אין ויוו שני הפוטונים הדמיה של נוירונים בקליפת המוח בעכברים Neonatal

נציג של ויוו שני הפוטונים הדמיה פרוטוקול הדמיה ההכרויות neonatal עכברים. שיטה זו מתאימה לניתוח הדינמיקות התפתחותית של נוירונים בקליפת המוח, המנגנונים המולקולריים הדינמיקות עצביים ועל שינויים עצביים dynamics במודלים של המחלה.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במדעי המוח, במיוחד אלה הקשורים היווצרות שקע נוירון. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שחוקרים יכולים לנתח את השינויים המורפולוגיים של נוירונים בודדים בעכברים יילודים חיים. התחל עם יום הרדמה לאחר הלידה חמישה גור ולהמשיך רק בהיעדר תגובה למבחן צביטה הזנב.

ראשית, לעקר את הקרקפת על ידי ניגוב אותו עם 70% אתנול. לאחר מכן, השתמש מספריים מעוכל עם 70% אתנול כדי להסיר כ 20 מילימטרים רבועים של העור מכסה את הגולגולת. לאחר מכן, השתמש מטליות סטריליות ספוג כותנה נקייה ספוגה חיץ קליפת המוח, כדי להסיר את fascia של הגולגולת.

השתמש בקצה טעינה כדי להחיל דבק רקמות על משטח העור חתוך כדי לעצור את הדימום תוך הימנעות האזור להיות בתמונה. מניחים את הגור על משטח חימום אחר, מוגדר 37 מעלות צלזיוס, ולאפשר לו להתאושש הרדמה. המתן כ -30 דקות עד דבק הרקמה התייבש והתמצה.

לאחר דבק הרקמה התייבש, להתחיל את הכנת חלון הגולגולת על העכבר הרדמה מחדש. החל טיפה אחת של חיץ קליפת המוח על הגולגולת, ולאחר מכן להשתמש בסכין גילוח סטרילי כדי לפתוח בזהירות אזור בקוטר מילימטר אחד של הגולגולת, משאיר את דורה שלם. החל חיץ קליפת המוח כדי לשמור על פני השטח של המוח לחים.

השתמש חתיכה קטנה של ספוג ג'לטין ספוג חיץ קליפת המוח כדי לעצור כל דימום. השתמש חתיכה טרייה כדי לדחוס צד אחד של craniotomy ולנקז כל חיץ ודם מפני השטח dural מבלי לגעת דורה. זהו השלב הקריטי ביותר להכנת חלון נקי.

יש לא ניזוק את הדורא ויש להסיר את המברשת מהדורה החשופה. לאחר מכן, השתמשו בקצה פיפטה כדי להחיל שכבה דקה של אגרוז נמס נמוך באחוז אחד, המומס במאגר קליפת המוח. החל עגול, שלושה מילימטר זכוכית לכסות להחליק על שכבת ג'ל אגרוז.

הסר את כל הבועות בין החלקת הכיסוי לבין שכבת הג'ל אגרוז על ידי שפיכת עודף של ג'ל אגרוז ביניהם. השתמש פינצטה כדי להסיר את הג'ל עודף, בולט מתחת לתנוחת הכיסוי. מערבבים אבקת מלט ונוזל הבטון.

השתמש קצה פיפטה כדי להחיל את התערובת על הגולגולת לפני שהוא הופך להיות מוצק. לאחר מכן, לצרף בר טיטניום בהתאמה אישית לעצם הגולגולת באמצעות מלט שיניים. יישר את סרגל הטיטניום, ואת החלקת המכסה במקביל כדי ללכוד בקלות תמונות.

כסו את הגולגולת החשופה במלט דנטלי. לאחר מכן, תת עורית להזריק משכך כאבים. מניחים את הגור בכלוב התאוששות על כרית חום של 37 מעלות צלזיוס במשך שעה עד שהמלט הדנטלי מתמצג.

כדי להתחיל בהדמיה, הגדר תחילה את אורך הגל של לייזר שני פוטון. עבור ביסוס RFP, השתמש באורך גל של 1000 ננומטר. לנגב את פני השטח של החלקת המכסה עם 70% אתנול.

חבר את הגור הרדמה לצלחת טיטניום על שלב ההדמיה, באמצעות בר טיטניום. השתמש בשלב goniometer, כדי להתאים את הראש, כך להחליק את הכיסוי מקביל לעדשה האובייקטיבית. שמור על טמפרטורת הגוף של הגור במהלך ההדמיה באמצעות כרית חימום להגדיר 37 מעלות צלזיוס ולהפחית את ריכוז האיזופלורן ל 0.7%-1% מקום שלב ההדמיה תחת עדשת המטרה 20x של שני מיקרוסקופ פוטון.

יש למרוח טיפת מים אחת על פתק הכיסוי. הגדר את התוכנה כדי לרכוש תמונות מחסנית Z במרווחי זמן של 1.4 מיקרון. להדמיית נוירון שכבה 4, הגדר את רוחב Z בין 150 ל-300 מיקרון כדי לדמיין את כל המורפולוגיה הדנדריטית.

השתמש בסריקה איטית וב ממוצע כדי לקבל תמונות ברורות המציגות את המורפולוגיה העצבית. בדרך כלל לוקח יותר מ -20 דקות לרכוש את כל המורפולוגיה דנדריטי. תמונה זו מציגה תמונה מייצגת של מחסנית Z של השכבה ארבעה נוירונים קליפת המוח של P5 גור.

החץ מציין את הנוירון שיש לנתח. נוירונים עם דנדריטים מטושטשים יש להסיר מהניתוח. תמונה זו מציגה תמונת הגדלה גבוהה יותר של הנוירון שצוין בתמונה הקודמת.

ראשי חץ כחולים מציינים עצות דנדריטיות שיסוגו בנקודת הזמן הבאה, וראשי החץ הלבנים הקטנים מציינים את האקסון של תא שכן. לאחר 4.5 שעות, הטיפים דנדריטי עם ראשי חץ כחולים נסוגים, ואת הטיפים דנדריטי עם ראשי חץ צהובים מוארכים. שחזור מורפולוגיה דנדריטי מייצג מוצג כאן, נוירונים המראים דנדריטים מנותקים כפי שניתן לראות כאן, יש להוציא מניתוחים.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לשמור על דורה שלם, במהלך התהליך. באמצעות הליך זה, שיטות אחרות כמו הדמיה הנעה יכול להתבצע כדי לענות על שאלות נוספות הקשורות דפוס פעילות נוירון במוח יילודים.