Metabolic Analysis of <em>Drosophila melanogaster</em> Larval and Adult Brains

Kathryn E. Neville; Timothy L. Bosse; Mia Klekos; John F. Mills; Marla Tipping

doi:10.3791/58007

ניתוח מטבולית של melanogaster דרוזופילה Larval ושכל למבוגרים

JoVE Journal
Neuroscience

This content is Free Access.

JoVE Journal Neuroscience

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

ניתוח מטבולית של melanogaster דרוזופילה Larval ושכל למבוגרים

Full Text

9,903 Views

07:06 min

August 7, 2018

DOI: 10.3791/58007-v

Kathryn E. Neville¹, Timothy L. Bosse¹, Mia Klekos¹, John F. Mills¹, Marla Tipping¹

¹Department of Biology,Providence College

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This study details a protocol to measure oxygen consumption and extracellular acidification in the brains of Drosophila melanogaster larvae and adults using a metabolic analyzer. The method involves specialized micro-tissue restraints and aims to investigate metabolic changes in the fly brain under various conditions.

Key Study Components

Area of Science

Neuroscience
Metabolism
Developmental Biology

Background

Drosophila melanogaster serves as a model for studying brain metabolism.
The impact of glial cell over-proliferation on metabolic reprogramming is investigated.
Different diets and behaviors may influence brain metabolism.
This technique can extend to other biological systems including imaginal discs and C. elegans.

Purpose of Study

To develop a reliable method for analyzing metabolic activity in Drosophila brains.
To understand how various factors alter brain metabolism.
To gather insights into metabolic changes linked with growth and cellular proliferation.

Methods Used

The main platform utilized is a metabolic analyzer designed for intact brain tissues.
The biological model involves dissecting the larval and adult brains from Drosophila.
Micro-tissue restraints are critical for the assay, ensuring stability and accurate results.
Key steps include dissection under a microscope and precise placement within assay wells.
The study employs oxygen consumption and extracellular acidification measurements.

Main Results

The optimized protocol yields stable OCR readings exceeding 150 picomoles per minute.
Findings reveal differences in ECAR between larval and adult brains.
Notable metabolic responses are observed, including reduced OCR upon mitochondrial inhibition.
Glycolytic activity is heightened during larval stages, indicating metabolic adaptations for growth.

Conclusions

This study provides a method to explore metabolic dynamics in Drosophila brains.
The integration of metabolic measurements enhances our understanding of brain metabolism.
Findings have implications for studying neuronal mechanisms and responses to growth signals.

Frequently Asked Questions

What are the advantages of the metabolic analyzer used?

The metabolic analyzer allows for precise, real-time measurements of oxygen consumption and acidification, providing insights into metabolic dynamics.

How are the Drosophila brains prepared for analysis?

Brains are dissected from late-third instar larvae and adults, ensuring they remain intact for accurate metabolic measurement.

What types of data are obtained through this method?

The method collects data on oxygen consumption rates (OCR) and extracellular acidification rates (ECAR), which reflect metabolic activity.

Can this technique be adapted for other biological models?

Yes, similar techniques can be applied to other tissues, such as imaginal discs and C. elegans, enabling broader metabolic studies.

What are some limitations of this protocol?

Care must be taken to ensure proper centering of the brains within micro-tissue restraints, as misalignment can affect results.

How long do the metabolic readings remain stable?

The metabolic readings can be maintained for at least 30 minutes after setup, providing a reliable timeframe for analysis.

What is the significance of elevated glycolysis during larval stages?

Increased glycolytic activity supports growth and development during the larval stages, demonstrating the metabolic adaptations of the fly brain.

אנו מציגים פרוטוקול למדידת צריכת החמצן ואת acidification חוץ-תאית במוח זחל ומבוגרים melanogaster דרוזופילה . מנתח חילוף החומרים מנוצל עם פרוטוקול מותאם וממוטב. מיקרו-רקמת ריסון הינם המכריעים של פרוטוקול זה, היו עיצבת ויצרת במיוחד לשימוש שלהם ניתוח זה.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי חילוף החומרים במוח של דרוזופילה וכיצד ריבוי יתר של תאי גליה משפיע על תכנות מחדש מטבולי, בין אם תזונה או התנהגות משנים את חילוף החומרים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לנתח מוחות זבובים כרקמה אחת שלמה עם תוצאות הניתנות לשחזור המתקבלות ממדידת מוח אחד בלבד בכל פעם. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי חילוף החומרים של מוח הזבוב, ניתן ליישם אותה גם על רקמות אחרות ומערכות מודלים כגון דיסקים דמיוניים ו-C.elegans, בהתאמה.

כדי להכין את מעצורים המיקרו-רקמות, ממיכל האחסון בחר ריסון מיקרו-רקמה אחד לכל מוח שנמדד, בתוספת לפחות שלושה לשימוש כבקרות ריסון בלבד. בעזרת סלסלת רשת וצלחת שש בארות, שטפו את המעצורים עם שבעים אחוז אתנול ושטפו אותם במים נטולי יונים שלוש פעמים, בכל פעם למשך שתי דקות. בצע שטיפות מים נוספות אם המעצורים עדיין מדיפים ריח אלכוהול.

שטפו את מעצורי המיקרו-רקמה באמצעי בדיקה והשאירו אותם בתמיסה עד שהם מוכנים לשימוש. כדי לנתח את מוח הזחל של Drosophila melanogaster, בחר את זחלי הכוכב השלישי המאוחר מתוך בקבוקון של זבובי Organ R מתורבתים. מניחים את הזחל בבאר של צלחת נקודתית נקייה המכילה 500 מיקרוליטר של 1x PBS.

לאחר מכן, שטפו את הזחל על ידי ניעורו בעדינות בבאר והעבירו אותו לבאר נקייה אחרת. לאחר מכן, הנח את לוחית הספוט מתחת למיקרוסקופ הניתוח. תפסו את הזחל בחלק האמצעי שלו עם פינצטה אחת תוך אחיזת ווי העין עם זוג פינצטה שני.

משוך בעדינות ובצורה חלקה את הזחל לכיוונים מנוגדים באמצעות שתי קבוצות הפינצטה. דמיינו את המוח שבדרך כלל נשאר מחובר לווי העין ובדרך כלל מחוברים אליו דיסקים של אנטנות העין. בעזרת ווי העיניים כדי להחזיק את המוח במקומו, הסר בזהירות רקמות נוספות.

לבסוף, הפרד את ווי העין מהמוח. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה כדי להעביר את המוח המנותח לבאר חדשה המכילה 1x PBS. כדי להוסיף את המוחות המנותחים ללוחית בדיקה מטבולית של 96 בארות, הוסף תחילה 50 מיקרוליטר של אמצעי בדיקה לכל הבארות, כולל בארות הניסוי, הבקרה, הריסון בלבד והרקע.

לאחר מכן, הניחו בזהירות מוח אחד בכל באר. תחת מיקרוסקופ הדיסקציה, השתמשו במיקרו-בדיקה עם מחט כפופה כדי ללחוץ את המוח לתחתית הבאר. מקם בעדינות את המוח באמצע שלושת הכדורים המוגבהים באמצעות הגשושית.

כדי להוסיף ריסון מיקרו-רקמה ללוחית הבדיקה המטבולית של 96 בארות, הנח אותה תחילה על הקצה. תחת מיקרוסקופ, כוונו אותו כשטבעת הפלסטיק פונה כלפי מטה והרשת למעלה. לאחר מכן, הסר את הצלחת מהמיקרוסקופ.

השתמש בפינצטה כדי לתפוס את הריסון משני הצדדים ולהפיל אותו בעדינות לבאר. השתמש במיקרו-בדיקה עם מחט כפופה כדי ללחוץ את הריסון כלפי מטה לתוך הבאר. מעצורי המיקרו-רקמה חייבים להיות ממוקמים כראוי מעל המוח המרוכז בכל באר כדי שטכניקה זו תספק תוצאות משמעותיות.

תחת המיקרוסקופ, ודא שניתן לראות את המוח המנותח דרך ריסון הרקמות ושהוא מרוכז בבאר וחזור על ההליך עבור כל הבארות שישמשו בבדיקה. הוסף בזהירות 130 מיקרו-ליטר של אמצעי בדיקה לכל אחת מבארות הניסוי, הבקרה והריסון בלבד. ודא שהמוח ומעצורי המיקרו-רקמות לא זזו בעת הוספת המדיה.

לאחר מכן, הוסף 180 מיקרו-ליטר של מדיית בדיקה לארבע הבארות הפינתיות לשימוש כבקרת רקע. בהליך זה, הסר את לוחית השירות והוסף את לוחית התא ללא המכסה באותו כיוון למנתח המטבולי. בחר Load Cell Plate"כדי שהמכשיר ייקח את לוחית התא ויסגור את המגש ולאחר מכן יתחיל בבדיקה.

לאחר השלמת הבדיקה, הסר את לוחית התא והמחסנית שנפלטו. באמצעות מיקרוסקופ מנתח, ודא שהמוח ומעצורי המיקרו-רקמה עדיין ממוקמים כראוי בבאר לאחר השלמת הבדיקה והוצא בארות עם חריגות מהניתוח. כאשר עוקבים אחר התנאים האופטימליים, הבדיקות עם מוחות הזחלים והמבוגרים מביאות לקריאות של OCR העולות במעט על 150 פיקומולים לדקה בנקודת הזמן השישית המיוצבת, כ-25 דקות לתוך הבדיקה.

קצב זה נשמר לפחות 30 דקות ועד שעתיים. ה-ECAR מעט נמוך יותר במוחות בוגרים מאשר במוחות זחלים בנקודת הזמן השישית ונשמר לפחות 30 דקות. ממצא זה תואם לעלייה בגליקוליזה במהלך שלבי הזחל כדי לתמוך בגדילה.

זריקה עם מעכב מיטוכונדריאלי, כגון אוליגומיצין, מורידה את קריאות ה-OCR כדי לחשוף את הנשימה התלויה ב-ATP וטיפול נוסף ברוטנון ואנטימיצין A מוריד את ה-OCR כדי לחשוף צריכת חמצן שאינה מיטוכונדריאלית. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור למרכז את המוח ולוודא שריסון המיקרו-רקמה מאובטח במקומו לפני הפעלת הבדיקה ובמהלך הניתוח. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו PCR כמותי וניתוח כתמים מערביים על מנת לענות על שאלות נוספות לגבי האופן שבו ביטוי גנים תורם לפנוטיפ המטבולי הנצפה.

View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos