ב Vivo שני צבעים 2-פוטון הדמיה של תאי כתב שתייגת גנטית בעור

שינויים מורפולוגיים מתרחשים בתאי החיסון החיסונית התגובה בעקבות ההפעלה ולקדם שינויים בגיוס הסלולר. ניצול 2-פוטון הדמיה בשילוב עם חלבון מהונדס בצורה גנטית לפיברוסט-1 (FSP1)-יצור; tdTomato פלומפולט-stop-floxed ^(tb/tb) קו העכבר הירוק fluorescently מתויג ליפופוליל-fitc, אנחנו יכולים להדגים ספיגה ספציפית מאוד של ליפופוליד בפיברוהכדורים ושינויים מורפולוגיים ב vivo.

הפרוטוקול שלנו מאפשר לנו לדמיין כיצד תאים המתויגים באופן פלואורסצנטי מגיבים לגירוי היקפי דלקתי בבעל חיים בזמן אמת. הדמיה 2-Photon מאפשר הדמיה עמוק לתוך הרקמה של דגימה חיה, שמירה על שלמות התאים שלהם microenvironment שלהם ומספק ייצוג מדויק של המערכת הביולוגית. הנשימה מזיזה את הכף לאורך זמן, וגורמת לטשטוש ולאובדן מישור המוקד.

הקפד להדביק את הכף בחוזקה עם סרט על משטח יציב לפני הדמיה. בזה אתה חייב להיות מסוגל למצוא מישור מתאים של עניין, לוודא כי המטרה קרובה לכפות הרגליים מבלי לגעת והוא ישירות מעל אתר ההזרקה. לפני תחילת ההליך, הפעל את מערכת ריבוי הפוטון ובחר את הסובייקטיבי 25X.

מניחים מנגנון סטריאוטוקסי על הבמה של מיקרוסקופ רב פוטון ולחבר את המנגנון למכונת משלוח הרדמה. מניחים פיסת נייר שחור מט על פני השטח של המנגנון כנקודת חיבור עבור כפה העכבר. הגדר את סורק תהודה עם אזור סריקה קבוע של 512 על 512 מיקרומטר.

כוונן את לייזרי העירור לאותות חלבון פלואורסצנטיים 930 ו- 1, 100 ננומטר עבור אותות חלבון פלואורסצנטיים ירוקים ואדומים בהתאמה. השתמש במראה דיכרוית של 690 עד 1, 050 ננומטר כדי לכוון את נתיב האור של שני לייזרים העירור למטרה אחת המאפשר לייזר העירור מכוון 930 ננומטר להיות משתקף לסורק הראשי לייזר מכוון 1, 100 ננומטר לעבור ישירות לתוך הסורק הראשי. לאחר מכן הגדר את כוח הלייזר של FITC ל-5% ואת החלבון הפלואורסצנטי הירוק ל-20% וכבה את האורות העיליים.

להדמיית in vivo, הרדמה של העכבר וחלוקה לרמות בפרוטוקול הטקסט. אשר חוסר תגובה לצביטת בוהן בעכבר הרדמה והנח את העכבר במנגנונים הסטריאוטוקסיים עם גישה לקוביית אף. השתמש בקלטת שחורה כדי להדביק בחוזקה את הכף האחורית לפיסת הנייר השחור על אזורים פרוקסימליים ודיסטליים לאזור העניין, ולוודא שהמשטח הצמחי של הכף אינו מובס ופונים כלפי מעלה לכיוון המטרה.

מניחים כמות נדיבה של חומר סיכה על בסיס מים על פני השטח plantar של הכף. לגעת במטרה חומר סיכה כדי ליצור עמודה של נוזל בין הכף לבין המטרה. השתמש באור העירור FITC כדי להתמקד בשכבה העורית של הכף, המאשר כי עגבניות דים טנדם מתויג fibroblasts ניתן לדמיין.

תמונה את האזור של תאים הממוקמים ממש מתחת לפני השטח plantar של הכף האחורית עם שני לייזרים. לרכוש מעידת זמן של 15 דקות של כ 5 עד 10 פרוסות Z בערך מיקרומטר אחד לפרוסה כדי ליצור ייצוג בסיסי של הסביבה. כאשר ההדמיה הבסיסית הושגה, לטעון מזרק המילטון זכוכית 25 microliter עם חמישה מיקרוגרם של ליפופוליסכריד אצמוי FITC, או LPS, לכל 20 microliters של PBS.

לנהל את הפתרון על ידי הזרקת תוך פלנטר לתוך הכף האחורית הניסיונית מבלי להפריע לתאומת הכף. ואז תמונה אזור של תאים הממוקמים ממש מתחת לפני השטח plantar של הכף האחורית עם שני לייזרים. לרכוש 60 כדי 120 דקות לשגות זמן של כ 5 עד 10 פרוסות Z בערך מיקרומטר אחד לפרוסה כדי לזהות את ספיגת התא בתיווך intraplantar של LPS FITC.

מכיוון שאין פלואורסצנטיות אינהרנטית על ידי התאים בתוך השכבה העורית, ניתן לראות מספר עצום של תאים בשכבה העורית של הכף האחורית לוקח LPS מתויג פלואורסצנטי לאחר הזרקת תוך פלנטר בעכבר מסוג פראי. לאחר הזרקת LPS FITC, רק חלבון ספציפי fibroblast אחד חיובי fibroblasts להביע אגרה כמו קולטן ארבע לאגד ולכבוש את החלבון מוזרק עם רמה גבוהה של לוקליזציה שיתוף עם תג עגבניות עמום טנדם לידי ביטוי על ידי תאים אלה. לעומת זאת, עכברים שיש להם אגרה כמו קולטן ארבע דפק מתוך הגוף כולו לאגד ולכבוש LPS לאחר ההזרקה.

אכן, צלליות התא גלויים לאחר הזרקת LPS FITC המציין כי התרופה מתפזרת בנוזל interstitial סביב תאים, אבל הוא לא ממש להיות כבול על ידי קולטן. הדבר החשוב ביותר שיש לזכור בפרוטוקול זה הוא להבטיח כי הכף משותקת, כך שאין עיוותים בסרטון עקב תנועה או נשימה. באמצעות הליך זה, ניתן לעקוב אחר גיוס תאים מתויגים באופן פלואורסצנטי לאזור לאחר פציעה והשינויים המורפולוגיים בתגובת התא לגירוי לאורך זמן.

אז הדמיה 2-Photon מאפשר לחוקרים לשלב עכברים כתב גנטי ותרכובות מתויגות פלואורסצנטי כדי להעריך מה קורה בבעל חיים חי לאחר זריקה.