הזרקת Orthotopic של תאים סרטניים בשד אל תוך כרית שומן החלב עכברים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשתיל תאים סרטניים בשד אל תוך כרית שומן החלב פשוטה, פחות פולשנית, אחיזה נוחה בדרך, והוא מודל סרטן השד זה העכבר orthotopic עם סביבה נאותה כרית שומן החלב יכול לשמש כדי לחקור היבטים שונים של סרטן.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הסרטן על איך microenvironment תומך בצמיחת הגידול או אם תרופה ספציפית יכולה לעכב ביעילות את התקדמות סרטן השד. היתרונות העיקריים של טכניקת אינדוקציה הגידול הם כי אין צורך בניתוח וזה באופן פולשני פחות שבו להקים סרטן השד במקום. באמצעות טכניקה זו, תאי הגידול גדלים בתוך כרית השומן חלבי, בסביבת הרקמה המתאימה, מחקה את התקדמות סרטן השד האנושי קרוב יותר מאשר הזרקה תת עורית או קסנוגרפט לתאי עכברים.

קה-שין-סאו, הטכנאי שלנו, ואני, נסייע לגן-לין זאנג בהדגמת ההליך הזה. ביום שלפני הניתוח, לרסן ידנית את העכבר המטופל ולהפוך את הצד בטן החיה עד הפרווה להיות מגולח סביב הפטמות הרביעי. מנגבים את הפרווה עם שכבה דקה של קרם depilatory.

השתמש במים מזוקקים כדי להסיר את השמנת לאחר 30 עד 60 שניות ולייבש את העכבר עם מגבות נייר רכות. ביום הניתוח, לדלל את ההשעיה תא סרטן השד מורין פעמיים עשר לתאים החמישיים למיליליטר של ריכוז PBS, בצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי על קרח. לפני כל זריקה, לטעון אחד, מזרק מיליליטר אחד מצויד 45 על ידי 16 מחט, עם 50 microliters של תאים לכל עכבר.

ולאשר חוסר תגובה לצביטת בוהן בכל חיה מרומם. החל משחה על העיניים של החיה ולהשתמש פינצטה כדי אוהל את העור סביב הפטמה הרביעית של העכבר הראשון, כדי ליצור מנהרה עבור המזרק לעקוב. החזק את המזרק עם שיקוע הפונה כלפי מעלה ובהת עור להיכנס לעור בחמישה עד 10 מילימטרים מהפטמה, בעקבות המנהרה עד קצה המחט כמעט מגיע הפטמה.

שימוש פינצטה כדי אוהל את העור סביב הפטמה הראשונה יוצר מנהרה עבור המזרק לעקוב. המחט צריכה להיות נכנסת בין קצות פינצטה צריך להרים במקום מדכא לתוך הרקמה. בזהירות להעביר את קצה המחט לתוך כרית שומן חלבי עד שפוע הוא מתחת לפטמה, ולשחרר את אוהל העור כדי לאפשר הזרקה איטית של התאים הסרטניים.

עם הכניסה, בזהירות להזיז את קצה המחט לתוך כרית שומן חלבי עד שפוע הוא מתחת לפטמה. ואתה תרגיש התנגדות כדי להבטיח את מסירת התאים למיקום הנכון. כאשר כל התאים הוזרקו, להפוך את המחט מעט לצד ולחזור את המזרק לאט.

השתמש ספוגית כותנה כדי להפעיל לחץ על פצע המחט במשך 10 עד 20 שניות, כדי להפוך אין חלחול נוזל. הפטמה המוזרקת אמורה להופיע כתחום שקוף, לבן ושטוח, עם הפטמה במרכז. כדי לבסס את נפח הגידול, לרסן את הצד בטן העכבר למעלה ולהשתמש caliper כדי למדוד את אורך הגידול ורוחב.

כדי ללכוד את הביולומינציה הגידולית, 10 דקות לפני הדמיה להזריק 150 מיליגרם לקילוגרם של D-luciferin לתוך החלק האחורי של צוואר העכבר. וללכוד תמונות bioluminescence של הגידול העיקרי גרורות תחת הפרמטרים המתאימים הדמיה bioluminescence. בנקודת הזמן הניסיונית המתאימה, השתמש במספריים כדי לקצור את הגידול מהעור.

ולהחיל את הפתרונות משככי כאבים לאתר הניתוחי כדי להקל על הכאב שלאחר הניתוח. לאחר מכן לסגור את העור עם תפרים כירורגיים על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. אפשרו לחיה להתאושש תחת מנורת חימום עם ניטור עד להחלמה מלאה.

השתמש אזמל לחתוך את הגידול העיקרי לשתי חתיכות שוות. אחסן מחצית מהרקמות בפרפורמלדהיד של 4% עבור כתמי המטוקסילין ואאוסין ואימונוהיסטוכימיה. להקפיא את החצי השני בחנקן נוזלי עבור כתמים מערביים או בידוד RNAi.

בנקודות הקצה הניסיוניות המתאימות לקצור את הריאות על פי פרוטוקולי ניתוח סטנדרטיים ולשטוף את האיבר ב- PBS. לאחר מכן לתקן את הריאות ב 4% paraformaldehyde כדי לאמת גרורות על ידי המטוקסילין וכתמי אאוסין. גידול הגידול העיקרי ניתן למדוד על ידי נפח הגידול ואת bioluminescence תא הגידול חי, כפי שהוכח.

גרורות אינן נצפות בשלבים המוקדמים של החיסון מכיוון שלא הוקם גידול משני, או האותות הביולומינסנטיים החזקים של הגידול העיקרי חוסמים את הגילוי של מוקדים גרורתיים קטנים עם אותות חלשים. לאחר הניתוק, ניתן לזהות ולנתח את אות הביולומינציה מהמספואים גרורתיים של איברים רחוקים. ניתוח של המורפולוגיה של שני גידול השד העיקרי ואת חלקי הריאות על ידי מכתים hematoxylin ו אאוסין מגלה אנגיוגנזה מוגברת בתא הגידול מחוסן בעלי חיים כפי שמובהא על ידי סמן microvessel anti-CD31 מכתים.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לוודא קצה המחט הוא במיקום הנכון לפני אספקת תאי הגידול. בעקבות הליך זה, atomizers, כמו אולטרסאונד בעלי חיים, ניתן לבצע כדי לענות על שאלות נוספות על תוספי שלפוחית השתן של הגידול העיקרי vivo. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום tumorigenesis ואת התפתחות התרופה בחקירת הגורמים העיקריים ואת המסלולים המעורבים tumorigenesis ואת המנגנונים של תרופה נגד סרטן במודלים בעלי חיים מורין.

אל תשכח כי עבודה עם isoflurane או הרדמה גז אחר יכול להיות קשה מאוד לינון, כי אמצעי זהירות כגון שימוש במסכת פחמן פעיל, תמיד צריך להילקח בעת ביצוע הליך זה.