לדוגמא Galleria mellonella Waxworm זיהום קנדידה המופץ

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום קנדידה על ארסיות המתח ועל התרומות של גנים ספציפיים לתהליכים אלה. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא נמנעת מחששות לגבי שימוש בבעלי חיים, היא חזקה, מהירה, זולה, ומספקת מספר גבוה של בעלי חיים לכל ניסוי. באופן כללי, אנשים חדשים בשיטה זו צפויים להיאבק קצת כי הם יתקשו להעריך את הכדאיות תולעת לפני תחילת הניסוי או שאולי יש להם כמה בעיות עם הזרקה לא עקבית של התולעים.

הזמינו זחלים מסיטונאים וספקים שלא מציגים הורמונים, אנטיביוטיקה או טיפולים אחרים לזחלים ומצליחים לשלוח ולספק דגימות חיות. כאשר הזחלים מגיעים, לבדוק כל מיכל כדי לאשר את הבריאות ואת הכדאיות של הזחלים. זחלים בריאים יהיו שקועים לחלוטין מתחת למצעים, נעים, ובעלים צבע צהוב, שזוף בהיר עם כמה זחלים המכילים סימנים שחורים או שינויי צבע לאורך הגוף.

הזחלים יכולים להיות מאוחסנים במיכלים שלהם בחלל מאוורר בטמפרטורת הסביבה עד שבועיים. כדי להכין את תאי השמרים לזיהום מלונלה גלריה, לגדל את זנים C.albicans להיות מוזרק לילה בשלושה מיליליטר של מרק שמרים טריים פפטונה-דקסטרוז לכל זן בצינורות תרבות סטנדרטית על תוף מסתובב במהירות בינונית ו 30 מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה, ולשטוף את השמרים שלוש פעמים בחמישה מיליליטר של PBS טריים אחוז צנטריפוגה.

לאחר הכביסה האחרונה, תן שימוש חוזר בתאים במיליליטר אחד של PBS טרי ולהעביר את השמרים לתוך צינור microcentrifuge. לדלל באופן סדרתי את התאים ב- PBS נוספים בריכוזים של 1 ל- 100, אחד ל- 1, 000 ו- 1 ל- 100, וספירת התאים מהדילולים של אחד ל- 100 ו- 1 ל- 1, 000. להתאים את התאים ל 2.5 פעמים 10 לתאים השביעיים למיליליטר של ריכוז PBS בצינור microcentrifuge חדש, ולאשר את הדיוק של המינון הזיהומי על ידי ציפוי הנפח המתאים של אחד ל 100, 000 דילול כדי להשיג 100 יחידות יוצרות מושבה על צלחת אחת שמרים-peptone-dextrose אגר עבור כל תרבות לשמש זיהום.

כדי להדביק את הזחלים בתאי קנדידה, ראשית להפיץ כמות קטנה של מצעים תולעי שעווה לתוך אחד ריק, 100 על 15 ס"מ צלחת פטרי סטרילית לכל שכפול ביולוגי, ו לעיקור מזרק 10 מיקרוליטר מצויד מחט 26 מד שלוש פעמים עם 10 microliters של 70% אתנול שלוש פעמים עם 10 microliters של PBS לכל לשטוף. לאחר מכן, מערבולת דילול החיסון של C.albicans, ולהעמיס 10 microliters של תאים לתוך המזרק. פתח מיכל אחד של זחלי G.mellonella, ולהשתמש באצבע כדי להפוך בזהירות את המצעים מעל כדי לחשוף זחלים, בחירת זחלים צהובים, שזופים בגודל דומה כי הם במצב בריאותי טוב עם חוסר פיגמנטציה שחורה על הגופים, באמצעות האצבעות האמצעיות והאינדקס והאגודל להרים זחל אחד באופן דומה לתפוס עיפרון.

מגלגלים את הזחל על גבו כך שהרגליים פונות כלפי מעלה, מחזיקים את אורך הגוף המלא בין האצבעות והאגודל כך שהזחל אינו מסוגל להתכרבל או להתרחק מהזריקה. עם היד השנייה, לסובב את המזרק כך המחט משופע פונה כלפי מעלה, לאט להכניס את כל אורך השכבה לתוך הגוף בצומת עם הרגל השמאלית האחורית ביותר, להבטיח כי המחט חודר לגוף ולא פשוט לדחוף את הגוף של הזחל פנימה. הצעד הקריטי ביותר בהליך זה הוא הזרקה של תולעת השעווה באופן כזה שנזק לגוף הזחל ממוזער והבולוס המלא מחוסן.

ואז להזריק את מלא 10 microliters של קנדידה inoculum, ולחלץ את המחט. בית שותף עד 10 זחלים מוזרק מאותה תרבות קנדידה בכל צלחת פטרי 100 על ידי 15 מילימטר בעקבות חיסון, ו דגירה הזחל ב 37 מעלות צלזיוס במשך שמונה ימים. בדוק את הכלים כל 24 שעות כדי לפקח על המוות.

התמותה יכולה להיות מוערכת בתחילה על ידי פיגמנטציה כהה, היווצרות של כתמים שחורים או גופים, וחוסר תנועה. כדי לאשר תמותה, השתמש פינצטה בעדינות לגלגל זחלים moribund על גבם בקלילות לתקוע את החלק התחתון של הזחל עם פינצטה. זחלים שמתחילים להתרומם לתוך עש ניתן לכלול בניתוח אבל צריך להיות מוסר אם הם מתחילים molt.

אין הבדל משמעותי בקינטיקה של מוות G.mellonella קיים בין זחלים נגועים אפס או 10 ימים לאחר ההגעה. הסימנים האופייניים למחלה מתעוררים בזחלים משני הגילאים שנכנעים לזיהום, החל מ שינוי צבע שמ מפנה את הדרך לטלאים שחורים לפני אובדן מוחלט של תנועתיות ובסופו של דבר מוות. זיהום עם C.albicans מאיץ את התהליך הזה של שינוי צבע ותחלואה, אך אינו משנה באופן משמעותי את מפל סמנים פנוטיפיים המובילים למוות בהשוואה לזחלים לא מודבקים או מוזרקים PBS.

יש לציין כי הזיהום של G.mellonella עם הומו-או הטרוזיגוטים דמויי סוג הזדווגות מכל אחד מהזנים המבודדים קלינית C.albicans מייצר שיעורים גבוהים של תמותה בהשוואה לבעלי חיים המוזרקים ל- PBS, בעוד שזריקות של זנים נגזרים פרוטוטרופיים מחשלות את האפקט הקטלני במודל זה. חשוב לזכור לבחור זחלים בריאים להיות עדינים בטיפול בזחלים. אם זנים מרובים יהיו מחוסנים, לדאוג לא לתת לתאי קנדידה לשבת PBS במשך זמן רב מדי.

בעקבות הליך זה, שיטות אחרות כמו פרופיל חיסוני ולוקליזציה קנדידה בתוך הזחלים ניתן לבצע כדי לענות על שאלות נוספות על האינטראקציות בין המארח פתוגן פטרייתי במהלך זיהום. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים לחקור את קנדידה פתוגנזה באמצעות פורמטים תפוקה גבוהה. אל תשכח כי עבודה עם קנדידה אלביקנים דורש טיפול, כי אמצעי זהירות סטנדרטיים, כולל ללבוש ציוד הגנה אישית, תמיד צריך להינקט בעת ביצוע הליך זה.