בידוד F₁-ATPase מ פרוטיסטים טפילי Trypanosoma brucei

פרוטוקול זה מתאר את הטיהור של F₁-ATPase משלב חרקים בתרבית של Trypanosoma brucei. ההליך מניב מורכב מאוד טהור, הומוגנית, פעיל מתאימים ללימודי אנזימטי מבניים.

הטיהור של F1-ATPase מבוסס על שיטות ביוכימיות קלאסיות אשר הוכיח להיות חיוני להבנתנו את המנגנון של ייצור ATP על ידי סינתאזות ATP אחרות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מייצרת אנזים טהור מאוד מתאים לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה רנטגן או מיקרוסקופ קריו-אלקטרונים. למרות פרוטוקול זה מותאם לבידוד של F1-ATPase מ trypanosomes, זה יכול להיות מותאם למקורות אחרים, כגון רקמות או תאי תרבות, ו פרוטיסטים פתוגניים שונים.

טכניקה זו עלולה להוביל לזיהוי תרופות חדשות לטיפול במחלות אנושיות קשות. לדוגמה, שחפת Mycobacterium F-ATPase היא יעד תרופה מאומתת לטיפול בשחפת. כדי להתחיל את הפרוטוקול, להפשיר בעדינות resicles המיטוכונדריה, הידוע גם בשם mitoplasts, מבודד בעבר על ידי תזה היפוטונית מ 1 פעמים 10 כדי 11 עד פעמיים 10 כדי 11 תאים של טריפנוסומה ברוסי פרוצליקלית בחמישה מיליליטר של חיץ קר כקרח A.Keep את המצונן.

לאחר מכן, לקבוע את ריכוז החלבון בהשעיה על ידי חומצה ביצינצ'ונית, או BCA, מרשם חלבון על פי הוראות היצרן. בצע סדרת דילול BSA במים טהורים במיוחד כדי לבנות את העקומה הסטנדרטית. לדלל כמות קטנה של המדגם 20 עד 100 פעמים עם מים טהורים במיוחד כדי להתאים לטווח של תקני BSA.

לאחר חישוב כמות החלבון הכוללת המדגם, להביא את ריכוז החלבון ל 16 מיליגרם למיליליטר על ידי דילול אותו עם חיץ נוסף A.Then לפצל את mitoplasts לתוך וטרינרים הפוכים חתיכות קרום על ידי sonication שבע פעמים במשך 15 שניות כל אחד, עם אנרגיה כוללת של 70 עד 100 joules לכל דחף עם microtip עם קוטר של 3.9 מילימטרים. תוך כדי פיצול, הדגירה את המדגם על קרח במשך 30 שניות בין דחפים. לאחר sonication, ההשעיה עשויה להיראות מעט כהה יותר.

מכך את שברי הממברנה על ידי אולטרה מרכז ב 54, 000 גרם במשך 16 שעות או ב 98, 000 גרם במשך חמש שעות בארבע מעלות צלזיוס. תדקן את העל-טבעי ותמשיך בחילוץ הכלורופורם. חשב את אמצעי האחסון של מאגר ב' בהתבסס על הכמות הכוללת של מאגר א' בשימוש.

מעבירים את המעים הקפואים מצינור הצנטריפוגה לתוך ההומוגנר. תן מחדש את גלולת הממברנות המיטוכונדריות במאגר B בעזרת הומוגניזר קטן של Dounce. העבר את ההשעיה לצינור חרוט 50 מיליליטר.

הסר את הדגימה מקרח, ושמור את הדגימה ואת כל הפתרונות בטמפרטורת החדר עבור השלבים הנותרים. לאחר מכן הוסיפו כלורופורם רווי בשתי טריסות טוחנות המותאמות ל-HCl ל-pH 8.5, אחת לאחת. סגרו את המכסה בחוזקה, ונערו את הדגימה במרץ למשך 20 שניות בדיוק.

מיד צנטריפוגה את התערובת ב 8, 400 גרם במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להעביר את השלב העליון, מעונן מים ל 1.6 microtubes מיליליטר. הוסף מעכבי פרוטאז לדגימה כדי להחליף את המעכבים שהוסרו על ידי הטיפול chloroform.

צנטריפוגה הדגימות ב 13, 000 גרם במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הספין, מעבירים את העל-טבעי למיקרו-צינורות טריים, וחוזרים על הצנטריפוגה כדי להסיר כל חומר בלתי מסיס שנותר. לצייד את עמודת Q חילופי אניון חמישה מיליליטר מחובר למערכת כרומטוגרפיה נוזלית חלבון מהיר עם 50 מיליליטר של חיץ עמוד Q בקצב זרימה של חמישה מיליליטר לדקה עד הספיגה ב 280 ננומטר ואת המוליכות לייצב.

טען את העל-טבעי בעמודה שנציידת בקצב זרימה של מיליליטר לדקה. המתן עד שהספיגה ב-280 ננומטר תתייצב ברקע. החל הדרגתי ליניארי של 25 מיליליטר של מאגר האלוטיון של עמודת Q מ- 0%-100% בקצב זרימה של 0.5 מיליליטר לדקה ואוסף שברים בודדים יותר.

Assay 10 microliters של כל שבר בודד המתאים לשיא האלוציון העיקרי עבור פעילות הידרוליטית ATP לכל על מיליליטר של תערובת תגובה על ידי פולמן ATPase בדיקה ב pH 8.0. בריכת השברים המציגים פעילות ATPase. רכז את הדגימה המרוכזת על ידי סינון אולטרה-סינון של קרום באמצעות עמודת ספין עם מסנן PES של 100,000 ניתוק משקל מולקולרי ל- 200 עד 500 מיקרוליטר.

לאחר מכן המשך כרומטוגרפיה אי-הכללה גודל. לצייד את עמודת Superose 6 הגדל המחוברת למערכת כרומטוגרפיה נוזלית עם לפחות 48 מיליליטר של מאגר SEC בקצב זרימה של 0.5 מיליליטר לדקה. החל את הדוגמה על העמודה.

הפעל את הכרומטוגרפיה בקצב זרימה של 0.25 מיליליטר לדקה, תוך איסוף שברים של 0.25 מיליליטר. לאחר מכן, הפעל 10 microliters של שברים התואמים את הפסגות של עקבות ספיגת UV 280 ננומטר על SDS-PAGE. ואז להכתים את הדגימות עם כחול קומאסי.

תזהו את השברים המתאימים לשיא הגדול הראשון המכיל את פסגת ה-F1 לפעילות ההידרוליטית של ATP ורגישות אזיד על ידי המחתחת פולמן ATPase. לאחר מכן לבצע בדיקה BCA כדי לקבוע את ריכוז החלבון. לבסוף, לשמור על F1-ATPase מטוהר בטמפרטורת החדר, ולהשתמש בו בתוך שלושה ימים לאחר טיהור עבור יישומים במורד הזרם.

פרופיל אלוציה זה של כרומטוגרפיה חילופי אניון מציג את ספיגת UV ב 280 ננומטר וריכוז של נתרן כלורי במאגר אלוטיון. השברים שנבחרו הופרדו בג'ל SDS-PAGE והוכתמו בצבע כחול קומאסי. השברים התואמים את פסגת האלוטיון העיקרית מתוך כרומטוגרפיה של חילופי אניון המכילים את ה- F1-ATPase אורגנו, התרכזו והשתמשו בהם כקלט עבור כרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל.

מזהם העיקרי הוא דיהידרוליפויל דהידרוגנאז, אשר חמק מעמוד כרומטוגרפיה אי הכללת גודל כשיא דיסקרטי. ה-F1-ATPase גוועת בשיא הדומיננטי הראשון, במידה רבה סימטרי. הכתם הכחול קומאסי של תבנית רצועה טיפוסית לאחר ההפרדה של F1-ATPase מטוהרים באמצעות SDS-PAGE מראה להקות חלשות ספורדיות גלוי מעל יחידת המשנה בטא, המייצגים subcomplexes של אלפא שלוש בטא שלוש כיסוי ראש, דימרים ואוליגומרים של אלפא ו בטא subunits, והם נטולי כל מזהמים לגילוי על ידי ספקטרומטריית מסה.

בעת ביצוע מיצוי כלורופורם, השלב הקריטי של הפרוטוקול, חיוני לנער את המדגם במרץ ולהמשיך להפרדה הצנטריפוגלית של השלבים האורגניים והמים באופן מיידי. בעקבות הליך זה, F1-ATPase מבודד יכול להיות מאופיין בפירוט על ידי ספקטרומטריית מסה. כמו כן, ניתן להשתמש בו בבדיקות פעילות או למחקרים מבניים, בכוחות עצמו או בנוכחות מעכבים שונים או אנלוגים מצע.