרולי בין שני צינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר וגלולו את הגלומרולי על ידי צנטריפוגה. לאחר הסרת הסופרנטנט, הקפיאו את הגלומרולי בחנקן נוזלי לאחסון של 80 מעלות צלזיוס למיצוי חלבון ו-RNA מאוחר יותר.לאחר מכן, הנח את תמיסת הגלומרולי הנותרת באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס להזרקה לאסדת חדירות מים גלומרולרית על במת מיקרוסקופ אור. לאחר לכידת גלומרולוס בודד שלם ושלם, שחררו קפסולת באומן ושברים צינוריים על ידי מיקרופיפטה, התחילו להקליט וחדרו את הגלומרולוס בתמיסת צלצול טרייה בתוספת 1% BSA. לאחר 30 שניות, העבר את הפרפוזה לתמיסת צלצול מרוכזת של 8% BSA.לאחר 10 שניות של זילוף, העבר את הפרפוזה בחזרה לתמיסת צלצול BSA של 1% והפסק את ההקלטה. להדמיה מפורטת של התאים הגלומרולרים והמטריצה השיורית, יבש את דגימות קליפת הכליה הקבועות והמשובצות בפרפין ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה, ולאחר מכן דה-פרפיניזציה עם טבילות קסילן ואתנול יורדות. יש להחזיר את הדגימות למים מזוקקים למשך חמש דקות ולדגור את השקופיות בתמיסת חומצה תקופתית בארון אדים.לאחר חמש דקות, שטפו את השקופיות בשלוש שטיפות של חמש דקות ב-100 מיליליטר מים מזוקקים, ולאחר מכן דגירה של 15 דקות במגיב של שיף. בתום הדגירה יש לשטוף את המגלשות במי ברז זורמים למשך חמש דקות ונגד כתמים עם המטוקסילין למשך שלוש שניות לפני שטיפה יסודית במי ברז זורמים למשך 15 דקות נוספות. לאחר מכן, ייבשו את המגלשות עם טבילות אתנול עולות ושתי טבילות קסילן רצופות של שלוש דקות.לאחר ייבוש האוויר, ניתן להרכיב את השקופיות עם אמצעי הרכבה מבוסס קסילן להערכת המבנה הגלומרולרי שלהן על מיקרוסקופ אור בהגדלה של פי 400. גורם גדילה אנדותל כלי דם, או VEGF-A, עכברי נוקאאוט מפתחים אלבומינוריה מתקדמת ב-10 שבועות, בהשוואה לבקרות של בני זוג מסוג בר, בעוד שחיות נוקאאוט של VEGF165b מוגנות מפני מצב זה. לעכברי נוקאאוט VEGF-A יש חדירות מים גלומרולרית מוגברת משמעותית בהשוואה לבקרות מסוג בר, אשר ניצלת חלקית על ידי ביטוי יתר של VEGF-A165b.צביעת חומצה שיף תקופתית של קטעי קליפת הכליה בעכברי נוקאאוט VEGF-A אינה מגלה חריגות מבניות גלומרולריות על ידי ניתוח מיקרוסקופ אור. עם זאת, לאחר ניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים, עכברי הנוקאאוט מדגימים רוחב קרום בסיס גלומרולרי מוגבר, ירידה במספר הפנסטרה האנדותלית, ירידה בכיסוי החלל של תת-פודוציטים ורוחב חריץ פודוציטים ממוצע מוגבר, בעוד שמספר החריצים הממוצע נותר ללא שינוי. ביטוי יתר של VEGF165b בחיות נוקאאוט VEGF-A מציל את השינויים בקרום הבסיס הגלומרולרי וברוחב החריץ.עם זאת, ביטוי יתר של VEGF165b אינו משפיע על מספרי הפנסטרה שהשתנו או על כיסוי המרחב של תת-פודוציטים. RNA המופק מגלומרולי מסוננים מאשר ביטוי mRNA אנושי של VEGF165b בעכברי נוקאאוט עם ביטוי יתר של VEGF165b, בקורלציה עם ביטוי מופחת של VEGFR2 בעכברי נוקאאוט VEGF-A שניצל על ידי ביטוי יתר של VEGF165b בדפיקה בבעלי חיים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשלים בדיקת כליות מלאה להערכת מודל עכברי של מחלה גלומרולרי, כולל הערכה של החדירות הגלומרולרית הן לאלבומין והן למים.

assessment-of-kidney-function-in-mouse-models-of-glomerular-disease

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

מדידה של קצב סינון גלומרולרי (GFR) היא תקן הזהב להערכת תפקוד כליות. כאן אנו מתארים שיטת תפוקה גבוהה המאפשרת קביעת GFR בעכברים מודעים באמצעות זריקה אחת בולוס, קביעת isothiocyanate ההעמסה (FITC)-אינולין בפלזמה וחישוב GFR ידי מודל דעיכה מעריכית שני שלבים.

שיטת תפוקה גבוהה למדידה של קצב סינון הגלומרולרי בעכברים בהכרה

אנו מתארים מודלים של פגיעה בכליות הנגרמות איסכמיה reperfusion בינוניות וקשות שבו העכברים עוברים הידוק חד צדדי ואחרי כריתת כליה הנגדית בו זמנית או עיכוב, בהתאמה pedicle כליות. מודלים אלה נותנים באופן עקבי עלייה לפגיעה בתפקוד הכלייתי וסיסטיק לאחר פציעה, אך חומרת פציעה והישרדות תלויות ברקע, גיל וכירורגי ציוד עכבר.

דגם איסכמיה reperfusion של פגיעה חריפה בכליות ופגיעים ההודעה פיברוזיס בעכברים

מודל העכבר של פגיעה חוזרת באיסכמיה כלייתית המתואר כאן מורכב מכריתת כליה ימנית המספקת רקמת בקרה והידוק של פדיקל הכליה השמאלי כדי לגרום לאיסכמיה הגורמת לפגיעה כלייתית חריפה. מודל זה משתמש בגישת לפרוטומיה בקו האמצע כאשר כל השלבים מבוצעים באמצעות חתך אחד.

כליות איסכמיה reperfusion פגיעה: במודל עכבר של הפגיעה והתחדשות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לחקר האימונולוגיה של דחייה. המודל הכירורגי הציג דוחות על זמן ניתוח קצר וטכניקה תמציתית. בהתאם לשילוב הזן של התורם-מקבל, הכליה המושתלת עלולה לפתח דחייה תאית חריפה או נזק כרוני לאלוגרפט, המוגדר על ידי פיברוזיס אינטרסטיציאלי וניוון צינור.

השתלת כליה עכבר: מודלים של דחיית השתל

קביעת קצב הסינון הגלומרולרי (GFR) היא תקן הזהב להערכת תפקוד הכליות הכללי. עם זאת, הליכים מסורתיים למדידת פרמטר זה הם מסורבלים ודורשים השקעה גדולה של זמן. כאן אנו מתארים שיטה מהירה וזעיר פולשנית לקביעת GFR דרך העור.

הערכת Transcutaneous של תפקוד כלייתי במכרסמי Conscious

כאן נתאר פרוטוקול כדי למדוד את קצב הסינון glomerular (GFR), בהכרה, לנוע בחופשיות עכברים באמצעות צג GFR דרך העור.

Transdermal מדידה של קצב הסינון Glomerular בעכברים

מאמר זה מתאר שיטה עבור culturing וניתוח החוצה הקודקוד הקודקודית תא האפיתל של פקולי כדורית מבודדים מכליה העכבר. שיטה זו יכולה לשמש לחקר מסלולים המעורבים התפשטות התא הקודקודית והגירה.

בלתי מימדית כמו לשעבר שיטת Vivo לנתח מסלולים מעורב הקודקוד הקודקודית התא ההפעלה

כאן אנו מציגים פרוטוקול המשתמש במיקרוסקופיה של 2 פוטונים בחולדות Wistar Fromter במינכן עם גלומרולי פני השטח כדי לכמת את ההשפעות של חסימת שופכה ממושכת על הדינמיקה והתפקוד של גלומרולרי.

שימוש במיקרוסקופיה של 2-פוטונים כדי לכמת את ההשפעות של חסימת שופכה חד-צדדית כרונית על תהליכים גלומרולריים

פרוטוקול זה מפרט את השלבים הכירורגיים של יצירת פיסטולה עורקית איליאק משותפת. פיתחנו מודל זה כדי לחקור פתופיזיולוגיה של הגפיים הקשורות להמודיאליזה.

מודל מורין של המודיאליזה גישה לתפקוד לקוי של היד

מחקר זה מציג מערך קל לשימוש, שלם ופשוט של שיטות לתייג ולנתח גלומרולי מכליות עכבר שעברו ניקוי מעוקב. נתונים כגון מספר גלומרולוס ונפח ניתן להשיג בקלות ובאמינות באמצעות fluorescein isothiocyanate (FITC)-Dextran, מיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון אור (LSFM), או מיקרוסקופ קונפוקלי נפוץ ותוכנה כגון Imaris.

שיטה יעילה ומהירה לתיוג וניתוח גלומרולי עכבר

מאמר זה מציג מודל CKD איסכמי המשתמש ב-IRI כלייתי חד-צדדי עם נפרקטומיה נגדית שבוצעה יום לפני איסוף הדגימה; פרוטוקול זה מאפשר הערכה פונקציונלית מבוססת סרום, הישרדות גבוהה ופתולוגיה של CKD ניתנת לשחזור ב-28 ו-42 ימים, ומספק פלטפורמה גמישה למחקרים מכניים והתערבותיים.

מודל העכבר של מעבר ממחלת כליות חריפה לכרונית שנגרם מאיסכמיה כליתית/פגיעה ברפרפוזיה

למדו הערכה מקיפה של תפקוד כליות במודלי עכברים למחלות גלומרולריות. שיטה זו כוללת ניתוח פונקציונלי, מבני ומכני של הגלומרולוס, עם יישום למחקר VEGF ופתולוגיות כלייתיות שונות.

הערכה של תפקוד כליות במודלים של העכבר של מחלת Glomerular

גלה סרטונים נוספים