Name: שיטות הגילוי של תרכובות הרומן להתכוונן קולטן גאמא אמינו בוטירית הקלד עצבית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: למד שיטות גילוי תרכובות חדשות לקולטני GABA A באמצעות אוגיות Xenopus ופרוסות מוח מכרסמים. השיטה משלבת רישום אלקטרופיזיולוגי לזיהוי ליגנדים סלקטיביים ויעילים לפיתוח תרופות נוירולוגיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים תודה ג'ודית לינגל, מריה Karg, Grégoire פריץ, רחל Haab, ו מארי קלייר Pflimlin של רוש ו שר סרט דבורה Paolucci מ- HiQScreen לקבלת סיוע טכני מעולה שלהם.

<ol><li>Rudolph, U., Knoflach, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+classical+benzodiazepines%3A+novel+therapeutic+potential+of+GABAA+receptor+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Beyond classical benzodiazepines: novel therapeutic potential of GABAA receptor subtypes.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10, 685-697 (2011).</li>
<li>Sieghart, W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7568326">Structure and pharmacology of g-aminobutyric acidA receptor subtypes.</a> Pharmacological Reviews. 47, 181-234 (1995).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19090692">A high-throughput functional assay for characterization of g-aminobutyric acidA channel modulators using cryopreserved transiently transfected cells.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 781-786 (2008).</li>
<li>Mennerick, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+voltage-sensitive+dyes+modulate+GABAA+receptor+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Diverse voltage-sensitive dyes modulate GABAA receptor function.</a> Journal of Neuroscience. 30, 2871-2879 (2010).</li>
<li>Hevers, W., Luddens, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diversity+of+GABAA+receptors.+Pharmacological+and+electrophysiological+properties+of+GABAA+channel+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">The diversity of GABAA receptors. Pharmacological and electrophysiological properties of GABAA channel subtypes.</a> Molecular Neurobiology. 18, 35-86 (1998).</li>
<li>Macdonald, R. L., Olsen, R. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7516126">GABAA receptor channels.</a> Annual Review of Neuroscience. 17, 569-602 (1994).</li>
<li>Kemp, J. A., Marshall, G. R., Wong, E. H., Woodruff, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+affinities%2C+potencies+and+efficacies+of+some+benzodiazepine-receptor+agonists%2C+antagonists+and+inverse-agonists+at+rat+hippocampal+GABAA-receptors%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The affinities, potencies and efficacies of some benzodiazepine-receptor agonists, antagonists and inverse-agonists at rat hippocampal GABAA-receptors.</a> British Journal of Pharmacology. 91, 601-608 (1987).</li>
<li>Prenosil, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+subtypes+of+GABAA+receptors+mediate+phasic+and+tonic+forms+of+inhibition+in+hippocampal+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Specific subtypes of GABAA receptors mediate phasic and tonic forms of inhibition in hippocampal pyramidal neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 96, 846-857 (2006).</li>
<li>Ballard, T. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18936916">RO4938581, a novel cognitive enhancer acting at GABAA a5 subunit-containing receptors.</a> Psychopharmacology. 202, 207-223 (2009).</li>
<li>Knoflach, F., Hernandez, M. C., Bertrand, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAA+receptor-mediated+neurotransmission%3A+Not+so+simple+after+all%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">GABAA receptor-mediated neurotransmission: Not so simple after all.</a> Biochemical Pharmacology. 115, 10-17 (2016).</li>
<li>Gielen, M. C., Lumb, M. J., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzodiazepines+modulate+GABAA+receptors+by+regulating+the+preactivation+step+after+GABA+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Benzodiazepines modulate GABAA receptors by regulating the preactivation step after GABA binding.</a> Journal of Neuroscience. 32, 5707-5715 (2012).</li>
<li>Bergmann, R., Kongsbak, K., Sorensen, P. L., Sander, T., Balle, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23308109">A unified model of the GABAA receptor comprising agonist and benzodiazepine binding sites.</a> PLoS One. 8, 52323(2013).</li>
<li>Richter, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diazepam-bound+GABAA+receptor+models+identify+new+benzodiazepine+binding-site+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Diazepam-bound GABAA receptor models identify new benzodiazepine binding-site ligands.</a> Nature Chemical Biology. 8, 455-464 (2012).</li>
<li>Rudolph, U., Crestani, F., Mohler, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11282419">GABAA receptor subtypes: dissecting their pharmacological functions.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 22, 188-194 (2001).</li>
<li>Wisden, W., Seeburg, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAA+receptor+channels%3A+from+subunits+to+functional+entities%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">GABAA receptor channels: from subunits to functional entities.</a> Current Opinion in Neurobiology. 2, 263-269 (1992).</li>
<li>Davies, C. H., Davies, S. N., Collingridge, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired-pulse+depression+of+monosynaptic+GABA-mediated+inhibitory+postsynaptic+responses+in+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Paired-pulse depression of monosynaptic GABA-mediated inhibitory postsynaptic responses in rat hippocampus.</a> The Journal of Physiology. 424, 513-531 (1990).</li>
<li>Karnup, S., Stelzer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+overlap+of+excitatory+and+inhibitory+afferent+input+in+guinea-pig+CA1+pyramidal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Temporal overlap of excitatory and inhibitory afferent input in guinea-pig CA1 pyramidal cells.</a> The Journal of Physiology. 516, Pt 2 485-504 (1999).</li>
<li>Turner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feed-forward+inhibitory+potentials+and+excitatory+interactions+in+guinea-pig+hippocampal+pyramidal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Feed-forward inhibitory potentials and excitatory interactions in guinea-pig hippocampal pyramidal cells.</a> The Journal of Physiology. 422, 333-350 (1990).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflügers Archiv. 391, 85-100 (1981).</li>
<li>Adelsberger, H., Brunswieck, S., Dudel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Block+by+picrotoxin+of+a+GABAergic+chloride+channel+expressed+on+crayfish+muscle+after+axotomy%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Block by picrotoxin of a GABAergic chloride channel expressed on crayfish muscle after axotomy.</a> European Journal of Neuroscience. 10, 179-187 (1998).</li>
<li>Hapfelmeier, G., et al. <a target="_blank" href="https://dokupdf.com/download/isoflurane-slows-inactivation-kinetics-of-rat-recombinant-122l-gabaa-receptors-enhancement-of-gabaergic-transmission-despite-an-open-channel-block-_5a034a51d64ab2b9bdf8bbd0_pdf">Isoflurane slows inactivation kinetics of rat recombinant a1b2g2L GABAA receptors: enhancement of GABAergic transmission despite an open-channel block.</a> Neuroscience Letters. 307, 97-100 (2001).</li>
<li>Bertrand, S., Bertrand, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+electrophysiological+characterization+of+neuronal+nicotinic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Overview of electrophysiological characterization of neuronal nicotinic acetylcholine receptors.</a> Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 11, Unit11 17(2004).</li>
</ol>

המחברים פרדריק Knoflach והרננדז מריה-Clemencia עובדים של פ הופמן-La Roche AG, 4070 באזל, שוויץ, חברת תרופות. הסופר דניאל ברטרנד הוא עובד של HiQScreen Sàrl 6, כביש דה Compois, 1222 Vésenaz ז'נבה, מתן שרותים ההקרנה לחברות התרופות.

הפיתוח של תרכובות הרומן פעיל תעלת יונים ממותגת ליגנד כגון קולטני GABAA דורש השימוש של מספר גישות. בדרך כלל, הצעד הראשון בדרך כלל מתבצע באמצעות מבחני הכריכה; עם זאת, מדידות כאלה אינם מספיקים לאפיין את פעילות פיזיולוגית של המתחם או פרמקולוגיה המדויק שלו. בפרט, מתחם זה נקשר לקולטן עשוי לשפר או לעכב את תפקידה או אפילו לייצר אין השפעה תפקודית (להיות שקט) (קרי, לאגד הקולטן מבלי לשנות את תפקידו). לכן, בדיקה פונקציונלית נדרש עבור אפיון מלא המורכב.
מבחני האיגוד: היתרון העיקרי של איגוד וזמינותו היא כי זה יכול להיות יעיל נערך על מספר רב של דוגמאות הנעות עד כמה אלפים, שהיא מספקת הזיקות מחייב עבור מולקולות פעילים. כמתואר להלן, הצעד הראשון מורכב להקמת שיטה להערכה מסוגי המשנה קולטן הרצוי. כלומר, בעוד איגוד יכול להתבצע על קולטנים יליד שברים או המוח כולו, השיטה תמנע הקביעה של הזיקות-קולטן ספציפי יחוברו. לכן, צורך להשתמש מערכות רקומביננטי מסך מולקולות על המטרה הרצויה. כיום, תרביות תאים ארעי או יציבה של cDNAs יחידת משנה קולטן הרצויים בשורות תאים מציע שיטה יעילה ואמינה לבטא את תת-סוגי קולטן עניין (למשל, GABAA α5β3γ2). שימוש מסורתי מחייב לבצע מבחני radioligands, אבל כיום טכניקות זמינים זה למנוע את אי הנוחות של טיפול רדיואקטיביות (למשל, כמותי מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית ליגנד מחייב).
ביטוי תפקודית במערכת מחשב מארח: כדי לבטא את הגנים במערכת המחשב המארח, רצף קידוד עניין להוסיף לתוך פלסמיד המכיל את באמרגנים נאותה. בדרך כלל, עבור במבחנה סינתזת mRNA, משמשים את באמרגנים חיידקי T7 או T6. עבור ביטוי cDNA, שעתוק של הגן עניין להיות מפוקח על ידי promotor איקריוטים כגון CMV (cytomegalovirus) או שווה ערך. כיום, מספר פלסמידים, כולל את שני באמרגנים (כלומר, pUNIV, pCMV-6AC, psf-CMV/T7, pCI-neo, pcDNA), הם זמינים, המאפשר סינתזה של במבחנה של mRNA או ביטוי cDNA כמוצג באיור15. ביטוי של קולטני GABAA ניתן להשיג בנאמנות שורות תאים או צפרדע רפואית oocytes. היתרונות העיקריים של האחרונים הם העדר ביטוי הקולטן אנדוגני, הפשטות של מניפולציות, והזמינות של מערכת אוטומטית עבור מיקרו-זריקות והקלטות. בהליכים המתוארים תחת פרוטוקול זה להדגים את היעילות של מערכת אוטומטית אשר מאפשר ההזרקה של 96 oocytes כ 7 דקות והוא דורש כישורים המיקרומניפולציה. לזכור כי שחלה יחיד מ צפרדע רפואית מכילה בין 10,000-30,000 oocytes, ברור כי מספר גדול של מדידות התא יכול להתבצע על תכשיר יחיד. יתר על כן, כפי ביטוי יכול להתבצע באמצעות זריקות cDNA, פלסמידים באותו המכיל את הגנים של עניין זה מפותחים עבור הניסויים איגוד יכול לשמש עבור אפיון פונקציונלי ללא צורך נוסף בביולוגיה מולקולרית מניפולציות.
בהינתן גודל גדול וביטוי משטח גבוהה, oocyte יחיד מניבה מספר קולטנים אשר שווה בקירוב ל התאים confluent 35 מ מ פטרי. עם זאת, הזרקת והכנה oocytes מייצג חלק של העלות של קו תא, כמו הניסויים אינן דורשות מדיום תרבות מסוים ומניפולציות סטרילי. ההפעלה של ערוץ GABAA אחד מניב מספר picoamperes (10-12), זרמי הנעות עד עשרות microampere (10-6) נרשמות בקלות oocyte יחיד, אשר מאשר את הפעילות בו-זמני של מספר מיליוני קולטנים במהלך תשובה בודדת.
שלב ראשוני האפיון של תעלות יונים ממותגת ליגנד לעתים קרובות הקביעה של זיקה לכאורה של הקולטנים. הניסויים צריכים להתנהל מורכב החלה סדרה של פולסים מבחן בקצרה אגוניסט של התוויית את משרעת של עורר הנוכחי או, במקרים מסוימים, האזור מתחת העקומה (AUC) כפונקציה של הלוגריתם של ריכוז אגוניסט. כמו שזה ריאלי בקלות כדי microinject שונים פלסמיד ריכוזים, יחס מאותה אצווה של oocytes, מערכת זו של הביטוי מתאים במיוחד אפיון כזה. יתר על כן, השוואה אצווה-כדי-אצווה חשף רמה גבוהה של יציבות עבור s50EC שונים. השפעת ההרכב יחידה משנית על זיקה נראית לעין של הקולטן הוא מדמיין בקלות באמצעות מזימה עכביש, למשל, באיור10.
התוצאות של המלחציים שני-אלקטרודה מתח בשנת oocytes צפרדע רפואית מושווה לעתים קרובות עם הקלטות שבוצעו באמצעות אלקטרודות מלחציים תיקון. בעוד שזה יגיע מעבר להיקף העבודה הזאת להיכנס השוואה מפורטת בין שתי מערכות אלה, אפשר לבחון כמה נקודות. מלחציים תיקון בתאים מציעה יתרונות עבור אפיון biophysical עם יישום מהיר סמים, לדרישות שלו מורכבים יותר מאלה של ההקלטות שני-אלקטרודה צפרדע רפואית oocytes. קושי שעצירת והראשון הוא הביטוי של חלבון נתון בצורך של תרבות תא, הציעה שתושב זמני או תרביות תאים יציב, וזיהוי של התאים הם ביטוי הבונה הרצוי. בנוסף, היא הכרחית כדי לבחון את התרומה אפשרי של הביטוי אנדוגני בתא נחשב. יתר על כן, הקלטה מלחציים תיקון מחייב אדם מיומן לנהל את המיקרומניפולציה תחת מיקרוסקופ הגדלה גבוהה, בעוד אותו אדם גם צריך לבצע ניתוח נאותה במהלך הניסוי כדי להעריך, לדוגמה, האיכות של החותם. ההתנגדות גישה וכו לעומת זאת, מלחציים שני-אלקטרודה מתח הקלטה, במיוחד אחד באמצעות מערכת אוטומטית אלקטרופיזיולוגיות, אינו דורש שום כישורים ספציפיים, יכול להתבצע על ידי טכנאי מעבדה.
בעת רכישת של הגדרת אלקטרופיזיולוגיות, שיקול העלות היא ללא ספק גורם חשוב שצריך להיות מנותח בקפידה. לדוגמה, בעוד העלות של מערכת אוטומטית היא גבוהה יחסית, השוואה קרוב יותר מגלה כי ההתקנה של מעטה אלקטרופיזיולוגיות מלאה כולל קניית ציוד כגון micromanipulators טוב, עדשה דו-עינית, מגבר, זלוף המערכת, טבלת אנטי רטט, תוך רכישת נתונים וביצוע ניתוח גם. עלות השוואה בין שני-אלקטרודה מתח קלאמפ הגדרת נגד הפללה מלחציים תיקון מגלה אי-התאמות עוד יותר. יתר על כן, המערכת האוטומטית מציעה את היתרון של ציוד ממוחשב ופועל ללא התערבות יום ולילה.
המאפיינים תרופתי של תרכובת נקבעים על ידי פעולתה על הקולטן. לדוגמה, מעכבי תחרותי הם מולקולות יכולים להזין את היד לכיס איגוד, או באתר orthosteric, כמו אגוניסט עצמו גורם תחרות. מעכבי שאינו תחרותי הם תרכובות המעכבות את קולטני על ידי אינטראקציה באתר אחר, במקרה של ערוץ יונים ממותגת ליגנד, שניתן להזין או לחסום הנקבובית יוניים, לדוגמה. זה ילך מעבר להיקף עבודה זו לבחון את מנגנוני שונים של אינטראקציה, אך בהמשך ניתן לקבל מידע מתוך ספר לימוד תרופתי ו/או מהעבודה אחרים כגון ברטרנד, ברטראן22.
במקרה של allosteric מאפננים, איגודים תרכובת-אתר שהוא נבדל באתר orthosteric, אבל הנוכחות של המולקולה משנה מחסום האנרגיה בין המדינות פעיל ועוד. חיובי allosteric מאפננים (PAMs) הם תרכובות להפחית את מחסום אנרגיה מן המנוחה למצב הפעיל ולשפר, לכן, ההשפעה של אגוניסט. כדי לאפיין תופעות אפשריות פאם, יש, לכן לקבוע אם חשיפה למתחם משפר את התגובה אגוניסט,, ואם כן, על איזה ריכוז. הניסויים המוצגים באיור 11 ו -14 איור להמחיש פרוטוקולים יכול לשמש בהצלחה עבור אפיון PAMs על קולטני GABAA .
במקרים מסוימים, חשיפה פאם לבד עשויה להספיק להפעיל את הקולטנים. פעילות כזו יכולה להיקבע על ידי שינוי קל של פרוטוקול ניסיוני המוצג כאן. כלומר, במקום באמצעות יישום שיתוף של אפנן במהלך החשיפה גאבא, הפרוטוקול יכול להיות שונה עבור היישום של הראשונה המתחם לבד ולאחר מכן בנוכחות גאבא. אפיון של הפעילות אגוניסט ישיר ייעשה על ידי קביעת משרעת של התגובה עורר על ידי המתחם עצמו, לעומת הנוכחי עורר-GABA.
ניסויים שנערכו פרוסות המוח, כגון מאויר ב איור 7, משמשים כדי לאשר מתחם פעילות מקורית קולטנים במעגל מעכבות מובהק לפני שנמשיך הלאה במודלים של בעלי חיים, לאורך השביל לכיוון בניסויים קליניים. פרוטוקול הקלטה וניתוח נתונים פשוטים יחסית מאפשר הדירוג של תרכובות מרובים על-ידי הערכת השפעתם modulatory דיפרנציאלית על PS משרעת. אפקטים שאינם ספציפיים של תרכובות שאינן קשורות למערכת גאבא עשוי גם להיות שזוהו (למשל, כאשר שינויים בצורת PS מובחנות). ישירה, GABAergic עצבית יכול להידרש במקרים אלה על ידי מדידת ההשפעות של תרכובות על זרמי מעכבות postsynaptic (IPSCs) באמצעות טכניקה קלאמפ8תאים כל תיקון.

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים על הגילוי של חומרים פעילים על קולטני GABAA , מן הכריכה פיזיולוגיה, פרמקולוגיה. חפש את הרומן מולקולות ספציפיות עבור קולטני GABAA , זה חיוני כדי להגדיר במדויק ככל האפשר, סוג המשנה של עניין את ההערכה של יחודיות של תרכובות שזוהה (ראהלמשל, לסקירה, רודולף ו Knoflach1או Sieghart2). נתיב אופייני. גילוי סמים ואת הצעדים שצריכים להיות מושגת מומחשים באיור1.
מבחני הכריכה, משמשים עדיין בעיקר בשלב הראשון של גילוי תרופות. במקרה של קולטני GABAA , והם ממוטבים לזהות תרכובות לאגד אתר איגוד בנזודיאזפינים של הקולטן איפה לאגד רפואית שימושי ובטוח סמים. טכניקות אחרות, באמצעות fluorometric הדמיה צלחת הקורא (FLIPR) ממברנה פוטנציאליים מבחני מבוסס-צבען אדום3, לזהות תרכובות כמו ברביטורטים לאגד לאתרים נוספים שהן לא רצויות בשל הפרופיל שלהם-לוואי בלתי רצויות. בנוסף, שימוש צבעים ניתן ישירות להפעיל קולטני GABAA , וכך לחקור את התועלת של אלה מבחני. גילוי סמים4. איגוד מבחני יכול לספק רק את הראיות זה תרכובת נתון באפשרותך לאגוד בשיעור קולטן ספציפי. במבחנה מבחני עם קרום התא משמשים לזיהוי האדם סלקטיבי GABAA α5β3γ2 קולטן ליגנדים. Transiently transfected תאים HEK293 לבטא את האדם GABAA α5β3γ2, α1β3γ2, α2β3γ2 ו α3β3γ2 רצפטורים משמשות היכונו ממברנות מבחני אלה. השפעת ליגנדים מזוהה על ידי מדידת את נצנוץ של פלומאזניל [3H] מחויב על קולטני ממברנה (עיכוב של איגוד פלומאזניל [3H]). היתרון העיקרי של שיטה זו הוא כי החלטה מהירה ויעילה של אהדה המתחם מחייב על הקולטן עניין מספק את הקולטן של עניין.
מחקרים פונקציונלי חיוניים כדי להעריך את פעילות פונקציונלית של תרכובות, להציע הסבר פיזיולוגי ותרופתי של המנגנונים נגרם על-ידי הכריכה של תרכובות הקולטנים. . היום, זה מוכרת היטב כי פונקציונלית קולטני GABAA הם תוצאה של ההרכבה של חמישה subunits סביב ציר של pseudosymmetry שהוקמה על ידי נקבובית יונית תוצאת מההרכבה חמש subunits זהים. רוב קולטני GABAA מורכבים של שניים או יותר subunits שונים. הקולטן נכשלים GABAA , למשל, מורכבת subunits α1, β2 γ2 ב סטויכיומטריה של 2, 2, ו-1 בהתאמה5,6. שיחזור מערכת המחשב המארח כמו צפרדע רפואית oocytes או תאים HEK293 מציעה את האפשרות במהירות לחקור את מאפייני קולטני תרופתי.
המאפיינים תרופתי של תרכובות נידונות ואז עם הקלטות חוץ-תאי המוח פרוסות7. שיטה זו מאפשר חקירה של ההשפעה של תרכובות על עצבית והוא מספק דרך יעילה כדי לאשר את ההשפעות פונקציונלי של תרכובות נחוש במערכות heterologous ביטוי ברמה של רצפטורים מקורי הכולל סביבת עצביים. GABAergic עצבית יכולה גם להיות מוערך ברמה המולקולרית על ידי מדידת ההשפעות של תרכובות על זרמי postsynaptic מעכבות (IPSCs)8. אבל הפרוטוקול המשמש כאן, המבוסס על הקלטות מלחציים תיקון שלם-תא פרוסות המוח הוא משוכלל יותר ותשואות של תפוקה נמוכה יותר.
לבסוף, היתרונות והחסרונות של ה במבחנה הקרנת אשד המשמש לצורך זיהוי ליגנדים α5β3γ2 סלקטיבית נדונים בפרספקטיבה של הטכניקות השונות והמגבלות מהותי שלהם. עבודה זו צריכה לספק מומחים שאינם מומחים בתחום של קולטני GABAA סקירה מועיל של השילוב בין גישות שונות במבחנה המשמש כדי להתמודד עם גילוי מאפננים החדש של תעלות יונים ממותגת ליגנד אלה.

<table><tbody><tr><td><חזק>ציוד כללי</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 קוצר תאי באר -(Filtermate 196)&nbsp;</td><td>פקארד</td><td></td><td>לסינון ממברנות עם מונה נצנוץ נוזלי של צלחת רדיוליגנד מיקרוטיטר כרוכה</td></tr><tr><td>(ספירה עליונה NXT)</td><td>פקארד</td><td></td><td>מיקרופלייט מונה נצנוץ וזוהר</td></tr><tr><td>בקבוקון מונה נצנוץ נוזלי בקבוקון (בטא-קוטר 2500 TR)</td><td>מונה נצנוץ וזוהר</td> <td>בקבוקון פקארד</td><td></td></tr><tr><td>נוזל&nbsp; מטפל (Biomek 2000)</td><td>בקמן קולטר</td><td></td><td>להכנת דילולים מורכבים</td></tr><tr><td>Vortex (Vortex Genie 2)</td><td>Scientific Industries Inc.</td><td></td><td>לערבב תמיסות מלאי מורכבות</td></tr><tr><td>הומוגנייזר רקמות (Polytron PT1200E)</td><td>Kinematica AG</td><td></td><td>כדי להשעות את תכשירי הממברנה</td></tr><tr><td>תוכנת XLfit5</td><td>Microsoft Excel &nbsp; תוסף מאת IDBS</td><td></td><td>תוכנת התאמת עקומה</td></tr><tr><td>משיכה חכמה</td><td>UniPix-חולץ</td><td></td> <td>אלקטרודות</td></tr><tr><td>רובו-הזרקה</td><td>מערכות רב ערוציות-הזרקה</td><td></td> <td>אוטומטית (ביציות קסנופוס)</td></tr><tr><td>HiClamp</td><td>מערכות רב ערוציות-מהדק</td><td></td> <td>מתח אוטומטי (Xenopus אוציטים)</td></tr><tr><td>כריית נתונים</td> מערכות <td>רב-ערוציות-נתונים</td><td></td><td> תוכנת ניתוח</td></tr><tr><td>נתוניםמיזוג</td><td>מערכות רב-ערוציות-תוכנה</td><td></td> <td>לעיבוד נתונים</td></tr><tr><td>Digidata 1550</td><td>התקנים</td><td></td> מולקולריים <td>מערכת רכישת נתונים עם רעש נמוך</td></tr><tr><td>CyberAmp 380 או שווה ערך</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>מרכך אותות ניתן-לתכנות</td></tr><tr><td>pClamp חבילת תוכניות התקנים</td><td></td><td>מולקולריים</td><td>תוכנה לאיסוף וניתוח נתונים תוכנה</td></tr><tr><td>Antivibraton טבלה&nbsp;</td><td>TMC</td><td></td><td>למניעת רעידות מיקרואלקטרודות&nbsp;</td></tr><tr><td>Patchstar Micromanipulators</td><td>Scientifica</td><td></td><td>למיקום מדויק של מיקרואלקטרודות בפרוסות מוח</td></tr><tr><td>Faraday Cage&nbsp;</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td>לבידוד הקלטות מרעש</td></tr><tr><td>McIlwain Tissue Chopper</td><td>Campden Instruments LTD&nbsp;</td><td></td><td>להכנת פרוסות מוח</td></tr><tr><td>מיקרופיפטה מזכוכית בורוסיליקט&nbsp;</td><td>וורנר אינסטרומנטס</td><td>GC150TF-10</td><td>להקלטת פוטנציאלים חוץ-תאיים בפרוסות מוח</td></tr><tr><td>זוג מעוות, חוטי אירידיום פלטינה אלקטרודה לגירוי</td><td>מכשירי דיוק</td><td></td><td>עולמיים לגירוי פרוסות המוח עם</td></tr><tr><td>מחולל גירוי זרם ומתח לגירוי מונע זרם ומתח</td><td>מערכות רב-ערוציות</td><td>STG4000</td><td>מעביר את הזרם לאלקטרודה</td></tr> <tr><td>הגירוי<חזק>כלי פלסטיק</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוטיטר צלחת תחתונה עגולה</td><td>קורנינג</td> <td># 3365</td><td>משמש לבדיקת המחייב</td></tr><tr><td>GF / C מסנן סיבי זכוכית תחתון 96 בארות מיקרופלייט עם 1.2 ומיקרו; M PoreSize, לבדיקות קצירת תאים באמצעות מסנן סעפת ואקום&nbsp;</td><td>פקארד&nbsp;</td><td>#6005174</td><td>משמש לבדיקת הכריכה</td></tr><tr><td>50 מ"ל שפופרות</td><td>בז&nbsp;</td><td>#352070</td><td>משמש לבדיקת הכריכה</td></tr><tr><td>צינורות נעילה בטוחה 1.5 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>#0030 120086</td><td>המשמש לבדיקת הכריכה</td></tr><tr><td>צינורות נעילה בטוחה 2 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>#0030 120094</td><td>המשמש לבדיקת הכריכה</td></tr><tr><td>צינורות משלוח 180 מ"ל&nbsp;</td><td>Semadeni Europe AG&nbsp;</td><td>#3722</td><td>משמש לבדיקת הכריכה</td></tr><tr><td>בקבוקון פוני פוליאתילן 6 מ"ל&nbsp;</td><td>פרקין אלמר&nbsp;</td><td>#6013329</td><td>משמש לבדיקת הכריכה</td></tr><tr><td>Top Seal&nbsp;</td><td>פרקין אלמר&nbsp;</td><td>#60051859</td><td>משמש לבדיקת הכריכה</td></tr><tr><td>בקבוק ספינר</td><td>בלקו</td><td>BELLCO # 1965-00100</td><td>בקבוק ספינר</td></tr><tr><td>96&nbsp; צלחת באר (חרוטי)</td> <td>Thermo Scientific Milian</td><td>56368</td><td>צלחת הזרקה לביציות</td></tr><tr><td>96&nbsp; צלחת באר (תחתית שטוחה)</td><td>קורנינג (ויטאריס שוויץ)</td><td>צלחת מורכבת</td> <td>3364-cor</td> לנימי זכוכית HiClamp</tr><tr><td>&nbsp;</td><td>הילגנברג (גרמניה)</td><td>-</td><td>זכוכית בורוסיליקט 1.2 OD 0.76 תעודת זהות עם הכנת RNA נימה</td></tr><tr><td><חזק></חזקה></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אמביון mMessage mMachine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>לסינתזה in vitro</td></tr><tr><td>כימיקלים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מאגר בדיקה: KCl 5 מ"מ; CaCl<תת>2 1.25 מ"מ; MgCl<תת>2 1.25 מ"מ; NaCl 120 מ"מ; טריס 15 מ"מ pH מותאם עם HCl ל-7.4; אחסן עד 3 חודשים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</td><td></td><td></td><td>משמש לבדיקת כריכה</td></tr><tr><td>מאגר כביסה: Tris 50 מ"מ -HCl pH 7.4; אחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</td><td></td><td></td><td>משמש לבדיקת קשירה</td></tr><tr><td>תמיסת מלאי של תרכובות בדיקה 10 מ"מ ב-DMSO</td><td></td><td></td><td>משמש לבדיקת קשירה</td></tr><tr><td>Flumazenil (RO0151788) 10 מ"מ ב-DMSO</td><td></td><td></td><td>משמש לבדיקת קשירה</td></tr><tr><td>Diazepam 4 mM ב-DMSO</td><td></td><td></td><td>משמש לבדיקת קשירה</td></tr><tr><td>[3H]-Flumazenil 60-85 Ci/mmol באתנול; אחסן ב-20 מעלות; C</td><td></td><td></td><td>משמש לבדיקת קשירה</td></tr><tr><td>Microscint 40&nbsp;</td><td>פקארד&nbsp;</td><td>#6013641</td><td>משמש לבדיקת קשירה</td></tr><tr><td>Ultima Gold&nbsp;</td><td>פרקין אלמר&nbsp;</td><td>#6013329</td><td>משמש לבדיקת קשירה</td></tr><tr><td>MS-222</td><td>Sigma</td><td>Sigma # A5040</td><td>MS-222</td></tr><tr><td>AB/AM</td><td>Sigma</td><td>Sigma # A5955</td><td>אנטיביוטיקה / אנטי-מיקוטיקה</td></tr><tr><td>קולגנאז</td><td>סיגמא</td><td>סיגמא # C1030</td><td>קולגנאז סוג I</td></tr><tr><td>Rnase</td><td>Sigma</td><td>Sigma # R2020-250 mL</td><td>RNaseZAP</td></tr><tr><td>EndoFree פלסמיד מקסי Kit</td><td>Qiagen</td><td>Qiagen # 12362</td><td></td></tr><tr><td>מלחים לנוזל מוחי מלאכותי (NaCl, KCl וכו')</td><td>סיגמא</td><td></td><td></td></tr><tr><td><ממברנות חזקות>ממברנות</חזקות></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תכשירי ממברנה קפואים מ-HEK293 חולף או מועבר ביציבות המבטאים יתר על המידה תת-סוגים שונים של קולטני GAB<A>A אנושיים: ואלפא; 1&בטא; 3&גמא; 2, ואלפא; 2&בטא; 3&גמא; 2, ואלפא; 3&בטא; 3&גמא; 2, ואלפא; 5&בטא; 3&גמא;2. ראה Ballard et al. 2009 לשיטות מפורטות.</td><td></td><td></td><td>משמש לבדיקת כריכה</td></tr></tbody></table>

שיטות הגילוי של תרכובות הרומן להתכוונן קולטן גאמא אמינו בוטירית הקלד עצבית

Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission

זה מציג כתב יד פרוטוקול צעד אחר צעד לסינון תרכובות-גמא-aminobutyric חומצה סוג של קולטנים (GABAA) והשימוש בה לקראת הזיהוי של הרומן מולקולות פעילים מבחני פרה מ רקומביננטי במבחנה הקולטן והשפעותיהם תרופתי-קולטנים יליד פרוסות המוח מכרסמים. עבור תרכובות מחייב באתר בנזודיאזפינים של הקולטן, הצעד הראשון הוא להגדיר מסך ראשי המורכב בפיתוח מבחני הכריכה radioligand על קרום התא לבטא את תת-סוגי GABAA מז'ור. לאחר מכן, תוך ניצול של הביטוי heterologous של קולטני GABAA מכרסמים ואנושי oocytes צפרדע רפואית או תאים HEK 293, זה אפשרי לחקור, במבחני אלקטרופיזיולוגיות, המאפיינים הפיזיולוגיים של הקולטן שונים תת והמאפיינים תרופתי של תרכובות שזוהה. מערכת oocyte צפרדע רפואית , יוצגו כאן, החל הבידוד של oocytes את, microinjection שלהם עם mRNAs שונים, עד האפיון תרופתי באמצעות מלחציים שני-אלקטרודה מתח. לבסוף, הקלטות שנערכו פרוסות המוח מכרסמים יתוארו המשמשים פיזיולוגיים כמבחן משני כדי להעריך את הפעילות של מולקולות ב שלהם יליד קולטנים עצביים במעגל מוגדרים היטב. הקלטות חוץ-תאית באמצעות תגובות האוכלוסייה של נוירונים מרובים מודגמות יחד עם הבקשה סמים.

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לגלות תרכובות פעיל קולטני GABAA , מן הכריכה פיזיולוגיה, פרמקולוגיה.

This manuscript presents a step-by-step protocol for screening compounds at gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptors and its use towards the ...

המטרה הכוללת של סרטון זה היא להמחיש מפל סינון המאפשר גילוי של ליגנדים חדשים של קולטני GABA-A. היתרון בשימוש בקשירת רדיוליגנד, רישום אלקטרופיזיולוגי בביציות קסנופוס ובפרוסות מוח של מכרסמים בצורה ספרותית הוא שניתן לשפר את פרופיל התרכובת. בסופו של דבר, מזוהים תת-סוג חזק, תרכובות סלקטיביות ויעילות.הדגמה זו תבוצע על ידי קומיקו קמברה וג'נה טוגנצ'יני, כמו גם סוניה ודניאל ברטרנד מ-HiQScreen ומארי קלייר פלימלין מרוש. הזרקו 10 עד 50 ננוליטר מהתמיסה המכילה פלסמיד באמצעות מחט מיקרו-הזרקת זכוכית בקוטר קצה של עד 100 מיקרומטר המותקנת על מיקרומניפולטור המצויד במערכת פליטת לחץ או במערכת הזרקה אוטומטית. כדי להתחיל בהליך זה, שמור את הביציות על 17 מעלות צלזיוס כדי למנוע ביטוי של חלבוני הלם חום.אחסן את המיקרופלייט באזור אחסון מבוקר תרמית. לאחר מכן, ממיסים את תרכובות הבדיקה, שנבדקו חיוביות בבדיקת הקישור ב-OR2, ב-0.1 ו-1000 מיקרו-מולר לרישומים אלקטרופיזיולוגיים והשליכו אותן לצלחת פוליפרופילן בעלת תחתית שטוחה של 96 בארות. כדי לבצע שתי אלקטרודות כרךtagמהדק הקלטה, הנח צלחת המכילה את הביציות על המערכת האוטומטית.תכנת את מערכת ההקלטה האוטומטית באמצעות הממשק מבוסס הסמלים עם סכימה זו לקביעה המתאימה של יחסי פעילות הריכוז. להתאמת עקומה, באמצעות עקומת הפעלת הריכוז המאוירת, שרטט את משרעת הזרם כפונקציה של הלוגריתם של ריכוז האגוניסט. לרישום אלקטרופיזיולוגי, שמור את המוח בתמיסת dACSF מבעבעת עם קרבוגן בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, נתחו את תצורת ההיפוקמפוס השמאלית בעזרת מרית דקה. לאחר מכן, חתך שקופיות רוחביות בעובי 400 מיקרומטר מהחלק החציוני של ההיפוקמפוס עם קוצץ רקמות. בעזרת מברשת ציור מעבירים את הפרוסות לתא ההקלטה ושומרים אותן בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות.לאחר מכן, יש לחלחל את הפרוסות עם rACSF מבעבע בקרבוגן ב -35 מעלות צלזיוס ובקצב של 1.5 מיליליטר לדקה. כדי לתעד עלייה באוכלוסייה בודדת, הנח פרוסת מוח בתא המותקן במיקרוסקופ. מחדירים את הפרוסה עם rACSF בקצב של שלושה מיליליטר לדקה.בעזרת מושך הפיפטה, משוך מיקרופיפטה מזכוכית בורוסיליקט עם התנגדות של כשני מגה-אוהם. מלאו את המיקרופיפטה בתמיסה המכילה שני נתרן כלורי מולארי והניחו אותה במחזיק הפיפטה. מקם את המיקרו-פיפטה המקליטה בשכבה הפירמידלית באזור CA1 של פרוסת ההיפוקמפוס באמצעות המיקרומניפולטור הימני.לאחר מכן, הנח אלקטרודת אירידיום פלטינה דו-קוטבית מבודדת לתוך המחזיק במיקרומניפולטור השמאלי. מקם את אלקטרודת הגירוי בבטחונות Schaffer באזור CA1 של פרוסת ההיפוקמפוס באמצעות המיקרומניפולטור השמאלי. באמצעות מחולל הגירוי, העבירו פולס זרם לאלקטרודת הגירוי כל 30 שניות והגדילו בהדרגה את עוצמת הגירוי עד להופעת עלייה באוכלוסייה.התאם את עוצמת הגירוי כדי לעורר עלייה באוכלוסייה המתאימה ל-45% מהמשרעת המקסימלית שניתן להשיג. כדי לבצע עיכוב דופק מזווג, העבירו שני פולסים זרמים לאלקטרודת הגירוי כל 30 שניות באמצעות מחולל הגירוי. הגדר את עוצמת הגירוי כך שתעורר עלייה באוכלוסייה המתאימה ל-45% מהמשרעת המקסימלית.כדי לבדוק את התרכובות, בצע דילולים של התרכובות שייבדקו ב-ACSF כך שהריכוז הסופי של DMSO לא יהיה גבוה מ-0.1%הוסף DMSO לתמיסת הבקרה באותו ריכוז כמו בתמיסת התרכובת. רשום עלייה בודדת או זוגית באוכלוסיית הדופק המעוררת על ידי גירויים נלווים של Schaffer כל 30 שניות למשך 30 דקות לפחות. צורת ספייק האוכלוסייה צריכה להיות יציבה במהלך תקופת בסיס זו.לאחר מכן, הכינו עם rACSF קרבוגן המכיל ריכוז קבוע של התרכובת לבדיקה והזלגו את פרוסת ההיפוקמפוס בתמיסה במהלך רישום קוצים של אוכלוסיית דופק בודדת או זוגית. כמו כן, העריכו את ההתאוששות מאפקט התרכובת על ידי החדרת הפרוסה ב-rACSF קרבוגן ללא התרכובת. מוצג כאן ייצוג סכמטי של פרוסת היפוקמפוס של חולדה, הביטחונות של Schaffer שמקורם באקסונים של תאים פירמידליים CA3 המוקרנים על הארבוריזציה הדנדריטית של נוירוני הפירמידה CA1.מיקרו-פיפטות הוצבו בשכבה הפירמידלית כדי לתעד את עליות האוכלוסייה ובשכבה הרדיאטומית לרישום דנדריטי של פוטנציאלים פוסט-סינפטיים מעוררי שדה. אלקטרודת הגירוי הוצבה בתוך הביטחונות של שפר. איור זה מציג קפיצות אוכלוסייה המעוררות על ידי הגירויים הזוגיים המופעלים באמצעות אותה אלקטרודה מגרה במרווח של 20 אלפיות השנייה.תגובת האוכלוסייה לגירוי השני היא בעלת משרעת קטנה יותר מזו של התגובה לגירוי הראשון. עליות באוכלוסייה נרשמו בהיעדר ונוכחות של בטא CCM, NAM קולטן GABA A לא סלקטיבי. בטא CCM שיפר את המשרעת של ספייק האוכלוסייה השני על ידי חסימה חלקית של כל עיכוב גבארגי הזנה קדימה.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו בפרמקוקינטיקה, תפוסת קולטנים ויעילות in vivo ופרמקולוגיה בטיחותית על מנת לענות על שאלות נוספות כמו פוטנציאל לפיתוח קליני של התרכובות שזוהו.

methods-for-discovery-novel-compounds-modulating-gamma-aminobutyric

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

במאמר זה, אנו מתארים שיטה יעילה ללמוד לתפקד ערוץ יון יגנד מגודר בנוירונים של פרוסות מוח מבודד בחריפות. שיטה זו כרוכה בשימוש בתרופה micropipette מלא ליישום מקומי של תרופות לתאי עצב שנרשמו באמצעות טכניקות מהדקות תיקון סטנדרטיות.

יישום מקומי של תרופות לללמוד לתפקד קולטן אצטילכולין ניקוטינית בפרוסות מוח עכבר

כאן אנו מדגימים את השימוש בצבע ניאון אלקסה מצמידים את α-bungarotoxin למדוד GABA לוקליזציה הקולטן לפני השטח ואנדוציטוזה בנוירונים בהיפוקמפוס. באמצעות השימוש במבנים הנושאים תג תאי קצר שנקשר α-bungarotoxin, ניתוח של סחר endocytic פלזמה קרום חלבון יכול להיות מושגת.

שימוש בתג אתר איגוד α-bungarotoxin ללמוד GABA קולטן ממברנה לוקליזציה וסחר

המנגנונים המולקולריים הלתאם את ההיווצרות של סינפסות GABAergic המעכבת במהלך ontogeny אינם ידועים. ללמוד את התהליכים האלה, שפיתחנו מערכת מודל שיתוף תרבות אשר משלבת נוירונים GABAergic הקוצנית בינונית עובריים בתרבית יחד עם תאי הכליה עוברית אנושית 293 (HEK293) transfected ביציבות להביע קולטני GABA פונקציונלי.

היווצרות הסינפסה מעכבת בשיתוף תרבות נוירונים דגם שילוב GABAergic בינוני קוצניים וHEK293 תאים ביציבות להביע GABA רצפטורים

המטרה של פרוטוקול זה נועד להקל על המחקר של קולטני NMDA (NMDAR) בקנה מידה גדול יותר, לאפשר הבחינה של תופעות modulatory של מולקולות קטנות ושימושיהם טיפולית.

וזמינותו תפוקה גבוהה סידן השטף ללמוד קולטני NMDA עם רגישות גליצין/D-סרין, גלוטמט

השיטה של autoradiography נמצא בשימוש שגרתי ללמוד קשירה של radioligands על מקטעים של רקמות לקביעת פרמקולוגיה איכותי או כמותי.

Autoradiography כאל שיטה פשוטה ורבת -עוצמה עבור ויזואליזציה ואפיון של מטרות תרופתי

GPCR-β-מפיגור אינטראקציות הם שדה המתעוררים בגילוי סמים GPCR. מדויק, מדויק וקל להגדיר שיטות נחוצים כדי לפקח על אינטראקציות כאלה במערכות החיים. אנו מראים שיטת compleמנטציה מבנית לניטור GPCR-β-בפיגור בתאי החיים בזמן אמת, וזה יכול להיות מורחב לכל GPCR.

מעקב GPCR-β-arrestin1/2 אינטראקציות בזמן אמת מערכות חיים כדי להאיץ את גילוי הסמים

שיטה זו מציגה טכניקה פשוטה לזיהוי של שחרור מונואמין אנדוגני באמצעות פרוסות מוח חריפות. ההתקנה משתמשת בלוח 48 באר המכיל מחזיק רקמות לשחרור מונואמין. מונואמין ששוחרר מנותח על ידי HPLC יחד עם זיהוי אלקטרוכימי. בנוסף, טכניקה זו מספקת שיטת סינון לגילוי סמים.

בסיס בסיס צלחת למדידת שחרור מונואמין אנדוגני בפרוסות מוח חריפות

הפרוטוקול מתאר את ההכנה של עמודי כרומטוגרפיית זיקה של קרום התא (CMAC) עם שברי קרום תאים משותקים המכילים חלבוני קולטן B טרנס-ממברנה tropomyosin kinase פונקציונליים. כמו כן מוסבר השימוש בעמודות CMAC בזיהוי מטבוליטים צמחיים מיוחדים המקיימים אינטראקציה עם קולטנים אלה ונוכחים בתערובות טבעיות מורכבות.

עמודי כרומטוגרפיה של זיקה לממברנת התא לזיהוי מטבוליטים מיוחדים של צמחים המקיימים אינטראקציה עם קולטן Tropomyosin Kinase משותק B

הפרוטוקול מדגים כי על ידי ביצוע מיקרו-טרנספלנטציה של ממברנות סינפטיות לתוך ביציות קסנופוס לאוויס , ניתן לרשום תגובות עקביות ואמינות של α-אמינו-3-הידרוקסי-5-מתיל-4-איזוקסזולפרופיונית וחומצה γ-אמינו-בוטירית.

מיקרו-טרנספלנטציה של ממברנות סינפטיות להפעלה מחדש של קולטנים סינפטיים אנושיים למחקרים פונקציונליים

בדיקת הקרוסלינקינג הכימי BS3 חושפת ביטוי קולטן GABAמופחת בפני השטח של התא במוחות עכברים בתנאי לחץ פסיכו-סוציאלי כרוניים.

BS3 Chemical Crosslinking Assay: הערכת ההשפעה של לחץ כרוני על פני התא GABAמצגת קולטן במוח מכרסם

כאן, אנו מתארים מערכת שמרים המשחזרת γ-הפרשה אנושית. מערכת זו מאפשרת זיהוי ומחקר של מוטציות המשפיעות על הפעילות ובדיקת מעכבי γ-סקרטאז (GSI). תוך ניצול תכונות אובדן התפקוד של מוטציות משפחתיות של מחלת אלצהיימר, ניתן לסנן מאפנני γ-סקרטאז (GSM).

שמרי אפייה (Saccharomyces cerevisiae) מודלים של מחלת אלצהיימר לסינון גנים, מוטציות וכימיקלים המשפיעים על ייצור בטא עמילואיד על ידי γ-secretase

למד שיטות גילוי תרכובות חדשות לקולטני GABA A באמצעות אוגיות Xenopus ופרוסות מוח מכרסמים. השיטה משלבת רישום אלקטרופיזיולוגי לזיהוי ליגנדים סלקטיביים ויעילים לפיתוח תרופות נוירולוגיות.

שיטות הגילוי של תרכובות הרומן להתכוונן קולטן גאמא אמינו בוטירית הקלד עצבית

גלה סרטונים נוספים