שיטות הגילוי של תרכובות הרומן להתכוונן קולטן גאמא אמינו בוטירית הקלד עצבית

המטרה הכוללת של סרטון זה היא להמחיש מפל סינון המאפשר גילוי של ליגנדים חדשים של קולטני GABA-A. היתרון בשימוש בקשירת רדיוליגנד, רישום אלקטרופיזיולוגי בביציות קסנופוס ובפרוסות מוח של מכרסמים בצורה ספרותית הוא שניתן לשפר את פרופיל התרכובת. בסופו של דבר, מזוהים תת-סוג חזק, תרכובות סלקטיביות ויעילות.

הדגמה זו תבוצע על ידי קומיקו קמברה וג'נה טוגנצ'יני, כמו גם סוניה ודניאל ברטרנד מ-HiQScreen ומארי קלייר פלימלין מרוש. הזרקו 10 עד 50 ננוליטר מהתמיסה המכילה פלסמיד באמצעות מחט מיקרו-הזרקת זכוכית בקוטר קצה של עד 100 מיקרומטר המותקנת על מיקרומניפולטור המצויד במערכת פליטת לחץ או במערכת הזרקה אוטומטית. כדי להתחיל בהליך זה, שמור את הביציות על 17 מעלות צלזיוס כדי למנוע ביטוי של חלבוני הלם חום.

אחסן את המיקרופלייט באזור אחסון מבוקר תרמית. לאחר מכן, ממיסים את תרכובות הבדיקה, שנבדקו חיוביות בבדיקת הקישור ב-OR2, ב-0.1 ו-1000 מיקרו-מולר לרישומים אלקטרופיזיולוגיים והשליכו אותן לצלחת פוליפרופילן בעלת תחתית שטוחה של 96 בארות. כדי לבצע שתי אלקטרודות כרךtagמהדק הקלטה, הנח צלחת המכילה את הביציות על המערכת האוטומטית.

תכנת את מערכת ההקלטה האוטומטית באמצעות הממשק מבוסס הסמלים עם סכימה זו לקביעה המתאימה של יחסי פעילות הריכוז. להתאמת עקומה, באמצעות עקומת הפעלת הריכוז המאוירת, שרטט את משרעת הזרם כפונקציה של הלוגריתם של ריכוז האגוניסט. לרישום אלקטרופיזיולוגי, שמור את המוח בתמיסת dACSF מבעבעת עם קרבוגן בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, נתחו את תצורת ההיפוקמפוס השמאלית בעזרת מרית דקה. לאחר מכן, חתך שקופיות רוחביות בעובי 400 מיקרומטר מהחלק החציוני של ההיפוקמפוס עם קוצץ רקמות. בעזרת מברשת ציור מעבירים את הפרוסות לתא ההקלטה ושומרים אותן בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות.

לאחר מכן, יש לחלחל את הפרוסות עם rACSF מבעבע בקרבוגן ב -35 מעלות צלזיוס ובקצב של 1.5 מיליליטר לדקה. כדי לתעד עלייה באוכלוסייה בודדת, הנח פרוסת מוח בתא המותקן במיקרוסקופ. מחדירים את הפרוסה עם rACSF בקצב של שלושה מיליליטר לדקה.

בעזרת מושך הפיפטה, משוך מיקרופיפטה מזכוכית בורוסיליקט עם התנגדות של כשני מגה-אוהם. מלאו את המיקרופיפטה בתמיסה המכילה שני נתרן כלורי מולארי והניחו אותה במחזיק הפיפטה. מקם את המיקרו-פיפטה המקליטה בשכבה הפירמידלית באזור CA1 של פרוסת ההיפוקמפוס באמצעות המיקרומניפולטור הימני.

לאחר מכן, הנח אלקטרודת אירידיום פלטינה דו-קוטבית מבודדת לתוך המחזיק במיקרומניפולטור השמאלי. מקם את אלקטרודת הגירוי בבטחונות Schaffer באזור CA1 של פרוסת ההיפוקמפוס באמצעות המיקרומניפולטור השמאלי. באמצעות מחולל הגירוי, העבירו פולס זרם לאלקטרודת הגירוי כל 30 שניות והגדילו בהדרגה את עוצמת הגירוי עד להופעת עלייה באוכלוסייה.

התאם את עוצמת הגירוי כדי לעורר עלייה באוכלוסייה המתאימה ל-45% מהמשרעת המקסימלית שניתן להשיג. כדי לבצע עיכוב דופק מזווג, העבירו שני פולסים זרמים לאלקטרודת הגירוי כל 30 שניות באמצעות מחולל הגירוי. הגדר את עוצמת הגירוי כך שתעורר עלייה באוכלוסייה המתאימה ל-45% מהמשרעת המקסימלית.

כדי לבדוק את התרכובות, בצע דילולים של התרכובות שייבדקו ב-ACSF כך שהריכוז הסופי של DMSO לא יהיה גבוה מ-0.1%הוסף DMSO לתמיסת הבקרה באותו ריכוז כמו בתמיסת התרכובת. רשום עלייה בודדת או זוגית באוכלוסיית הדופק המעוררת על ידי גירויים נלווים של Schaffer כל 30 שניות למשך 30 דקות לפחות. צורת ספייק האוכלוסייה צריכה להיות יציבה במהלך תקופת בסיס זו.

לאחר מכן, הכינו עם rACSF קרבוגן המכיל ריכוז קבוע של התרכובת לבדיקה והזלגו את פרוסת ההיפוקמפוס בתמיסה במהלך רישום קוצים של אוכלוסיית דופק בודדת או זוגית. כמו כן, העריכו את ההתאוששות מאפקט התרכובת על ידי החדרת הפרוסה ב-rACSF קרבוגן ללא התרכובת. מוצג כאן ייצוג סכמטי של פרוסת היפוקמפוס של חולדה, הביטחונות של Schaffer שמקורם באקסונים של תאים פירמידליים CA3 המוקרנים על הארבוריזציה הדנדריטית של נוירוני הפירמידה CA1.

מיקרו-פיפטות הוצבו בשכבה הפירמידלית כדי לתעד את עליות האוכלוסייה ובשכבה הרדיאטומית לרישום דנדריטי של פוטנציאלים פוסט-סינפטיים מעוררי שדה. אלקטרודת הגירוי הוצבה בתוך הביטחונות של שפר. איור זה מציג קפיצות אוכלוסייה המעוררות על ידי הגירויים הזוגיים המופעלים באמצעות אותה אלקטרודה מגרה במרווח של 20 אלפיות השנייה.

תגובת האוכלוסייה לגירוי השני היא בעלת משרעת קטנה יותר מזו של התגובה לגירוי הראשון. עליות באוכלוסייה נרשמו בהיעדר ונוכחות של בטא CCM, NAM קולטן GABA A לא סלקטיבי. בטא CCM שיפר את המשרעת של ספייק האוכלוסייה השני על ידי חסימה חלקית של כל עיכוב גבארגי הזנה קדימה.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו בפרמקוקינטיקה, תפוסת קולטנים ויעילות in vivo ופרמקולוגיה בטיחותית על מנת לענות על שאלות נוספות כמו פוטנציאל לפיתוח קליני של התרכובות שזוהו.