Name: ב- Rechallenge תא הגידול חוץ גופית להערכה חזוי של Chimeric אנטיגן קולטן תא T פונקציה Antitumor (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: חקור שיטת תרבית משותפת חוץ גופית להערכת תאי CAR T נגד תאי גליובלסטומה באמצעות אתגרים חוזרים של תאי גידול. שיטה זו מאפשרת ניתוח פעילות תאי T והבנה של דינמיקת התשישות וההתרחבות שלהם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים ממכון קליפורניה עבור רפואה רגנרטיבית (CIRM) גרנט TR3-05641 ומענקים NIH P30 CA33572 (ליבות). D.W. נתמך על ידי NCI מלגת 1F99CA234923-01.

IRB שלנו אינו דורש סקירה של פרוטוקול זה. אנחנו מקבלים דגימות גידול גליובלסטומה טריים שהושלכו עיר של תקווה המחלקה לפתולוגיה שנכתבו, המעבדה שלנו אין אפשרות לקבל גישה למפתח. אנו מקבלים את דגימות עם נתונים רק על מצב המחלה וטיפול מראש ביצוע ביופסיה/כריתה, בלי נתונים מזהים.
1. הכנה מדיה
<ol><li>להתכונן culturing ראשי שורות תאים GBM תאי גזע עצביים מדיה: DMEM:F12, 1:50 B27, 5 הפארין µg/mL, ו 2 mmol/L-גלוטמין; בתוספת 20 ng/mL גורם הגדילה באפידרמיס (EGF) ואת ng/mL 20 בסיסי פיברובלסט גורם גידול (FGF) פעמיים בשבוע (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>הכינו את תא T מדיה: 15 X-VIVO המכיל 10% עגל עוברית סרום (FCS); מצורפים עם 70 IU/mL rhIL-2 ו- 0.5 ng/mL 15-rhIL כל 48 שעות (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>להכין תרבות שיתוף מדיה: לקחת תאי גזע עצביים מדיה ללא תוספת EGF ו- FGF, ולהוסיף 10% FCS.</li>
	<li>להכין FACS מכתים פתרון (FSS): HBSS, 2% FCS, נאן3 (0.5 ג'י של 500 מ"ל).</li>
</ol>2. הכנת תאים סרטניים GBM
<ol><li>הקציר נמוך-המעבר GBM הגידול הספירות (TSs) על ידי צנטריפוגה ב x 300 גרם במשך 4 דקות ולמחוק את תגובת שיקוע. הערה: הגידול GBM הספירות (TSs) מופקים מן resected גידולים כפי שתואר לעיל22,23,24, ומתוחזק בתקשורת תאי גזע עצביים, בחממות עם 5% CO2 ב 37 º C.</li>
	<li>לחמם תרבות שיתוף מדיה באמבט מים 37 º C.</li>
	<li>להוסיף 1 מ"ל של accutase קר GBM TSs, מביצועם TSs מאת pipetting עבור s 30-60, וכן להפסיק דיסוציאציה על-ידי הוספת 5 מיליליטר חמים תרבות שיתוף מדיה. הערה: GBM TSs לא צריך להישמר על accutase עבור יותר מ 5 דקות.</li>
	<li>קציר תאים GBM על ידי צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 4 דקות, למחוק את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בתאים 2 מ"ל של תרבות שיתוף מדיה.</li>
	<li>לקבוע ריכוז התא באמצעות מונה הכדאיות התא. הערה: תא הכדאיות בטח > 70%.</li>
</ol>3. הכנת רכב T תאים
<ol><li>פחות מ- 24 שעות לפני וזמינותו, לקחת 100 µL בתרבית תאים T המכונית לתוך צינור cytometry זרימה ולהוסיף 2 מ של FSS. הערה: תאי T המכונית היו שנוצר כפי שתואר לעיל11,21 ותרבותית בתקשורת תא T.</li>
	<li>צנטריפוגה ב x 300 גרם 4 דקות ו להשליך תגובת שיקוע.</li>
	<li>2 מ של FSS לרחוץ את התאים, צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 4 דקות, להוסיף ולמחוק את תגובת שיקוע.</li>
	<li>כתם התאים עם נוגדן המתאים כדי לציין ביטוי המכונית ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. הערה: לדוגמה, אם מכונית, ממוקדות IL13Rα2 תיאר בעבר25 משמש, ואז כתם עם נוגדן anti-IL13.</li>
	<li>לשטוף פעמיים עם 2 מ של FSS וניתוח exn המכונית באמצעות cytometer של זרימה.</li>
	<li>לקבוע את המכונית % בתאי T באמצעות האסטרטגיה המגביל שמוצג באיור 1ב'.</li>
	<li>ביום של תרבות משותפת, לקצור את כל המכונית T תאים על ידי צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 4 דקות, למחוק את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בתאים 2 מ"ל של תרבות שיתוף מדיה.</li>
	<li>לקבוע ריכוז התא באמצעות מונה הכדאיות התא. הערה: תא הכדאיות בטח > 70%.</li>
</ol>4. הגדרת הגידול – תרבות משותפת תא T
<ol><li>לדלל תאים סרטניים כדי ריכוז של 0.16 מיליון למ"ל עם תרבות שיתוף מדיה.</li>
	<li>בהתבסס על המכונית %, לדלל בתאי T רכב על ריכוז של 0.04 מיליון מכוניות+ תאים/mL עם תרבות שיתוף מדיה. הערה: לדוגמה, אם המכונית היא 50% והוא תא T ריכוז 0.4 מיליון למ"ל, ואז לגרום לדילול 1:5 כדי לקבל את הריכוז הסופי של 0.04 מיליון מכוניות+ תאים/מ ל....</li>
	<li>פיפטה 100 µL של תאים סרטניים מדולל לתוך כל טוב של צלחת תרביות רקמה 96-ובכן שטוח התחתונה.</li>
	<li>פיפטה 100 µL של תאי T המכונית מדולל לבאר כל המכילה תאים סרטניים, לערבב היטב. הערה: כל תרבות משותפת תא הגידול-T ינותחו בנקודות זמן 4. 4-6 משכפל ייתכן שיהיה צורך בכל פעם נקודת מבוסס על ניתוח שונות, אבל < 3 משכפל לכל נקודת זמן לא מומלץ; ראה טבלה 1 platemap נציג.</li>
	<li>לשמור על הצלחת ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 מיכלים.</li>
</ol>5. גידול התא Rechallenge
הערה: Rechallenge מתקיים ב- 2, 4, 6 ימים שלאחר ההתקנה הראשונית תרבות משותפת (איור 1א').
<ol><li>הקציר, מביצועם GBM TSs כמתואר לעיל (שלבים 2.1-2.6).</li>
	<li>Resuspend תאים GBM-ריכוז של 0.64 מיליון למ"ל.</li>
	<li>לקבוע הבארות תרבות משותפת צריך rechallenge (ראה טבלה 1) בזהירות להסיר מדיה µL 50 מהחלק העליון של כל טוב.</li>
	<li>להוסיף 50 µL של השעיה תאים GBM לבאר כל, מערבבים היטב ולאחר מכן תחזיר את הצלחת לתוך 37 ° C, 5% CO2 מיכלים.</li>
</ol>6. הקציר דגימות וזרימה ניתוח Cytometric
הערה: דוגמאות יהיה לקצור בעמדה 1, 3, 5, 7 ימים שההתקנה הראשונית תרבות משותפת, עם 1, 2, 3 ו- 4 סיבובים של הגידול אתגר, בהתאמה.
<ol><li>לחמם 0.05% פתרון טריפסין-EDTA waterbath 37 º C.</li>
	<li>לקבוע את הבארות צריך קציר ולא להעביר את המדיה לתוך צלחת חדשה של 96-ובכן סיבוב המדרגה.</li>
	<li>פיפטה µL 50 של טריפסין-EDTA לתוך הבארות לעכל תאים סרטניים שנותרו ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.</li>
	<li>תחת מיקרוסקופ, אשר שהתאים יש תלושים מלמטה.</li>
	<li>פיפטה סביב החלק התחתון טוב resuspend תאים מנותק ולאחר מכן להעביר טריפסין-EDTA המכיל תאים מנותקת הבארות המקביל של צלחת 96-ובכן עגול-התחתון.</li>
	<li>צנטריפוגה צלחת 96-ובכן עגול-התחתון ב 300 x גרם, 4 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות, ואז למחוק את תגובת שיקוע.</li>
	<li>להוסיף 200 µL/טוב של FSS לרחוץ את התאים, צנטריפוגה ב 300 x גרם, 4 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות ולאחר מכן למחוק את תגובת שיקוע.</li>
	<li>Resuspend תאי 100 µL/טוב FSS המכיל נוגדנים (ראה טבלה של חומרים), הכתם תאים ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.</li>
	<li>להוסיף µL 100/FSS טוב לתאים, צנטריפוגה ב 300 x גרם, 4 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות, ואז להשליך תגובת שיקוע.</li>
	<li>להוסיף 200 µL/טוב של FSS לרחוץ את התאים, צנטריפוגה ב 300 x גרם, 4 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות ולאחר מכן למחוק את תגובת שיקוע.</li>
	<li>Resuspend תאים עם 100-200 µL/טוב של FSS עם 500 ננוגרם למ"ל דאפי, ולאחר מכן לנתח דגימות ידי cytometry זרימה.</li>
</ol>7. פונקציונלי וניתוח פן Otypic של תאי T המכונית
<ol><li>לאחזר את קבצי הנתונים זרימה cytometer, שער כל (דאפי-) תאים חיים (איור 1C).</li>
	<li>לכמת תאים סרטניים על ידי gating CD45 את– האוכלוסייה ותאי T המכונית על ידי gating את CD45+, רכב + האוכלוסייה (איור 1C). הערה: אם תאים סרטניים אקספרס CD45 (למשל ראג'י תאים לימפומה), אנטי-CD3 מכתים יכול לשמש כדי להבדיל בין תאי T מתאי הגידול.</li>
	<li>מגרש תא הגידול ומספר תא T המכונית במהלך הזמן.</li>
	<li>לזהות תא T ההפעלה על-ידי הביטוי משותף של 4-1BB, CD69. הערה: סמנים אלה פני השטח ניתן לנתח תא T הפעלה 6-24 h פוסט משותף התרבות הראשונית.</li>
	<li>לזהות תא T מיצוי על ידי הביטוי של PD-1, לג-3 וטים-3.</li>
	<li>מזהים תא T זיכרון מצב על-ידי הביטוי של CD45RO ושל CD62L.</li>
</ol>

<ol><li>Porter, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+cells+persist+and+induce+sustained+remissions+in+relapsed+refractory+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 7 (303), (2015).</li>
<li>Brentjens, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD19-targeted+T+cells+rapidly+induce+molecular+remissions+in+adults+with+chemotherapy-refractory+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 5 (177), (2013).</li>
<li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li>
<li>Lee, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+expressing+CD19+chimeric+antigen+receptors+for+acute+lymphoblastic+leukaemia+in+children+and+young+adults%3A+a+phase+1+dose-escalation+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">T cells expressing CD19 chimeric antigen receptors for acute lymphoblastic leukaemia in children and young adults: a phase 1 dose-escalation trial.</a> The Lancet. 385 (9967), 517-528 (2015).</li>
<li>Yong, C. S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T-cell+therapy+of+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">CAR T-cell therapy of solid tumors.</a> Immunology and Cell Biology. 95 (4), 356-363 (2017).</li>
<li>Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+therapy+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor therapy for cancer.</a> Annual Review of Medicine. 65, 333-347 (2014).</li>
<li>Priceman, S. J., Forman, S. J., Brown, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smart+CARs+engineered+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Smart CARs engineered for cancer immunotherapy.</a> Current Opinion in Oncology. 27 (6), 466-474 (2015).</li>
<li>Fesnak, A. D., June, C. H., Levine, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+T+cells%3A+the+promise+and+challenges+of+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Engineered T cells: the promise and challenges of cancer immunotherapy.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (9), 566-581 (2016).</li>
<li>Esensten, J. H., Bluestone, J. A., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Therapeutic+T+Cells%3A+From+Synthetic+Biology+to+Clinical+Trials%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Engineering Therapeutic T Cells: From Synthetic Biology to Clinical Trials.</a> Annual Review of Pathology. 12, 305-330 (2017).</li>
<li>Lim, W. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Principles+of+Engineering+Immune+Cells+to+Treat+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer.</a> Cell. 168 (4), 724-740 (2017).</li>
<li>Brown, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+IL13Ralpha2-Targeted+Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cells+for+Improved+Anti-tumor+Efficacy+against+Glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Optimization of IL13Ralpha2-Targeted Chimeric Antigen Receptor T Cells for Improved Anti-tumor Efficacy against Glioblastoma.</a> Molecular Therapy. , (2017).</li>
<li>Long, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-1BB+costimulation+ameliorates+T+cell+exhaustion+induced+by+tonic+signaling+of+chimeric+antigen+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">4-1BB costimulation ameliorates T cell exhaustion induced by tonic signaling of chimeric antigen receptors.</a> Nature Medicine. 21 (6), 581-590 (2015).</li>
<li>Cherkassky, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CAR+T+cells+with+cell-intrinsic+PD-1+checkpoint+blockade+resist+tumor-mediated+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Human CAR T cells with cell-intrinsic PD-1 checkpoint blockade resist tumor-mediated inhibition.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 3130-3144 (2016).</li>
<li>Priceman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-stimulatory+signaling+determines+tumor+antigen+sensitivity+and+persistence+of+CAR+T+cells+targeting+PSCA%2B+metastatic+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Co-stimulatory signaling determines tumor antigen sensitivity and persistence of CAR T cells targeting PSCA+ metastatic prostate cancer.</a> Oncoimmunology. 7 (2), 1380764(2018).</li>
<li>Eyquem, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+a+CAR+to+the+TRAC+locus+with+CRISPR%2FCas9+enhances+tumour+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection.</a> Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).</li>
<li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquisition+of+full+effector+function+in+vitro+paradoxically+impairs+the+in+vivo+antitumor+efficacy+of+adoptively+transferred+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Acquisition of full effector function in vitro paradoxically impairs the in vivo antitumor efficacy of adoptively transferred CD8+ T cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 115 (6), 1616-1626 (2005).</li>
<li>Malandro, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+Abundance+of+Tumor-Specific+CD4%28%2B%29+T+Cells+Potentiates+Efficacy+and+Alters+Susceptibility+to+Exhaustion%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Clonal Abundance of Tumor-Specific CD4(+) T Cells Potentiates Efficacy and Alters Susceptibility to Exhaustion.</a> Immunity. 44 (1), 179-193 (2016).</li>
<li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+arrests+effector+T+cell+differentiation+and+generates+CD8%2B+memory+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling arrests effector T cell differentiation and generates CD8+ memory stem cells.</a> Nature Medicine. 15 (7), 808-813 (2009).</li>
<li>Klebanoff, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+memory+self%2Ftumor-reactive+CD8%2B+T+cells+confer+superior+antitumor+immunity+compared+with+effector+memory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).</li>
<li>Gattinoni, L., Klebanoff, C. A., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paths+to+stemness%3A+building+the+ultimate+antitumour+T+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Paths to stemness: building the ultimate antitumour T cell.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (10), 671-684 (2012).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma-targeted+CD4%2B+CAR+T+cells+mediate+superior+antitumor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma-targeted CD4+ CAR T cells mediate superior antitumor activity.</a> JCI Insight. 3 (10), (2018).</li>
<li>Kahlon, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+recognition+and+killing+of+glioblastoma+multiforme+by+interleukin+13-zetakine+redirected+cytolytic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Specific recognition and killing of glioblastoma multiforme by interleukin 13-zetakine redirected cytolytic T cells.</a> Cancer Research. 64 (24), 9160-9166 (2004).</li>
<li>Brown, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+and+killing+of+brain+tumor+stem-like+initiating+cells+by+CD8%2B+cytolytic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Recognition and killing of brain tumor stem-like initiating cells by CD8+ cytolytic T cells.</a> Cancer Research. 69 (23), 8886-8893 (2009).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+stem+cells+derived+from+glioblastomas+cultured+in+bFGF+and+EGF+more+closely+mirror+the+phenotype+and+genotype+of+primary+tumors+than+do+serum-cultured+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines.</a> Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).</li>
<li>Brown, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regression+of+Glioblastoma+after+Chimeric+Antigen+Receptor+T-Cell+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Regression of Glioblastoma after Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy.</a> The New England Journal of Medicine. 375 (26), 2561-2569 (2016).</li>
<li>Salter, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteomic+analysis+of+chimeric+antigen+receptor+signaling+reveals+kinetic+and+quantitative+differences+that+affect+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteomic analysis of chimeric antigen receptor signaling reveals kinetic and quantitative differences that affect cell function.</a> Science Signaling. 11 (544), (2018).</li>
<li>Rossi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preinfusion+polyfunctional+anti-CD19+chimeric+antigen+receptor+T+cells+are+associated+with+clinical+outcomes+in+NHL%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Preinfusion polyfunctional anti-CD19 chimeric antigen receptor T cells are associated with clinical outcomes in NHL.</a> Blood. 132 (8), 804-814 (2018).</li>
<li>Garcia-Diaz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+Receptor+Signaling+Pathways+Regulating+PD-L1+and+PD-L2+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Interferon Receptor Signaling Pathways Regulating PD-L1 and PD-L2 Expression.</a> Cell Reports. 19 (6), 1189-1201 (2017).</li>
<li>Walker, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Antigen+and+Receptor+Densities+Regulate+Efficacy+of+a+Chimeric+Antigen+Receptor+Targeting+Anaplastic+Lymphoma+Kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Tumor Antigen and Receptor Densities Regulate Efficacy of a Chimeric Antigen Receptor Targeting Anaplastic Lymphoma Kinase.</a> Molecular Therapy. 25 (9), 2189-2201 (2017).</li>
<li>Fraietta, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+response+and+resistance+to+CD19+chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29+T+cell+therapy+of+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia.</a> Nature Medicine. 24 (5), 563-571 (2018).</li>
<li>Fraietta, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+TET2+promotes+the+therapeutic+efficacy+of+CD19-targeted+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Disruption of TET2 promotes the therapeutic efficacy of CD19-targeted T cells.</a> Nature. 558 (7709), 307-312 (2018).</li>
</ol>

הבונה המכונית המתואר בעבודה זו יש ברשיון על-ידי ביו מוסטנג., inc., אשר S.J.F. ו- C.E.B. לקבל תשלומי תמלוגים. כל המחברים אחרים מצהירים שאין פוטנציאל ניגודי אינטרסים.

Assay האתגר הזה תא הגידול שחוזרת על עצמה מספקת גישה נוחה כדי להעריך את המכונית T תא פונקציונלי האון, באמצעות התקנה במבחנה זה recapitulates את נטל הגידול גבוהה המשויך הגידול ויוו מודלים. במהלך זה assay 7 ימים, תאי T רכב לעבור ארבעה סיבובים של אתגר גידול (תרבות משותפת הראשונית, 3 x rechallenge), יצירת סביבה שבה תאי T מותש עלול לאבד שלהם יכולת להגיב עם אתגר גידול למרות לתגובה הראשונית חזק. חיסול תאי גידול והתרחבות תא T המכונית מייצגים שתי הקריאות הבאות יסוד זה ניתן לרכוש מ- assay הזה, בעוד הפנוטיפים של תאי T המכונית ניתן לנתח בקלות על ידי צביעת משטח או תאיים סמנים המציינים ההפעלה תא T, תשישות ו/או זיכרון. זה וזמינותו נוח גם לשלב עם אפשר לקבל ניתוח של המכונית T תאים transcriptome פרוטאום או זרחן-פרוטאום21,26, polyfunctionality תא T אשר כבר אומץ כדי לחזות לתגובות הקליניות27. יתר על כן, תאים סרטניים יכול להיבדק גם על תגובתם מסתגלת נגד תא T חסינות כגון הפרשת ציטוקינים28. מאז דגימות נקצרים בנקודות זמן מרובים, וזמינותו הזה מאפשר לא רק רעש סטטי, אלא גם ניתוח דינאמי של המכונית T בהתנהגות התא בעת להגיב למספר עודף של תאים סרטניים.
וזמינותו היא חזקה במיוחד להשוות את העוצמה אפקטור של תאי T המכונית מיקוד אנטיגן זהה אבל עם עיצובים שונים ו/או בתהליכי ייצור. השתמשנו assay זו כדי לזהות את CD4+ המכונית T תאים הצליחו לתווך מעולה לטווח ארוך אפקטור פונקציה מ- CD8+ תאים21. זה הוצג גם שאת היעילות המכונית ויוו היה בקורלציה עם cytotoxicity בנקודות זמן מאוחר יותר (D5-D7) במהלך הזה assay, נוסף המדגיש את נחיצות באמצעות הגידול החוזרות על עצמן אתגר להערכה תא T המכונית במבחנה. למרות תאים GBM שימשו הדוגמה של התאים היעד כאן, זה וזמינותו שיוכלו בקלות לאמץ שילוב תא T-גידול שונים. ראוי לציין, בהתנהגות התא המכונית T יכול להשתנות גם על צפיפות אנטיגן שונים, הנדסת תאים סרטניים לבטא רמות שונות של אנטיגנים יישוב סיפק את הכלי כדי לחקור להתרחשויות מולקולריים רציפים זיהוי המכונית29. לכן, ניתן לנצל assay הזה גם לבחון את דפוס ההפעלה של תאים T רכב מסוימים נגד מטרות שונות.
מאז הכדאיות תא היעד והתרחבות תא T רכב שני המפרט מראש של assay הזה, זה קריטי בכל התרבויות שיתוף להתחיל עם בת קיימא (> 70%) הגידול ותאי T. בעת ביצוע התהליכים rechallenge, הפעולה של התקשורת שואבת (שלב 5.3) כדאי לא להפריע הגידול ותאי T בתחתית הבארות, כדי לא להציג וריאציות מיותרים של ספירת תאים. בעת ביצוע וזמינותו זה בשורות תא היעד ההשעיה, מומלץ כדי לקצור בתאי שנותרה על ידי צנטריפוגה לפני הגידול תא rechallenge.
מגבלה אחת של זה וזמינותו היא כי הגדרת הפרמטרים (יחסי E:T של תרבות משותפת הראשונית rechallenge) צריכה תיקון בהתבסס על שילובים שונים של המכונית-הגידול. לדוגמה, אם תאים סרטניים אקספרס רמה משמעותית של מולקולות מעכבות-חיסונית (למשל PD-L1), יחס גבוה יותר של E:T מומלץ בהתחשב בעובדה הכולל הרג יעילות הוא לקוי לעומת תאים סרטניים PD-L1-נמוכה. לפני החלת וזמינותו שילובים רכב-גידול חדש, מחקר פיילוט מומלץ לקבוע את התנאים אופטימליים, בדרך כלל המאפשר תאי T המכונית הקטלניים ביותר במקצועות וזמינותו לחסל > 80% של תאים סרטניים על נקודת הקצה. מאז קשר ישיר תא תא נדרש עבור המכונית בתיווך תא T להרוג, אם תאים סרטניים התווית על-ידי קרינה פלואורסצנטית, ואז הפאנל של ניתוח תזרים cytometric שתישמר בהתאם (למשל אם בתאי הגידול היו GFP שכותרתו, ואז כל FITC-מצומדת נוגדנים לא אמור לשמש).
הפעילות הקלינית של תאי T מכונית נגד מחלות ממאירות של תא B הוביל שתי תרופות שאושרו על-ידי ה-FDA. עם זאת, התגובה הראו וריאציה ניכר על פני לחולים שונים27,30,31, אשר היה מבואר לתאם עם המאפיינים פנוטיפי של מוצרים רכב30. Assay האתגר הזה הגידול שחוזרת על עצמה במבחנה נוספת מספק גישה פונקציונלית לבחון את הפוטנציה אפקטור המכונית בנוסף אפיוני פנוטיפי וייצור ציטוקינים polyfunctionality, ומאפשר להקרנה תפוקה גבוהה יותר של מוצרים קליניים לעומת הגידול ויוו מודלים תוך שמירה על אמינות חזויה. בסך הכל, וזמינותו הזה יכול לשמש לבדיקת תפקודי תא T עבור המכונית T תא עיצוב, פיתוח פרה-קליניים ומחקרים קליניים.

אימונותרפיה בעזרת chimeric אנטיגן קולטן (מכונית)-תאי T מהונדסים ראה מבטיח תוצאות נגד תא B ממאירות1,2,3,4, בעוד הפוטנציאל של פילוח גידולים אחרים ממשיך להיות תחת החקירה5,6,7. התקדמות נהדרת נעשתה כדי למטב לבנות את המכונית, תהליך הייצור ואת החולה משטרי אינפוזיה לפני6,7,8, ביולוגיה סינתטית רומן גישות צפויים להגדיל שלהם התמדה, בטחון, הגידול ירידה לפרטים9,10. לעומת זאת, זה היה קשה, שדורשת להעריך כראוי את הפוטנציאל הטיפולי של תאי T המכונית כדי להנחות את הבחירה הטובה ביותר לתרגום קליניים. המודל ביותר עד כה כדי להעריך את תפקוד תא T המכונית הוא בעכברים immunodeficient הנושאת גידול אנושי xenografts, לפיה המכונית T תאים בחן על יעילות antitumor, לעומת תא טיטרציה מינונים11,12 , 13 , 14 , 15. מחקרים מאתר ויוו אלה הם עתירי עבודה, זמן רב, במיוחד בעת הקרנת מספר רב של פרמטרים. מחקרים נוספים, אין ויוו יכול לרסנם מאת הנגישות של העכבר זנים, מתקני טיפול בבעלי חיים, טכניקות טיפול בעלי חיים. לכן, יש צורך לפתח מבחני מתורבת יותר נוח המאפשר קריאות מהירה של פעילות אפקטור, המשקפים גם בנאמנות את הפונקציה antitumor ויוו של תאים אלה T.
שיטות קונבנציונליות כדי לקבוע את cytotoxicity של תאי T במבחנה התמקדו הגילוי של degranulation, ייצור ציטוקינים, היכולת lyse התאים היעד התווית על-ידי radioisotope (קרי, מבחני שחרור של כרום). בעוד אלה מבחני אינפורמטיבי להגדרת רכב T תא ירידה לפרטים והכרה היעד שנותבו מחדש, הם לעתים קרובות נכשלים לשקף ויוו antitumor הפוטנציאל של13,12,תאי T מהונדסים16. במקרים מסוימים, במבחנה הורג פעילות מבחני לטווח קצר הראה של מתאם הפוך עם פונקציית antitumor ויוו16. כזה חוסר עקביות הוא כנראה התוצאה של יחסי אפקטור: המטרה גבוהות (E:T) בשימוש אלה מבחני במבחנה, ולכן חוסר יכולת להבדיל בין המוצרים תא T המכונית נוטים תשישות17. לעומת זאת, במהלך הגידול ויוו מיגור T תאים בדרך כלל מגיבים נגד נטל הגידול גדול, ובכך הדורשים מספר סיבובים על הורגת ונהיגה לאחר מכן תא T בידול ותשישות18,19, 20, אשר הוא אחד המחסומים העיקריים נגד הגידול יעיל אישור מאת המכונית T תאים12,13. בינתיים, מבחני הרג במבחנה לטווח קצר ביותר לעשות גם לא readout הבדלים תא T התפשטות, ואילו בחולים מטופלים תא T המכונית יכולת הרחבה תא T המכונית הוא מתואם חריפה לתגובות הקליניות4. לפיכך, וזמינותו במבחנה המתאים היה צריך לסכם את תנאי הגידול גבוהה נטל, אינדוקציה של תא T תשישות, ומאפשר המדידה של תא T התפשטות.
כאן נתאר אסטרטגיה כדי להעריך את המכונית T תאים לגידול חוזרות הורג את הפוטנציאל, עם assay פשוט תרבות משותפת במבחנה... תא T שונה אפקטור פעילות הפרמטרים יכולים בו זמנית להיבדק, כולל הרג תא היעד, המכונית T תא הרחבת זיכרון או תשישות-הקשורים פנוטיפים. התוצאות שהופקו מן assay זו לתאם עם השפעת antitumor ויוו המכונית T תאים, אפשר לנצל כדי להעריך את העוצמה של המכונית T התא מוצרים. בעוד אנו מתארים assay כדי להעריך את תאי T המכונית, ממוקדות IL13Ra2 נגד GBM ראשי שורות21, זה ניתן בקלות להתאים כל פלטפורמה תא T המכונית.

<table><tbody><tr><td>0.05% טריפסין/0.53 מ"מ EDTA ב-HBSS ללא קורנינג סידן ומגנזיום</td><td></td><td>MT25051CI</td><td></td></tr><tr><td>1 מ' Hepes</td><td>Irvine</td><td>Scientific 9319</td><td></td></tr><tr><td>200 מ"מ L-גלוטמין</td><td>Cambrex Bio Science</td><td>17-605E</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) - FluoroPure grade</td><td>Invitrogen</td><td>D21490</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>טכנולוגיות תאים חדשניות</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>Aldesleukin Proleukin (rhIL-2)</td> <td>נוברטיס אונקולוגיה</td><td>NDC 0078-0495-61</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD137, PE</td><td>BD Biosciences</td><td>555956</td><td>4B4-1</td></tr><tr><td>Anti-CD19, PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>557835</td><td>SJ25C1</td></tr><tr><td>Anti-CD3, PERCP</td><td>BD Biosciences</td><td>340663</td><td>SK7</td></tr><tr><td>Anti-CD4, FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>340133</td><td>SK3</td></tr><tr><td>Anti-CD45, PERCP</td><td>BD Biosciences</td><td>340665</td><td>2D1</td></tr><tr><td>Anti-CD45RO, PE</td><td>BD Biosciences</td><td>561137</td><td>UCHL1</td></tr><tr><td>Anti-CD62L, APC</td><td>BD Biosciences</td><td>559772</td><td>DREG-56</td></tr><tr><td>Anti-CD69, APC</td><td>BD Biosciences</td><td>340560</td><td>L78</td></tr><tr><td>Anti-CD8, APC-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>348793</td><td>SK1</td></tr><tr><td>Anti-IL-13, PE</td><td>BD Biosciences</td><td>340508</td><td>JES10-5A2</td></tr><tr><td>Anti-LAG-3, PE</td><td>eBiosciences</td><td>12-2239-41</td><td>3DS223H</td></tr><tr><td>Anti-PD-1, APC-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>329921</td><td>EH12.2H7</td></tr><tr><td>Anti-TIM-3, APC</td><td>eBiosciences</td><td>17-3109-42</td><td>F38-2E2</td></tr><tr><td>B-27 תוסף תזונה ללא סרום (50x)</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>קורנינג 96 מיקרופלטות פוליסטירן תחתון שטוח שקופות היטב מטופלות TC, עטופות בנפרד, עם מכסה, סטריליות (מוצר #3596)</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי מוגדר, HI IR</td><td>Hyclone Labs</td><td>SH30070.03IH</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F-12 50:50 (1x) ללא גלוטמין</td><td>MediaTech, Inc.</td><td>15-090-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM High Gluc w/o L-Glu, Na Pyr 1 L</td><td>Invitrogen</td><td>11960051</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-Ham's F12 תערובת 50:50 עם L-גלוטמין ו-15 מ"מ HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT10092CV</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Irvine Scientific</td><td>9224</td><td></td></tr><tr><td>FCS Hyclone</td><td></td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>Heparin Nadium (1,000 U/mL)</td> <td>אמריקאי פרמצבטיקה</td><td>401811B</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant</td><td>Milteni Biotech Inc.</td><td>BIS013220&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x עם CA ו-CA MG</td><td>Irvine Scientific</td><td>9236</td><td></td></tr><tr><td>PBS עם 1 מ"מ EDTA (ללא Ca2+ או Mg2+)</td> <td>VWR Scientific Products</td><td>PB15009A</td><td></td></tr><tr>מו"פ<td>EGF אנושי רקומביננטי</td><td> D Systems</td><td>236-EG-200</td><td></td></tr><tr>מו"פ<td>FGF אנושי רקומביננטי</td><td> D Systems</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>rhIL-15 דילול עבודה (10 ng/&micro; L)</td><td>CellGenix, US Operations</td><td>tF0297</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אזיד (NaN3)</td><td>Sigma</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST40R</td><td>Thermo Scientific</td><td>41693700</td><td></td></tr><tr><td>TC-HEPES BUFFER (1 מ') SOLN 100ML&nbsp;</td><td>IRVINE SCIENTIFIC CORP</td><td>6472</td><td></td></tr><tr><td>Tecnol מסכת נוהל</td><td>קימברלי-קלארק</td><td>47117</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15</td><td>לונזה</td><td>BW04-744Q</td><td></td></tr></tbody></table>

ב- rechallenge תא הגידול חוץ גופית להערכה חזוי של chimeric אנטיגן קולטן תא t פונקציה antitumor

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

בתחום chimeric אנטיגן קולטן (מכונית) תא T טיפול מתקדם במהירות עם שיפורים עיצוב המכונית, גישות ג'ין-הנדסה, ייצור אופטימיזציות. אתגר אחד עבור המאמצים פיתוח, עם זאת, כבר הקמת מבחני במבחנה כי robustly יכול ליידע את מבחר המוצרים אופטימלית של תא T המכונית להצלחה טיפולית ויוו. מבחני הגידול-פירוק במבחנה רגיל להיכשל לעיתים קרובות לשקף את הפוטנציאל antitumor האמיתי של תאי T רכב עקב זמן קצר יחסית תרבות משותפת תא T גבוה ליחס הגידול. כאן נתאר שיטת הפריה תרבות משותפת כדי להעריך את המכונית T תא רקורסיבית להרוג את הפוטנציאל-גידול גבוה תא המון. זו assay, הפונקציה ציטוטוקסיות לטווח ארוך, קיבולת המקדימות של תאי T הרכב נבדק במבחנה מעל 7 ימים עם מטרות גידול נוספים מנוהל לתרבות שיתוף בכל יום אחר. Assay הזה יכול להיות יחד עם הפעלת תא T פרופיל, תשישות, זיכרון פנוטיפים. שימוש assay הזה, אנחנו בהצלחה כיבדתם את ההבדלים פנוטיפי פונקציונלי בין CD4+ ו CD8+ המכונית T תאים נגד גליובלסטומה תאים (GBM), המשקף פעילות antitumor ויוו דיפרנציאלי שלהם ב- orthotopic xenograft מודלים. שיטה זו מספקת גישה נתיישב כדי להעריך את עוצמת תא T המכונית וכדי להבהיר את הווריאציות פונקציונלי על פני מוצרים שונים של תא T המכונית.

באמצעות וזמינותו שתוארו לעיל, אנו כיבדתם את העוצמה אפקטור דיפרנציאלית, להרוג את הדינמיקה מתווכת על-ידי CD4+ ו CD8+ המכונית T תאים. התוצאות המובאות כאן להמחיש את ההבדל בין CD4+ ו CD8+ המכונית T תאים, שנוצר מתורם בריא עצמאית של הפרסום הקודם שלנו21.
דרך assay degranulation הרגיל, היינו יכול לצפות כי שניהם CD4+ ו CD8+ המכונית T תאים באותה מידה הופעלה כנגד תאים GBM המבטאים אנטיגן יישוב, כמצוין על-ידי הביטוי של CD107a וציטוקין תאיים (איור 2א). עם זאת, שימוש assay לאתגר את הגידול חוזרות, מצאנו כי CD4+ אבל לא CD8+ המכונית T תאים הציג את היכולת של הרג מרובים-עגולים (איור 2B). CD4+ המכונית T תאים גם מושגת הרחבה יותר לעומת תאי CD8 + במהלך הזה assay (איור 2C). ההבדל של הרחבה בין קבוצות משנה של תא T המכונית רק נצפו מ D3 לאחר שני סיבובים של הגידול אתגר (1:12 E:T), בעוד ההבדל של cytotoxicity נצפתה שמתחילים ב- D5 אחרי שלושה סיבובים של הגידול אתגר (1:20 E:T), המציין מבחני לטווח קצר הצליח להבהיר את ההבדלים העוצמה של מוצרים שונים של תא T המכונית. כאשר ה-1:1 מעורב CD4+ ו CD8+ T הרכב תאי חלות זה וזמינותו, הם נמצאו כדי להכות CD8+ אבל לא CD4+ המכונית T תאים על cytotoxicity לטווח ארוך (איור 2B). ההרחבה של CD8+ המכונית T CD4 יישומית במשותף הסחרור הושפע תאים תאים+ , בעוד CD4+ הרחבה תא T המכונית היה עכבות בנוכחות CD8+ תאים (איור 2C).
כדי להסביר את המנגנון המבדיל את הפעילות אפקטור בין CD4+ ו CD8+ המכונית T תאים, אנחנו קודם לאשר הזה 24 שעות לאחר הראשונית בשיתוף תרבות, שניהם CD4+ ו CD8+ המכונית T תאים היו וזהובה מופעל (איור 3 A). בינתיים, כמצוין על-ידי ביטוי CD45RO ו CD62L, שני CD4+ ו CD8+ המכונית T תאים הראתה מעבר מן הזיכרון המרכזית (CD45RO+, CD62L+) לזיכרון אפקטור (CD45RO+, CD62L–) גן # מושגים בסיסיים במהלך הגידול החוזרות על עצמן אתגר (איור 3ב). ואז אנחנו מאופיין התאים-D3 של זה assay, זמן לפני תת-קבוצות תא T המכונית התחילה להצגת ההבדל פונקציונלי. תא t תשישות סומן על-ידי הביטוי שיתוף של קולטני מעכבות PD-1, לג-3 וטים-315,21, אשר הראו CD8 הזה+ המכונית T תאים היו נוטים יותר תשישות לעומת CD4+ המכונית T תאים ( איור 3 C). עוד יותר, אין הבדל נראה על CD8+ תשישות תא T המכונית בהיעדר/הנוכחות של CD4 יישומי שיתוף+ תאים (איור 3C), המציין את CD8 CD4-induced+ הרחבה תא T המכונית אינה הקשורים פונקציה אפקטור טוב יותר.
יחד, התוצאות של זה וזמינותו זיהו את CD4+ T המכונית תאי CD8 ביצועים טובים יותר+ תאים בפרט cytotoxicity לטווח ארוך. למרות דומה לטווח קצר cytotoxicity (1-3 ימים, פעם אחת rechallenged), CD4+ המכונית T תאים אפקטור מתמשכת פונקציה עם אתגר גידול החוזרות על עצמן, תוך CD8+ תאים הפך מותש ונכשל לשלוט תא הגידול. כאשר שתי תת-קבוצות, מעורבים, CD4+ המכונית T תאים הקל ההרחבה של CD8+ המכונית T תאים, אך המצב תשישות של CD8+ תאים לא היו יושבחו, והתוצאה היא העדר אפקט סינרגיסטי בין שתי הקבוצות. דומה ההבדל בין CD4+ ו CD8+ המכונית T תאים במודל ויוו נחשבה שתואר לעיל21. אכן, CD8+ המכונית T תאים הצליחו לתווך סיווג הגידול לטווח הקצר אבל בעקבות עם אנטיגן-חיוביות הישנות; לעומת זאת, CD4+ טיפול תאי T המכונית גרמו להכחדת לטווח ארוך הגידול21, וזה מזכיר את הפוטנציאל שלהם הרג חוזרות באמצעות וזמינותו rechallenge במבחנה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59275/59275fig1.jpg"> איור 1 : אסטרטגיה הסכימה וניתוח של אתגר חוזרות assay. ציר הזמן של הגידול החוזרות על עצמן אתגר assay וסכימה של (A). עבור כל טוב, תאי T המכונית היו קודם תרבותי משותף עם תאים GBM PBT030-2 (4,000 רכב + תאים, תאים סרטניים 16,000) והזמנו מחדש עם תאים סרטניים 32,000 בכל יום אחר (D2, D4 ו- D6). ניתוח של הגידול תא T המכונית תא מס, כמו גם פנוטיפ תא T הרכב מבוצעת D1, D3, D5 ו D7. (B) Gating אסטרטגיה כדי לקבוע הרכב % ב- T תאים לפני הגדרת תרבות משותפת. (ג) Gating אסטרטגיה של תאים חיים, תאים סרטניים ותאים המכונית T מ וזמינותו אתגר חוזרות. (ד) גידול תאים מספר בתקופות שונות של rechallenge וזמינותו, תרבותי משותף עם תאי T untransduced. קווי שגיאה = ±SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59275/59275fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59275/59275fig2.jpg"> איור 2 : אתגר חוזרות assay מגלה הבדלים הרג ואת proliferative העוצמה בין CD4+ ו CD8+ המכונית T תאים. Degranulation (א) וציטוקין תאיים מכתים של CD4+ ו CD8+ המכונית T תאים לאחר 5 שעות של תרבות משותפת עם תאים GBM (E:T = 1:1). (B) CD4+, CD8+ או מעורבות (CD4:CD8 = 1:1) ותאי T המכונית הוחלו על האתגר חוזרות assay, תאים סרטניים קיימא היו לכמת. p &lt; 0.05, * *p &lt; 0.01, * * *p &lt; 0.001 לעומת CD4+, באמצעות חד-כיווני אנובה עם בדיקות השוואה מרובים של Bonferroni. (ג) CD4+ ו CD8+ הרחבה תא T המכונית במהלך הגידול החוזרות על עצמן אתגר וזמינותו. השוואה של (משמאל לימין) CD4+ vs CD8+, משנה יחיד; CD4+ vs CD8+, בתוך הקבוצה "מעורבת"; CD4+, יחיד לעומת מעורבים; CD8+, יחיד לעומת מעורב. p &lt; 0.05, * *p &lt; 0.01, * * * באמצעות מבחן t של סטודנט אינטראקציתפיסי &lt; 0.001. קווי שגיאה = ±SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59275/59275fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59275/59275fig3.jpg"> איור 3 : ניתוח של תא T פנוטיפ במהלך האתגר חוזרות assay. (א) 4-1BB, CD69 מכתים בתאי T רכב-D1 של וזמינותו. (B) CD45RO ו- CD62L מכתים של תאי T רכב לפני החלת rechallenge assay (קלט), ו- D3 ו- D7 של וזמינותו. (ג) ביטוי משותף של PD-1, לג-3 וטים-3 על תאי T רכב-D3 של וזמינותו. (למעלה) Gating אסטרטגיות כדי לזהות תאים T המבטאים קולטנים מעכבות 1, 2 או 3. (למטה) השוואה של: CD4+ (משנה יחיד), תאי CD8+ (משנה יחיד), תאי CD8+ תאים (בתוך הקבוצה "מעורבת"). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59275/59275fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/59275/59275table1.jpg"> טבלה 1: צלחת נציג מפת rechallenge ההתקנה.

כאן נתאר שיטת הפריה תרבות משותפת כדי באופן רקורסיבי אתגר, ממוקדות גידול תאי T, המאפשר ניתוח פנוטיפי ופונקציונליים של פעילות antitumor תא T...

ב- Rechallenge תא הגידול חוץ גופית להערכה חזוי של Chimeric אנטיגן קולטן תא T פונקציה Antitumor

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

פרוטוקול זה מספק לטווח ארוך, במבחנה, שיטה תפקודית להערכת קולטן אנטיגן כימרי, או תאי T CAR, באמצעות אתגר תא גידול חוזר. טכניקה זו היא פחות זמן רב, ופחות עבודה אינטנסיבית מאשר vivo CAR T תפקוד התא הערכה תוך השגת ייצוג מדויק של היעילות האמיתית נגד הגידול. טכניקה זו במבחנה מאפשרת הקרנת תפוקה גבוהה והתמיינות של עוצמת אנטי גידול תא T CAR.אשר יש את היישום הפוטנציאלי להערכת יעילות קלינית של מוצרי תא T רכב. התחל על ידי ניתוס גידולים גליובלסטומה מתרבות גידול גליובלסטומה. עם מיליליטר אחד של אקוטאז קר, ו-30 עד 60 שניות של צינורות.כאשר הגידולים שובשו, לעצור את התגובה עם חמישה מיליליטר של מדיום שיתוף תרבות חם. ו גלולה מתלי תא הגידול על ידי צנטריפוגה. להשעות מחדש את התאים גליובלסטומה ל 1.6 פעמים 10 לתאי הגידול החמישי למיליליטר של ריכוז בינוני coculture טרי, ולדלל תאי T שנקטפו מתרבות תאים CAR T לאחוז המתאים של תאי T חיוביים CAR למיליליטר של ריכוז בינוני שיתוף תרבות.לאחר מכן, להוסיף 100 microliters של תאים סרטניים מדוללים לכל באר של 96 צלחת תכלית רקמה תחתונה שטוחה היטב. ו-100 מיקרוליטרים של תאי CAR T לכל באר של תאי גידול עם ערבוב עדין. ואז למקם את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני אינקובטור.בימים 2, 4 ו-6 של תרבות, הסר בזהירות 50 מיקרוליטרים של מדיום מכל באר של תא הגידול, לוחית תא T המיועדת לריכלנגה על פי השולחן. לאחר מכן, להוסיף 50 microliters של השעיה תא גליובלסטומה טרי, מוכן כפי שהוכח רק, אבל עם מספר תא כפול של שיתוף התרבות הראשונית לכל באר עם ערבוב עדין. ולהחזיר את הצלחת לאינקובטור תרבות התא.ימים אחד, שלושה, חמישה ושבעה של תרבות משותף, להעביר את supernatant מכל באר כדי להיות שנקטפו לתוך צלחת תחתונה חדשה 96 גם עגול על פי השולחן ולהוסיף 50 microliters של מראש מחומם 0.5% טריפסין EDTA לתוך כל בינוני מדולדל היטב. לאחר חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס, לאשר כי התאים התנתקו מהתחתית של כל באר על ידי מיקרוסקופ אור, בעדינות pipette פתרון האנזים סביב החלק התחתון של כל באר כדי לעכל מחדש את התאים. לפני העברת ההשעיה התא מנותק לתוך הבארים המתאימים המתאימים של צלחת 96 בארות חדשה.גלולה התאים על ידי צנטריפוגה, ולשטוף את התאים עם 200 microliters של פלואורסצנטיים מופעל תא מיון פתרון עומד, או FFS ל הבאר עם צנטריפוגה שנייה. להשעות מחדש את כדורי 100 microliters של קוקטייל נוגדנים עניין 100 microliters של SSS ל הבאר עבור דגירה 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. סוף הדגירה להסיר כל נוגדן מאוגד על ידי רציף 100 ו 200 microliter FSS שוטף מחדש להשעות את התאים ב 100 כדי 200 microliters של כתם גרעיני DAPI ו FSS.לאחר מכן, לנתח את התאים על פי פרוטוקולי ניתוח ציטומטרי זרימה סטנדרטיים. לניתוח פונקציונלי ופנוטיפי של תאי CAR T לאחר תא הגידול שיתוף תרבות, לאחזר את קבצי הנתונים מן ציטומטר הזרימה, ושער כל התאים השליליים DAPI לחיות. כדי לכמת את תאי הגידול, שער האוכלוסייה השלילית CD45.כדי לכמת את תאי T CAR שער CD45 חיובי CAR אוכלוסייה חיובית. לאחר מכן לתכנן את הגידול ואת מספרי תאים CAR T במהלך הזמן של הניסוי, זיהוי הפעלת תא T על ידי ביטוי שותף של 41BB, ו CD69. תשישות תאי T על-ידי הביטוי PD1, LAG3 ו- TIM3, מצב זיכרון תא T LAG3 ו- TIM3, ו מצב זיכרון תא T על-ידי CD45RO וביטוי ליגנד CD62.לפי CD45RO וביטוי ליגנד CD62. הן CD4 חיובי, ו CD8 חיובי CAR T תאים להיות מופעל באותה מידה נגד תאים גליובלסטומה המבטאים את אנטיגן היעד כפי שצוין על ידי CD107a שלהם ביטוי ציטוקיני תאית. עם זאת, כפי שהוערך על ידי אתגר גידול חוזר SA, CD4 חיובי, אבל לא CD8 חיובי, תאי CAR T מסוגלים הרג עגול מרובים.CD4 חיובי CAR T תאים גם להשיג הרחבה חזקה יותר. כאשר CD4 חיובי, ו CD8 חיובי CAR T תאים מעורבבים ביחס אחד לאחד, שילוב תא זה החוצה מבצע CD8 חיובי, אבל לא CD4 חיובי CAR T תאים במונחים של cytotoxicity לטווח ארוך. בנוסף, ההתרחבות של CD8 חיובית תאי CAR T נגרמת על ידי תוספת של CD4 תאי T חיוביים.בעוד CD4 חיובי CAR T הרחבת תא מעוכב בנוכחות תאים חיוביים CDa. 24 שעות לאחר שיתוף התרבות הראשונית, הן CD4 חיובי ו CD8 חיובי CAR T תאים מופעלים באופן דומה. במהלך אתגר הגידול החוזר על עצמו, הן CD4 חיובי ו CD8 חיובי CAR T תאים להדגים מעבר מ CD45RO חיובי, CD62 ליגן חיובי זיכרון מרכזי פנוטיפ, כדי CD45RO חיובי CD62 ליגן שלילי אפקטר זיכרון פנוטיפ.CD8 חיובי CAR T תאים גם נוטים יותר תשישות לעומת CD4 חיובי CAR T תאים כפי שהוערך על ידי PD1 שלהם, LAG3, ו TIM3 ביטוי לאחר שלושה ימים של שיתוף תרבות. יתר על כן, אין הבדלים שנצפו CDa חיובי CAR T תא תשישות בנוכחות או היעדר CD4 חיובי תאי T, המציין כי CD4 המושרה CD8 חיובי CAR T התא הרחבה אינה קשורה לתפקוד משפיע טוב יותר. חיבור זה יכול להיות גם יחד עם מיון תאי T טופס שיתוף התרבות לבצע ניתוח נוסף על transcriptomes, פרותומיקה, וגנים ספציפיים של עניין.אתגר גידול חוזר זה יכול לשמש גם כפלטפורמה לחקירת האירועים הביולוגיים לאחר זיהוי גידול תא T CAR.

in-vitro-tumor-cell-rechallenge-for-predictive-evaluation-chimeric

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

בסרטון זה, אנו מדגימים את בדיקת אתגר הגידול החוזר כדי להעריך את פוטנציאל הריגת הגידול החוזר של תאי CAR T במהלך עומס תאי גידול גבוה. יתר על כן, ניתן לנתח את תאי CAR T באמצעות ציטומטריית זרימה כדי לקבוע את תת-האוכלוסיות השונות של תאי CAR T בדגימה.

בדיקת אתגר גידול חוזר: בדיקת תרבית חוץ גופית להערכת תאי T של קולטן אנטיגן כימרי (CAR) לפוטנציאל הרג גידולים חוזרים

סרטון זה מדגים טכניקה לייצור קולטן אנטיגן כימרי (CAR) תאי T ex vivo. תאי T אנושיים מודגרים בחרוזים מגנטיים המצופים בנוגדנים נגד CD3 ונגד CD28, יחד עם מדיום בתוספת אינטרלוקין-2 (IL-2), המוביל להפעלה ושגשוג של תאי T. מוצגים וקטורים לנטי-ויראליים טרנסגניים, המאפשרים לרנ"א המהונדס להשתלב בגנום המארח ולבטא את הטרנסגן. התוצאה היא שתאי T המומרים מבטאים קולטני אנטיגן כימריים (CARs) על פני השטח שלהם. תאי T נקצרים בנקודות זמן מוגדרות כדי להעריך ביטוי CAR ושימור בהקפאה.

טכניקת Ex Vivo לייצור תאי T קולטני אנטיגן כימריים

סרטון זה מדגים טכניקה ליצירת תאי T מסוג קולטן אנטיגן כימרי ספציפי לגידול (CAR). וקטורים רטרו-ויראליים הנושאים RNA מהונדס מעורבבים עם תאי טחול בתווך בתוספת אינטרלוקין-2 כדי לקדם הישרדות ושגשוג של תאי T. לאחר מכן התערובת מועברת לצלחת המצופה במקטעי פיברונקטין אנושיים רקומביננטיים וצנטריפוגה כדי להקל על איחוי הנגיף עם התא, מה שמאפשר לרנ"א להשתלב בגנום המארח ולייצר מכוניות הקשורות לפני השטח המכוונות לאנטיגן הגידול.

טכניקת Ex Vivo ליצירת תאי T קולטני אנטיגן כימריים ספציפיים לגידול

סרטון זה מדגים בדיקת מבחנה לאימות פעילות תאי T של קולטן אנטיגן כימרי (CAR). תאי לימפומה של תאי B המבטאים אנטיגן CD19 ולוציפראז ציטופלזמי מיוצרים בתרבית משותפת עם תאי CAR T ספציפיים ל- CD19. קשירת CAR ל- CD19 על גידול גורמת לתאי CAR T לשחרר ציטוקינים ורעלים הגורמים לציטוטוקסיות של תאי הגידול. פעילות תאי CAR T מוערכת על ידי כימות הציטוקין המשתחרר וירידה ביולומינסנציה בתיווך לוציפראז בתאי הגידול.

בדיקת מבחנה להערכת הפעילות האנטי-סרטנית של תאי CAR T ספציפיים לגידול

פרוטוקול זה תוכנן כדי להעריך immunotherapeutic cytotoxicity T-cell (המכונית T-cell) שנותבו מחדש נגד 3D מובנות תאים סרטניים (spheroids) בזמן אמת.

וזמינותו הרג ספרואיד על-ידי תאי T המכונית

אנו מתארים כמותית בזמן אמת במערכת החשיבה של הפריה חוץ גופית כדי להעריך את העוצמה של מערכת הקולטן אנטיגן כימאריק תאי T מיקוד תאי הגידול נוזלי ומוצק. פרוטוקול זה ניתן להרחיב כדי להעריך תאים אחרים החיסון החיסונית, כמו גם טיפולים משולבים.

שיטת העוצמה בזמן אמת עבור שצ אנטיגן קולטן התאים T המיקוד תאים מוצק המטולוגי סרטן

פרוטוקול זה מתאר את הדור כירורגי של גידולים הלבלב אורתודפית ואת העיכול המהיר של גידולים מבודדים מבודד מורטין הלבלב. לאחר העיכול, אוכלוסיות קיימא תאים החיסונית יכול לשמש ניתוח נוסף במורד הזרם, כולל לשעבר גירוי vivo של תאים T לאיתור ציטוקינים תאיים ידי הזרימה cy, try.

הדור של הלבלב אורתוטואט גידולים ואפיון Vivo Ex של תאים הסתננות של הגידול תא T

כאן, אנו מתארים פרוטוקול שבו מודל xenograft הנגזר מחולה לוקמיה לימפובלסטית חריפה משמש כאסטרטגיה להערכה וניטור רעילות הקשורה לקולטן אנטיגן כימרי ממוקד CD19 תאי T.

הערכה של רעילות הקשורה לקולטן אנטיגן כימרי T באמצעות מודל עכבר קסנוגרפט שמקורו בלוקמיה לימפובלסטית חריפה

כאן, אנו מתארים שיטה ליצירת טיפות תחליב כפולות המכילות תא T אחד ותא מטרה סרטני כדי לבחון הרג תאים ברמת התא הבודד. שיטה זו מאפשרת כימות כפול הן של מולקולות ציטוטוקסיות והן של אפופטוזיס של תאי מטרה בתוך אוכלוסייה גדולה של תאי T.

בדיקת ציטוטוקסיות מבוססת טיפות להערכת תאי T קולטני אנטיגן כימריים ברמת התא הבודד

פרוטוקול זה נועד לשחזר ולהתכונן התאים היעד נדיר מתערובת עם תאי המטרה ללא רקע אפיון גנטי מולקולרי ברמת תא בודד. איכות ה-DNA שווה לתאים בודדים שאינם מטופלים ומאפשר יישום תא בודד (הקרנת שני מבוסס, ממוקד ניתוח).

הגברה עושר מראש ולא כל הגנום תא היעד עבור אפיון במורד הזרם תא בודד

חקור שיטת תרבית משותפת חוץ גופית להערכת תאי CAR T נגד תאי גליובלסטומה באמצעות אתגרים חוזרים של תאי גידול. שיטה זו מאפשרת ניתוח פעילות תאי T והבנה של דינמיקת התשישות וההתרחבות שלהם.

ב- Rechallenge תא הגידול חוץ גופית להערכה חזוי של Chimeric אנטיגן קולטן תא T פונקציה Antitumor

גלה סרטונים נוספים