מדידת דנגה נגיף RNA תגובת שיקוע התרבות של תאים נגועים על ידי תגובת שרשרת של פולימראז כמותיים בזמן אמת

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המחלות הזיהומיות. לגבי קדחת דנגה, או קדחת צ'יקונגוניה. היתרון העיקרי של טכניקה זו עצמה, הוא מסוגל לכמת RNA ויראלי בצורה פשוטה ומהירה.

למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה לתוך מחקר וירוס בסיסי, זה יכול להיות מיושם גם על מחקרים אחרים כגון גבוה באמצעות מחקר הקרנת סמים לשים ואבחון קליני נגד וירוסים פופולוגניים אנושיים. ההדגמה העיקרית של שיטה זו היא קריטית. כמו חותמות עיבוד מדגם ארון biosafety חשובים כדי למנוע זיהום צולב או זיהום במעבדה.

הדגמת ההליך תהיה פרופסור עוזר והסייע הטכני שלנו מהמעבדה שלנו. לאחר הכנת תבנית ה- DNA עבור תקן RNA, מערבבים את תגובת שעתוק in vivo עם 100 ננוגרם של תבנית ה- DNA המוכנה בצינור PCR 0.2 מיליליטר. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במחזור תרמו במשך שעתיים.

לאחר מכן, מוסיפים מיקרוליטר אחד של DNAase וממשיכים את הדגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. הקים ערכת טיהור RNA והוסף 80 מיקרוליטרים של מים חופשיים RNAase ו 350 microliters של חיץ לכידה, כולל 1% betamarcaptoethanol לתערובת התגובה בצינור 1.5 מיליליטר. מוסיפים 250 מיקרוליטרים של 100%אתנול ולהשתמש פיפטה לערבב.

לאחר מכן, להרכיב עמוד טיהור RNA עם צינור איסוף. העבר את דוגמת ה- RNA לעמודת הטיהור. צנטריפוגה העמודה ב 8, 000 פעמים G במשך 15 שניות ולזרוק את הזרימה דרך.

לאחר מכן, יש למרוח 500 מיקרוליטרים של חיץ כביסה על העמודה ועל הצנטריפוגה ב-8,000 פעמים G למשך שתי דקות. לאחר מכן, למקם את העמוד לתוך צינור צנטריפוגה מיקרו 1.5 מיליליטר. הוסיפו 50 מיקרוליטרים של מים ללא RNAase ודגירה בטמפרטורת החדר למשך דקה.

צנטריפוגה את העמודה במהירות מקסימלית למשך דקה אחת כדי להחנים את ה- RNA. באמצעות ספקטרופוטומטר, למדוד את הצפיפות האופטית של 3 microliters של RNA alluted ב 260 ננומטר. לאחר מכן, לקבוע את מספר העותק של וירוס דנגי מסונתז שלוש RNA UTR הממשלה.

יש לאחסן את תקן ה-RNA במינוס 80 מעלות צלזיוס עד שהוא מוכן לשימוש. ראשית, לערבב 199 microliters של חיץ עיבוד עם microliter אחד של נוקלאז חינם proteinase K.באמצעות מדיום תרבות התא, באופן סדרתי לדלל את וירוס דנגי מוכן שלושה RNA UTR הממשלה אחת עד עשר כדי להשיג תקני RNA בריכוזים הנעים בין 5, 000, 000 עד 5, 000 עותקים לכל microliter על ידי חזרה על צינורות ומערבולת. העברה 5 microliters של התרבות supernatant של תאים נגועים וירוס דנגי ואת וירוס דנגי 3 תקן RNA UTR הממשלה או רצועות PCR A2 או בארות של צלחת PCR 96 היטב.

מערבבים חמישה מיקרוליטרים של הפתרון המכיל חיץ עיבוד ו proteinase K.צנטריפוגה לזמן קצר ב 200 פעמים G במשך חמש שניות. דגירה הדגימות ב רוכב תרמו ב 25 מעלות צלזיוס במשך עשר דקות ולאחר מכן ב 75 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. באמצעות וירוס דנגי שלושה פריימרים ספציפיים UTR הממשלה בדיקה פלואורוגנית, להכין תערובת מאסטר PCR RTQ עם צעד אחד RT PCR reagent בצינור מיקרו צנטריפוגה 1.5 מיליליטר.

הקצתה שמונה מיקרוליטרים של התערובת הראשית לתוך באר של 96 לוח PCR בזמן אמת. לאחר מכן, להוסיף שני microliters של כל מדגם לכל באר של 96 גם זמן אמת PCR צלחת. לאטום את הצלחת עם סרט דבק אופטי ברור.

בקצרה צנטריפוגה הצלחות ב 200 פעמים G במשך חמש שניות כדי להסיר את כל בועות האוויר. לאחר מכן, מניחים את הצלחת בכלי PCR בזמן אמת. באמצעות תוכנה משויכת PCR בזמן אמת, לנווט לחלון להגדיר ולהקצות את הבאר של תגובה כדי לנתח כדגימה לא ידועה.

לאחר מכן, להקצות את הבאר של וירוס דנגי מדולל סדרתי שלושה RNA UTR הממשלה כסטנדרט ולהקליד את מספר העותק הצפוי של תקן RNA בכל באר. הקצה את הפקד שאינו של התבנית כפקד השלילי. לאחר מכן, הפעל את מכשיר ה- PCR של RT ועגל את הלוח כמפורט בפרוטוקול הטקסט.

בחלון הניתוח, לחץ על לנתח וודא שמקדם המתאם של העקומה הסטנדרטית שנוצרת שווה ערך ל- 0.98 או גדול מ- 0.98. בדרך כלל, השתמש בהגדרות ה- CT המהוות ברירת מחדל עבור הניתוח. במחקר זה, דילול סדרתי פי עשרה של RNA וירוס דנגי סטנדרטי נתון לניתוח PCR RTQ ישיר באמצעות שלושה פריימרים ספציפיים UTR הממשלה בדיקה פלואורגנית.

העקומה ליניארית של ניתוח זה מראה כי המתאם הוא טוב. לאחר מכן, זה ישיר RTQ PCR הראיה מוחל לכמת את וירוס דנגי בתרבות supernatant של תאים נגועים בווירוס. מתאם טוב נראה בין טיטר ההדבקה בנגיף דנגי לבין ה- CT, מספר מחזור שנחשב לנקודה שבה האות הפלואורסצנטי עולה עם צמיחה אקספוננציאלית מעל הרקע.

כאשר ערכי CT שנוצרו מדילול סדרתי של מלאי וירוס דנגי עם titers זיהומיות ידועות מותווים על העקומה הסטנדרטית שנוצרה בעבר, הנתונים עבור דגימות הנעות בין 08 ל 8, 000 PFU לכל תגובה נראים בטווח של אלה הנתונים RNA סטנדרטי. זה מצביע על כך דגימות וירוס דנגי עם מגוון רחב של titers זיהומיות ניתן לנתח באותו זמן בעת שימוש בטכניקה זו. בדיקה זו מוערכת עוד יותר על ישימותה לאימות סוכנים אנטי ויראליים נגד וירוס דנגי.

כאשר מטופלים עם 50 מיקרוגרם למיליליטר של MPA, ירידה של כ 99.87% של תרבות הבקרה המטופלת DMSO נצפתה. לבסוף, יישומים של מבחן זה עם וירוסי RNA אחרים נבדקים. כאשר מלאי של זן חיסון 17D וירוס קדחת צהובה נתון RTQ PCR ישיר, עקומה סטנדרטית נוצרת עם מתאם ישיר טוב בין ציצים וירוס וערכי CT.

כמו כן, ניתוח ישיר של RTQ PCR של נגיף החצבת ומניות זן גלם וירוס chikungunya נותן רגרסיה טובה בין titers זיהומיות וערכי CT. טכניקה זו תסלול את הדרך לחוקרים בתחום מחקר ההקרנה. מתן אפשרות למספר רב של דגימות לחקור תרופות אנטי ויראליות חדשות שווה פשטני.

אל תשכח כי עבודה עם חומרים זיהומיות מחדש יכול להיות מסוכן מאוד אמצעי זהירות כגון שימוש בציוד מגן אישי ארון biosafety נקי תמיד צריך להילקח בעת ביצוע הליך זה.