Name: השימוש של העכבר בתאי סרטן הגידול בתוך שיטת הפלישה מחוץ למבחנה כמדד של התנהגות התא אונגניים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: חקור מנגנוני פלישת תאי סרטן שד בעכברים באמצעות מבחן הפלישה מחוץ למבחנה. שיטה זו מאפשרת למדוד נדידת תאים דרך מטריצת חלבון ולזהות מטרות תרפויטיות פוטנציאליות במחקר הסרטן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי גרנט R15CA169978 מן המכונים הלאומיים לבריאות. מימון נוסף הגיע מאוניברסיטת וילאנובה.

כל הניסויים והשיטות בוצעו כפי שאושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים של אוניברסיטת וילאנובה (IACUC).
1. ביטוי גנים בתוך מתורבת העכבר תאים סרטניים הגידול
<ol><li>ראשית, הכן את קווי התא לבדיקה.</li>
	<li>
השתמש במושבה רבייה של עכברים BALB/cV. עכברים אלה לשאת את המתח balb/קורות חיים של וירוס גידול של חלב של העכבר, מועבר לגורים חלב6,7. 50 אחוזים של נקבות רבייה לפתח גידולים בחלב בגיל 10 חודשים.
	<ol>
<li>כדי ליצור קו תאי גידול, להקריב סכר שנושא גידול באמצעות פרוטוקול IACUC מאושר. משרים את עור הבטן ב-70% אטוח ומסירים את הגידול בתנאים סטריליים במכסה זרימה למינארי. גידולים הם תת עורית, אז לדאוג כדי למנוע את הצפק.</li>
		<li>מקום שברי הגידול מאזורים שאינם נקרופטיים בצלחת פטרי עם כמות קטנה של תמיסת מלוחים הנקס סטרילי מאוזן (HBSS) והבשר מאוד דק עם סכין גילוח סטרילי.</li>
		<li>להעביר את הגושים תאים מפוזרים T25 התרבות התא בקבוקון המכיל 5 mL בינונית הנשר השתנה או DMEM (4.5 g/L גלוקוז, פנול אדום, ו-L-גלוטמין) שיושלם עם 50% העוברי שור סרום או FBS ו 1% אנטיביוטי/antimycotic פתרון. לגדול תאים בתוך מבחנות תרבות התא מטופלים בחממה עם 5% CO2 ו 100% לחות ב 37 ° c.</li>
		<li>לשטוף את התאים הלא מחסיד לאחר 24-48 h ולהחליף את DMEM עם 50% FBS ו 1% אנטיביוטיקה/פתרון antimycotic. . החזר את התאים לחממה</li>
		<li>החליפו מדיית תרבות נוזלית כל 3 ימים.</li>
		<li>פצל או מעבר את התאים כאשר הם 90% שוטפת. הסר מדיית תרבות ושטוף תאים מחסיד עם HBSS (ללא סידן או מגנזיום). מודדת תאים עם 0.25% טריפסין-EDTA פתרון עבור 1-5 דקות ב 37 ° צ' עד התאים מעוגלים ומנותקים. לדלל תאים 1:10 בתקשורת תרבות טרייה ולהוסיף בקבוקון חדש. בקבוקון תרבות תא T-25 מחייב 5-8 מ ל התרבות, 5 מ ל של HBSS לשטוף, ו 1 מ ל טריפסין-EDTA למעבר. . החזר את הבקבוקון לחממה</li>
		<li>הפחת את ריכוז ה-FBS ל 40% לאחר המעבר הראשון, ואז 30% אחרי המעבר השני, ואז 20% אחרי המעבר השלישי, ולבסוף 10% עבור כל המעברים הבאים. תהליך הקמת הצמיחה במדיום DMEM דיום סטנדרטי עם 10% FBS דורש ארבעה מעברים ו 2-8 חודשים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
לאחר שקווי התא (s) מבוססים, לשנות את הביטוי של החשוד אונגנים על ידי העברה של שרין מיקוד mRNA או CRISPR עבור גנים שאינם חיוניים.
	<ol>
<li>ליצור עמידות לאנטיביוטיקה עמידים בפני תאים עם שיבוטים בודדים אשר מאומתים על ידי כתם מערבי ו/או RT-qPCR לתוצאות עקביות, עם זאת, הטרנספנויות ארעי יכול לעבוד גם מאז הצורך רק דורש 22 h. בקרת קווי תא עם יש צורך גם ברצפי יעד שאינם ספציפיים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. שיטת הפלישה לחוץ-גופית
<ol><li>לגדול חסיד בתאי הגידול הפטמות של העכבר בבקבוקון T25 עד 70-90% confluent עבור יום 1 של הניסוי. הערה: קווי תאים אחרים או תנאים ניסיוניים עשויים לדרוש מדיית תרבות תא שונה. לדוגמה, אם הורמון מגיב בתאי סרטן השד נבדקים, הפחם מסוננים סרום עשוי להיות צורך להסיר תרכובות המפעילות אסטרוגן או קולטני הורמונים אחרים.</li>
	<li>הכן את מוסיף קאמרית Boyden על ידי התחממות אותם לטמפרטורת החדר (מ-20 ° c אחסון) עבור כ 20 דקות במכסה של תרבות התא. מנע הפשרת מחזורי הקפאה עבור שימוש בתוספות. השתמש בשלוש הוספות (משכפל) כדי ליצור נתונים חוקיים מבחינה סטטיסטית עבור כל קו תא עבור כל ניסוי.
	<ol>
<li>הוסף טרום מחמם 37 ° c סרום בחינם מדיית DMEM הבאר ולאחר מכן את ההכנסה. עבור הוספות שתוכננו עבור 24-היטב מנות, להוסיף 500 μL של הסרום ללא הנסיוב dmem לבאר ולאחר מכן 500 μL של הסרום ללא הצורך להכניס את הקרום והג הנקבובי משני הצדדים. הערה: עבור מוסיף גדול המיועדים עבור מאכל 6-היטב, השתמש 2 מ ל של DMEM ללא סרום משני הצדדים.</li>
	</ol></li>
	<li>מניחים את הצלחת עם מוסיף לתוך החממה 37 התרבות של התאים ° c עם 5% CO2 ו 100% לחות עבור לפחות 2 h כדי מימה ביסודיות ו acclimate.</li>
	<li>הכן תאים על-ידי הסרת מדיית הצמיחה ושטיפה את התאים באמצעות 5 מ"ל HBSS.
	<ol>
<li>הסר את HBSS והוסף 1 מ"ל 0.25% טריפסין-EDTA פתרון עבור 1-5 דקות ב-37 ° צ' או עד שתאים מופיעים מעוגלים או מראים סימנים של ניתוק מהבקבוקון.</li>
		<li>הקש בעדינות על הבקבוקון כדי לנתק את כל התאים. השהה מחדש את התאים ב-5 מ ל של Dמאמ + 10% FBS והעבר לשפופרת צנטריפוגה סטרילית בעלת 15 מ"ל.</li>
		<li>צנטריפוגה את התאים ב 1,000 x g עבור 5 דקות כדי לסדר את התאים בעדינות. הסר את המדיה והחלף עם DMEM של 5 mL כדי להשעות מחדש את התאים.</li>
		<li>חזור על הצנטריפוגה וההשעיה במדיה ללא סרום פעמיים יותר עבור סך של 3 שוטף.</li>
		<li>השהה מחדש ביסודיות את התאים ב -5 מ ל האחרון של DMEM ללא סרום וודא שאין גושים של תאים.</li>
	</ol></li>
	<li>לקבוע את ריכוז התא באמצעות הומוציטומטר. . תספור רק תאים שניתן לעשות לדלל את השעיית התא כדי 5 x 104 תאים/ml ב 5 מ ל של הסרום-dmem חינם. הערה: ריכוז זה מניב 2,500 תאים לכל הוספה בצלחת של 24 שעות ביממה. מספר זה של תאים מספיק עבור תאים סרטניים אגרסיבי עם שיעור גבוה של הגירה ופלישה. שורות תא פחות אגרסיביות עשויות לדרוש תאים נוספים, עד 10,000 תאים לכל הוספה עבור התאים הנצפה. אם הפלישה התא מופחת צפוי, לשקול למקסם את התאים הפולשים על ידי הגדלת מספר התא. אם הפלישה לתא מוגברת צפוי, התחל עם פחות תאים.</li>
	<li>הסר את הצלחת תרבות התא מהאינקובטור ומכניס בעדינות את המדיה מתוך ההוספה. הרם את התותב ושף את המדיה מבאר. לעבוד במהירות, להוסיף את כימוסטנט לתא התחתון. עבור מאכל 24-היטב, הוסף 750 μL של DMEM זיכרון עם 5% FBS.
	<ol>
<li>הצב את ההכנסה בבאר והוסף את התאים להוספה. עבור צלחת 24-היטב, השתמש 500 μL של השעיית תא. עבור הוספת הצלחת 6-היטב, השתמש 2.5 mL של כימוכ 2 מ ל של תאים. ודא כי לא קיימים בועות אוויר משני צדי הקרום.</li>
		<li>החזר את המנה לחממה לתרבות התאים במשך 22 שעות.</li>
	</ol></li>
	<li>לאחר 22 שעות, לתקן ולהכתים את התאים. הכינו פתרון של 1% פאראמפורמלדהיד בתמיסת מלח באגירה בגודל 1x (PBS) עבור קיבעון.
	<ol>
<li>בצלחת נקייה 24 היטב של תרבות התא, להוסיף 1 mL של קבע בארות בודדות כך יש אחד טוב עבור כל הוספה.</li>
		<li>להכין את הפתרון מכתים (טרי עשוי) של 0.1% קריסטל סגול (w/v) בתמיסה של PBS עם 10% אתנול (v/v). באופן דומה, להוסיף 1 מ ל של פתרון הצביעת לבאר נקי בצלחת התרבות 24 היטב עבור כל הוספה.</li>
		<li>הסר כל אחד הוספת אחת בכל פעם עם מלקחיים ולמקם משטח כותנה סטרילי בתוך הכנס לנקות את הצד העליון של הקרום כדי להסיר תאים שהועברו.</li>
		<li>. אני חוזר עם דגימה מכותנה נוספת הקרום חזק למדי, כל כך עדין לחץ בזמן שווינג אינו מסכן את שלמות הקרום.</li>
		<li>הסר את כל המדיה הנותרת מתוך החלק הפנימי של ההוספה והוסף 750 μL של PBS כדי לשטוף את התאים המנותקים.</li>
		<li>. הסירו את הערוץ וחזרו על הכביסה מניחים את התותב לתוך היטב המכיל תיקון כדי לתקן את התאים שהועברו בצד התחתון של הקרום. חזור על הפעולה עבור כל התוספות.</li>
		<li>תקן את התוספות עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>הקיבעון הבא מסיר את ההוספה. שטוף שוב את ההוספה עם 750 μL PBS.</li>
		<li>מניחים את התותב לתוך הבאר עם פתרון הכתמים כדי להכתים את כל התאים הועברו וקבוע. הכתם את התאים במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. הערה: עבור 6-היטב מוסיף, השתמש 2 מ ל של פתרון קבע, 2 ml כתמים פתרון, ו 2 מ ל כביסה PBS.</li>
	</ol></li>
	<li>השתמש בגביע עם מים מזוקקים כדי להכתים את התוספות. הסר את התוספות וטבול לתוך המים המזוקקת עד שהמים הזורמים מההוספה ברורים.
	<ol>
<li>הסירו את טיפות המים העודפות והניחו את התוספות על נייר סינון צדדי לאוויר יבש (בדרך כלל בן לילה).</li>
	</ol></li>
	<li>הכן את קרום להדמיה על ידי תיוג מיקרוסקופ זכוכית נקייה שקופית עבור כל הוספת ומקום טיפה קטנה של שמן טבילה מיקרוסקופ במרכז השקופית.
	<ol>
<li>ניתוק הקרום מתוך התותב באמצעות אזמל לחתוך סביב היקף הקרום על החלק הפנימי של הוספת פלסטיק.</li>
		<li>להסיר את הקרום באמצעות מלקחיים ומקום על החלק העליון של טיפת השמן על השקופית כדי להחזיק אותו במקום. הערה: הקרומים דקים מאוד ומאוד קלים, כך שניתן לאבד אותם בקלות באמצעות זרימת אוויר עדינה.</li>
	</ol></li>
</ol>3. דימות וניתוח
<ol><li>כיוון שהממברנות הנקבוביות ברורות ומכתימה תאים עם גביש סגול מעניקים להן ניגוד, השתמשו במיקרוסקופ אור מורכב כדי לראות את התאים. השתמש מצלמה ו/או תוכנה לכמת עבור דגימות רבות, אך אינו הכרחי. הצגת תאים בהגדלה של 5x, 10x או 20x. לקוונפיקציה, השתמשו במספר תמונות שאינן חופפות בהגדלה של 10x. לחלופין, ספור את כל התאים שהועברו על הקרום בהגדלה של 10 x.</li>
	<li>לקבוע את המספר הכולל של תאים הפולש או תאים לכל אזור עבור כל הדגימות. עבור כל ניסוי, בצע כל תנאי בתוך הבחינה עם שלושה מוסיף שכפול וחזור על מספר פעמים על תוצאות מועילות מבחינה סטטיסטית.</li>
	<li>בעת השוואת קווי תאים שונים עם קצבי צמיחה וקצבי הגירה שונים, בצע ניסוי מקביל להשוואת תאים הפולשים דרך מטריצת חלבון ומשווים להרכבה קאמרית של Boyden ללא מטריצת חלבונים (תאים שהועברו בלבד). חישוב אחוז הפלישה עבור כל קו תא (מספר התאים פלשו/מספר תאים שהועברו x 100%). הערה: גישה זו יכולה לסייע בהשוואת שיעור הפלישה לתעריפי ההגירה. אם השוואת תנאים שונים המוחלים על אותו קו תא, חישוב הפלישה בלבד הוא חישובים רלוונטיים יותר. הקצה החיצוני של הקרום לפעמים יש מספר גבוה יותר של תאים מאשר האזורים המרכזיים, ולכן, פחות מדויק. אם זה קורה, להוציא את התאים האלה מן הכמת ולוודא שכל התאים יוסרו על ידי מסיר כותנה בניסוי חוזר.</li>
</ol>

<ol><li>He, X., Lee, B., Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-ECM+Interactions+in+Tumor+Invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-ECM Interactions in Tumor Invasion.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 936, 73-91 (2016).</li>
<li>Albini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+in+vitro+assay+for+quantitating+the+invasive+potential+of+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells.</a> Cancer Research. 47 (12), 3239-3245 (1987).</li>
<li>Simon, N., Noel, A., Foidart, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+in+vitro+reconstituted+basement+membrane+assay+to+assess+the+invasiveness+of+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invasion+and+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Evaluation of in vitro reconstituted basement membrane assay to assess the invasiveness of tumor cells.</a> Invasion and Metastasis. 12 (3-4), 156-167 (1992).</li>
<li>Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+from+discovery+and+ECM+mimicry+to+assays+and+models+for+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 79-80, 3-18 (2014).</li>
<li>Kleinman, H. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+basement+membrane+matrix+with+biological+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Matrigel: basement membrane matrix with biological activity.</a> Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).</li>
<li>Kang, J. J., Schwegel, T., Knepper, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+similarity+between+the+long+terminal+repeat+coding+regions+of+mammary-tumorigenic+BALB%2FcV+and+renal-tumorigenic+C3H-K+strains+of+mouse+mammary+tumor+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Sequence similarity between the long terminal repeat coding regions of mammary-tumorigenic BALB/cV and renal-tumorigenic C3H-K strains of mouse mammary tumor virus.</a> Virology. 196 (1), 303-308 (1993).</li>
<li>Slagle, B. L., Lanford, R. E., Medina, D., Butel, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+mammary+tumor+virus+proteins+in+preneoplastic+outgrowth+lines+and+mammary+tumors+of+BALB%2FcV+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Expression of mammary tumor virus proteins in preneoplastic outgrowth lines and mammary tumors of BALB/cV mice.</a> Cancer Research. 44 (5), 2155-2162 (1984).</li>
<li>Schmidt, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+oncogenic+phenotype+by+the+nuclear+body+protein+ZC3H8%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Regulation of the oncogenic phenotype by the nuclear body protein ZC3H8.</a> BMC Cancer. 18 (1), 759(2018).</li>
<li>Neophytou, C., Boutsikos, P., Papageorgis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Mechanisms+and+Emerging+Therapeutic+Targets+of+Triple-Negative+Breast+Cancer+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Molecular Mechanisms and Emerging Therapeutic Targets of Triple-Negative Breast Cancer Metastasis.</a> Frontiers in Oncology. 8, 31(2018).</li>
<li>Al-Alwan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fascin+is+a+key+regulator+of+breast+cancer+invasion+that+acts+via+the+modification+of+metastasis-associated+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Fascin is a key regulator of breast cancer invasion that acts via the modification of metastasis-associated molecules.</a> PloS One. 6 (11), e27339(2011).</li>
<li>Wang, M. J., Zhang, H., Li, J., Zhao, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNA-98+inhibits+the+proliferation%2C+invasion%2C+migration+and+promotes+apoptosis+of+breast+cancer+cells+by+binding+to+HMGA2%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Reports%22%5BJournal%5D)">microRNA-98 inhibits the proliferation, invasion, migration and promotes apoptosis of breast cancer cells by binding to HMGA2.</a> Bioscience Reports. 38 (5), pii: BSR20180571 (2018).</li>
<li>Zheng, Y. F., Luo, J., Gan, G. L., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+microRNA-98+inhibits+cell+proliferation+and+promotes+cell+apoptosis+via+claudin-1+in+human+colorectal+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Overexpression of microRNA-98 inhibits cell proliferation and promotes cell apoptosis via claudin-1 in human colorectal carcinoma.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 6090-6105 (2019).</li>
<li>Yan, W., Cao, Q. J., Arenas, R. B., Bentley, B., Shao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATA3+inhibits+breast+cancer+metastasis+through+the+reversal+of+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">GATA3 inhibits breast cancer metastasis through the reversal of epithelial-mesenchymal transition.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (18), 14042-14051 (2010).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

שיטת הפלישה לחוץ-גופית היא שיטה זולה, מהירה, כמותית וישירה לחקר הגורמים המקדמים את הפלישה לתא הסרטן. סרטן השד הוא הסרטן השכיח ביותר בקרב נשים. של שלושת סוגי המשנה העיקריים של סרטן השד, משולש שלילי, (או ER-,PR-, HER2/או-), הוא אגרסיבי ביותר, קרוב לוודאי גרורות, ואת הקטלנית ביותר9. לכן, הבנת הגנים והביטוי הנובעים גרורות יכול לעזור למצוא מטרות טיפוליות חדשות סמנים גנטיים עבור המחלה. בעוד רבים של גנים החשובים עבור הפלישה לתא סרטן גרורות זוהו מאופיין, ביטוי רמות הפעילות של הנהגים גרורות נגד גר...

שיטת הפלישה מחוץ למבחנה יכולה להיות כלי שימושי כאשר מדידת היכולת של התא לעבור דרך ממברנה מצופה חלבון, מקבילה לצעדים הראשונים גרורות. תכונה מפתח של תאים סרטניים ממאירים היא היכולת שלהם להגר דרך לפלוש רקמות סמוכות. סרטן שהתפשט או גרורות מהווה אתגרים טיפול יותר ויש לו שיעורי נמוך יותר של הישרדות ארוכת טווח, בעוד גידולים מקומיים קל יותר לטפל ויש להם שיעור גבוה יותר של הישרדות לטווח ארוך. על מנת גרורות, תאים סרטניים חייבים לעזוב את הגידול העיקרי להגר לתוך הדם או מערכת הלימפה, תהליך אשר דורש לעבור דרך מטריצה החילוץ וממברנה מרתף1. בתהליך שנקרא מעבר האפיתל mesenchymal (פרמדיק), את התאים הסרטניים חייבים לשבור את הקשר תא התא, להעביר מבחינה מבצעית, ולפלוש דם הסמוך או כלי הלימפה. הצעדים הראשוניים של המפל גרורות זה הם בעלי עניין רב מאז שלבים אלה הם מה שיכול להפוך סרטן קטלני. הגורמים הגנטיים והאפיגנטיים המעורבים בשלבים המוקדמים של גרורות הם המוקד של כמות גדולה של מחקר, אך כלים ניסיוניים מדויקים ואמינים נחוצים כדי לבדוק את הצעדים המוקדמים הללו הן בvivo והן בתחום החוץ.
כלים למדוד שינויים בהעברת תאים כגון ריפוי בפצע (שריטה) בחני או צמיחה בסביבות תלת-ממד כגון מראה רך אגר יכול באופן חלקי לענות על הצורך בשיטות ניסיוני של מדידת צעדים מוקדמים של גרורות, אבל הטיפול כדי למדוד הפלישה הוא מאתגרת יותר מאז התהליך מתרחשת בגוף בתוך מיקרוסביבה מורכבת הגידול. לצורך הקרנת תרופות או שינויים גנים כדי לקבוע גורמים חשובים בפלישה גרורות, מערכת שניתן להשתמש בתוך מבחנה עם תאים מתורבתים ולחקות את האתגרים הניצבים על ידי תאים גרורתי ב vivo היא האפשרות הפלישה2, 3. שלוש. סרטן השד הוא סוג הנפוץ ביותר של סרטן בנשים והגורם המוביל השני של מוות סרטן אצל נשים, כך הבנה הגנים האחראים לפלישה לסרטן השד וגרורות הוא חשוב באופן ביקורתי לבריאות הציבור. יתר על כן, תאי העכבר הם מערכת מודל שימושי ללמוד סרטן השד ההתקדמות שלה.
שיטת הפלישה החוץ גופית מבוססת על האסיפה קאמרית Boyden שבו שני התאים של התקשורת הצמיחה מופרדים על ידי קרום נקבובי3. כדי לחקות את מיקרוסביבה הגידול, ג'ל עשיר בחלבון נכלל גם בתאים נפרדים בחדר אחד מתוך כימוסטנט בשני ולשמש מחסום קרום המרתף. על מנת לעבור לכיוון הדרך, התאים חייבים תחילה לעבור דרך המכשול עשיר בחלבון ולאחר מכן לעבור דרך קרום נקבובי-תהליך הדומה כיצד תאים גרורתי להגר דרך משתית. ג'ל עשיר חלבון ניתן לשנות בהתבסס על הצרכים של הניסוי, אבל בדרך כלל מורכב קולגן, או תמצית קרום המרתף (למשל, מטריצות)4. זהו תערובת מורכבת של חלבונים, פרוטאוגליקנים וגורמי גדילה, אבל בעיקר מורכב של למינציה ו קולגן הרביעי 4,5. תאים לאחר מכן לעבור דרך קרום נקבובי בדרך כלל עשוי פוליקרבונט, פוליאסטר, או polyטטרפלואורואתילן (מצופה). ניתן לרכוש ממברנות מסחרית עם או בלי ג'ל חלבון (בדרך כלל collagens), או ג'ל ניתן לרכוש בנפרד והוסיף. גודל הנקבוביות ניתן לכוונן על בסיס גודל התא. בעוד גדלי נקבוביות זמינים מ 0.4-8.0 יקרומטר, רק נקבוביות מ 3.0-8.0 יקרומטר הם גדולים מספיק עבור הגירה תא. שיטת הפלישה שימש כדי לקבוע את האפקטיביות של מעכבי על היכולת של תאים להגר ולפלוש. בעוד המחסור המדויק הגידול מיקרוסביבה כי הוא קיים בvivo, שיטת הפלישה מחוץ למבחנה היא מועילה בסינון תנאים רבים תוך זמן קצר תוך מזעור הצורך מודלים בעלי חיים. המטרה של ניסויים אלה היא להשוות את הביטוי הגנטי של החשוד אונגנים ולקבוע את ההשפעות על התנהגות תא סרטן תוקפנות מחלה באמצעות שיטת הפלישה מחוץ למבחנה ובדיקות אחרות. באופן כללי, שיטת הפלישה מספקת תוצאות עקביות, כמותיים ומהירות לקביעת פוטנציאל גרורתי תוך היותו גם שיטה זולה, פשוטה וישימה באופן יחסי.

<table><tbody><tr><td>צלחות 24 בארות</td><td>קורנינג</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>אנטיביוטיקה-אנטימיקוטיקה (100x)</td> <td>ThermoFisher</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>עכברי</td><td></td><td></td><td></td>BALB/c</tr><tr><td>חממת</td><td></td><td></td><td></td>תרבית</tr><tr><td>תאים תרבית תאים צלוחיות מטופלות</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td></td><td></td><td></td>קלינית</tr><tr><td>צמר גפן</td><td>פוריטן</td><td>25-806</td><td></td></tr><tr><td>קריסטל סגול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>C0775</td><td></td></tr><tr>מים <td></td><td></td><td></td><td>מזוקקים</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>10566-016</td><td>גלוקוז גבוה, GlutaMAX</td></tr><tr><td>אתנול</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>F2442-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Forcepts</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>שקופית זכוכית</td><td>VWR</td><td>16004-422</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>14025076 ללא סידן, ללא מגנזיום</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תאי פלישה לשמן</td><td></td><td></td><td></td>Imersion</tr><tr><td>(24 בארות)</td> <td>Corning</td><td>354480</td><td>Cat. #354481</td></tr><tr><td>למיקרוסקופ</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>אור 6 בארותמגיב</td><td></td><td></td><td></td>טרנספקציה ליפופקטמין</tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אזמל, חד פעמי</td><td></td><td></td> <td>#11</td></tr><tr><td>shRNA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צינור</td><td></td><td></td><td></td>העברה סטרילי</tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

השימוש של העכבר בתאי סרטן הגידול בתוך שיטת הפלישה מחוץ למבחנה כמדד של התנהגות התא אונגניים

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

שיטת הפלישה מחוץ למבחנה משתמשת במטריצה עשירה בחלבון בחדר Boyden כדי למדוד את היכולת של תאים מתורבתים לעבור דרך מטריקס וקרום נקבובי בתהליך הדומה לשלבים הראשוניים של גרורות בתאי סרטן. התאים נבדק ניתן לשנות עבור ביטוי הגנים או מטופלים עם מעכבי כדי לבדוק שינויים בפוטנציאל הפלישה. ניסוי זה בוחן את הפנוטיפ האגרסיבי של תאים סרטניים בפטמות העכבר כדי לגלות ולאפיין את אונגנים פוטנציאליים המעודדים הפלישה התא. טכניקה זו, לעומת זאת, יכולה להיות מגוונת ומותאמת ליישומים רבים ושונים. הניסוי עצמו יכול להיעשות ביום אחד והתוצאות נרכשים על ידי מיקרוסקופ קל בפחות מיום. התוצאות כוללות ספירות של מספר תאים פולשים להשוואה וניתוח. הבדיקה של הפלישה מחוץ לעולם היא שיטה מהירה, זולה, וברורה לחתוך לקביעת התנהגות התא בתרבות שניתן להשתמש בה כהערכה ראשונית לפני מעורב יותר vivo assays.

שיטה זו של הפלישה מבחנה באמצעות מטריצת חלבון שימש כדי להעריך את פנוטיפים אגרסיבי והתנהגויות תא אונגניים של העכבר בתאי גידול בחלב עם ביטוי שונה של חלבון האצבע אבץ ZC3H88. בשילוב עם גישות אחרות אשר גם לבחון את הגירה התא ואת הצמיחה בסביבות תלת-ממד, זה נמצא כי רמות גבוהות יותר של ביטוי של Zc3h8 בקווי הגידול תאים, או על ידי ביטוי היזם-מתווך מפלביניים, הביא שיעורי תא מהיר התפשטות, הגירה מהירה, צמיחה בסביבות תלת-ממד, ומוגברת הפלישה בשנת הפלישה מחוץ למבחנה<sup class="xref"...

בשנת מבחנה הפלישה תא מתורבת משמש כדי למדוד את הפוטנציאל של גרורות סרטן על ידי כימות הפוטנציאל התאי עבור פלישה והגירה באמצעות התרבות תאים מוסיף חלבון מטריצה. התאים מאותגרים לעבור דרך מטריצת החלבונים וממברנה נקבובי, לכיוון מיקרוסטנט, ולאחר מכן כימות על ידי מיקרוסקופ אור.

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...

פרוטוקול זה, הבדיקה הפלישה במבחנה, הוא כלי שימושי למדידה כמותית של תאים קווי היכולת לנדוד דרך מטריצה עשירה בחלבון ולעבור דרך קרום נקבובי, בתהליך דומה לשלבים המוקדמים של פלישת תאים סרטניים. קווי תאים אלה יכולים להשתנות גנטית על מנת לבטא מעל גן או להפחית את הביטוי של גן על מנת לקבוע אם גן זה ממלא תפקיד בנדידת תאים או פלישת תאים. סוגי סרטן אגרסיביים רבים כרוכים בשינויים דרמטיים בהתנהגות התאים, כולל הגירה מוגברת ופלישה.אז זה במבחנה הפלישה הבדיקה יכולה לאפשר לנו להבין טוב יותר את הגנים וגורמים אחרים המעורבים בתהליך זה. כדי להתחיל בהליך זה, לגדל תאים סרטניים חלביים עכבר חסיד בבקבוק T25 ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני ו 100% לחות עד שהם 70%-90% confluent ליום הראשון של הניסוי. לאחזר את החדר בוידן מכניס מאחסון ולהעביר אותם למכסה המנוע תרבות התא להתחמם לטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.השתמש בשלוש הוספות כדי ליצור נתונים חוקיים סטטיסטית עבור כל שורת תא עבור כל ניסוי. ולאחר מכן הוסיפו 500 מיקרוליטרים של מדיית DMEM נטולת סרום מחוממת מראש למוסיפים, כך שהמברנה הנקבובית וג'ל יהיו hydrated משני הצדדים. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני ו 100% לחות לפחות שעתיים.לאחר מכן, להכין את התאים על ידי הסרת מדיה הצמיחה ושטיפת התאים עם חמישה מיליליטר של HBSS. הסר את HBSS והוסף מיליליטר אחד של 0.25%פתרון EDTA טריפסין. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה עד חמש דקות או עד התאים מופיעים מעוגלים או להראות סימנים של ניתוק.לאחר מכן הקישו בעדינות על הבקבוק כדי לנתק את כל התאים. השהה מחדש את התאים בחמישה מיליליטר של DMEM עם 10%FBS. ולהעביר את ההשעיה התא לצינור צנטריפוגה סטרילי 15 מיליליטר.צנטריפוגה התאים ו 1000 פעמים g במשך חמש דקות בעדינות גלולה התאים. הסר את המדיה והשהה מחדש את גלולת הכדור בחמישה מיליליטר של DMEM ללא סרום. חזור על תהליך הצנטריפוגה והשעתה מחדש פעמיים נוספות עבור סך של שלוש שטיפות.לאחר מכן, להשעות מחדש ביסודיות את התאים בחמשת המיליליטרים האחרונים של DMEM ללא סרום ולהבטיח שאין גושים של תאים. השתמש hemocytometer כדי לקבוע את ריכוז התא לוודא רק לספור תאים קיימא. ולדלל את ההשעיה התא ל50, 000 תאים למיליליטר בחמישה מיליליטר של DMEM ללא סרום.לאחר מכן, מוציאים את המנה עם המוסיף מהחממה, ושואבים בעדינות את המדיה מהתוספה. הרם את ההוספה ושוגם את המדיה מה באר. עובדים במהירות, מוסיפים את הכימותרפיה לתא התחתון.מניחים את הכנס לתוך הבאר, ועל צלחת 24 גם, להוסיף 500 microliters של ההשעיה התא לתוסף. ודא כי אין בועות אוויר נוכח משני צדי הממברנה. מחזירים את המנה לאנקובטור תרבות התאים למשך 22 שעות.לאחר 22 שעות, הכינו פתרון של 1%paraformaldehyde ואחד X PBS עבור קיבעון. בצלחת נקייה של 24 בארות לתרבות התאים, הוסיפו מיליליטר אחד של התיקון ל בארות בודדות כך שיש באר אחת לכל הכנסה. לאחר מכן, להכין את פתרון הכתמים של 0.1% סגול גביש בתתיק של PBS עם 10%אתנול.הוסף מיליליטר אחד של פתרון מכתים זה לנקייה עבור כל הכנסה. באמצעות מדפים, הסר כל הוספה אחת בכל פעם. מניחים צמר גפן סטרילי ספוגית בתוך כל הכנס לנגב את הצד העליון של הממברנה כדי להסיר את כל התאים unmigrated.חזור על תהליך זה עם ספוגית כותנה שנייה. לאחר מכן, הסר את כל המדיה שנותרה מבפנים של הכנס והוסף 750 מיקרוליטרים של PBS כדי לשטוף את כל התאים המנותקים. הסר את PBS ולחזור על לשטוף עם PBS טרי.לאחר מכן מקם את ההוספה לתוך תיקון המכיל היטב כדי לתקן את התאים שהועברו בצד התחתון של הממברנה. חזור על תהליך זה עבור כל ההוספות ותן לתוספות לתקן במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להסיר כל הכנס אחד בכל פעם מן באר שלה לשטוף אותו עם 750 microliters של PBS.מניחים את הכנס לתוך פתרון כתמים המכיל היטב ולהשאיר אותו במשך 15 דקות כדי להכתים את כל התאים שהועברו קבוע. לאחר מכן להסיר את מוסיף לטבול אותם לתוך מקור המכיל מים מזוקקים עד המים זורמים את הכנס ברור. הסר טיפות מים עודפות והצב את ההוספה לצדדים על פיסת נייר סינון.תן לתוספות אוויר להתייבש. הכן את הממברנה להדמיה על ידי תיוג שקופית מיקרוסקופ זכוכית נקייה עבור כל הכנסה, והצבת טיפה קטנה של שמן טבילה מיקרוסקופ למרכז כל שקופית. באמצעות אזמל, לחתוך סביב ההיקף של הממברנה בצד הפנימי של מוסיף פלסטיק כדי לנתק את הממברנה.השתמש במדפים כדי להסיר את הממברנה ולהציב אותו על גבי טיפת השמן על השקופית שכותרתו. באמצעות מיקרוסקופ מורכב, הצג תאים בהגדלה של חמש פעמים, פי 10 או פי 20. לכימות, יש לצלם מספר תמונות שאינן חופפות בהגדלה של פי 10.קבע את המספר הכולל של תאים או תאים פולשים לכל אזור עבור כל הדגימות. עבור כל ניסוי, בצע כל תנאי בבחינה עם שלוש הוספות שכפול וחזור מספר פעמים לקבלת תוצאות שימושיות סטטיסטית. במחקר זה, פלישה במבחנה דרך מטריצת חלבון משמש כדי להעריך את פנוטיפים אגרסיביים התנהגויות תאים אונקוגניים של תאי גידול החלב העכבר עם ביטוי שונה של חלבון אצבע אבץ, Zc3h8.רמות גבוהות יותר של ביטוי Zc3h8 נתפסת בשורות תאים סרטניים או על ידי ביטוי בתיווך מפלסמיד, וכתוצאה מכך שיעורים מהירים של התפשטות תאים, הגירה מהירה, צמיחה בסביבות 3D, פלישה מוגברת בתוך ההקדמה הפלישה במבחנה. לעומת זאת, ירידה בביטוי על ידי מבני shRNA גורמת לתפוצה פחות אגרסיבית, הגירה ופלישה. בעוד פלישת התא פוחתת עם הפלת shRNA של ביטוי Zc3h8, פלישה זו ניצלת כאשר הביטוי ניצל.טכניקת ההקדמה של הפלישה במבחנה שימושית ביותר מכיוון שהיא גישה מהירה, זולה, גמישה וקלה יחסית ללימוד התנהגות תאים. תאים הגדלים בתרבות קלים לתפעל גנטית. הם יכולים אפילו להיבדק למוטציות ספציפיות.מערכת הפלישה במבחנה מאפשרת גם ניתוח של מעכבי מולקולות קטנות, כמו גם סוכנים ביולוגיים כמו מיקרו RNAs להשפעותיהם על נדידת תאים ופלישה. מצוף זה כולל גם מידה רבה של גמישות, המאפשרת שינוי של תוכן החלבון של המטריצה, גודל הנקבוביות והכימותרפיה.

the-use-mouse-mammary-tumor-cells-an-vitro-invasion-assay-as-measure

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

Assay כדי למדוד כמותית הפיכת גורם הגדילה (TGF)-β-Induced הפלישה ב 3 מימדי ג'ל קולגן מתואר. Assay זו מנצלת את הסדרה MCF10A של שורות תאים, המייצגים שלבים שונים של התפתחות סרטן השד. שיטה זו יכולה להיות מאומץ לשימוש עם שורות תאים אחרים עשוי לשמש כדי לחקור activators פוטנציאליים אחרים או מעכבי הפלישה.

Assay Spheroid למדוד TGF-β-Induced Invasion

הפעלה של מוטציות סמויות עם adenovirus-Cre לתוצאות מערכת ductal החלב בסרטן שד גרורתי רלוונטי מבחינה קלינית. התאגדות של אמרגן YFP מאפשרת מעקב של תאים סרטניים גרורתי דיסטלי. מודל זה שימושי ללמוד גרורות סמויות, חסינות אנטי סרטניים, ולעיצוב immunotherapies החדשני לטיפול בסרטן השד.

חניכה של סרטן השד גרורתי על ידי מיקוד של האפיתל ductal עם Adenovirus-Cre: דגם רומן מהונדס עכבר של סרטן השד

הסרטן הוא מחלה מורכבת שמושפעת מהרקמות המקיפות את הגידול, כמו גם המתווכים פרו מקומיים ואנטי דלקתיים. לכן, דגמי הזרקת orthotropic, ולא מודלים תת עורי עשויים להיות שימושיים ללמוד התקדמות הסרטן באופן שהפתולוגיה אנושית מחקה טוב יותר.

הזרקת orthotopic של תאי סרטן השד לחלב שומן Pad של עכברים לחקר התפתחות גידול.

מתואר מודול מעבדה אפשרי לסטודנטים לתואר ראשון בביולוגיה החוקר מושגים תאיים ומולקולריים מתקדמים באמצעות תרבית תאים של בעלי חיים. הסטודנטים מגדלים, מאפיינים ומתמרנים מודל של תאי סרטן השד על ידי חשיפה לחומרים כימותרפיים. כדאיות התא נבדקת באמצעות ספירת תאים בשיטה סטנדרטית וחדשנית כאחד.

שימוש בתאים סרטניים עכבר החלב ללמד מושגי ביולוגיה Core: מודול מעבדה פשוט

מטרת פרוטוקול זה היא לחקור גידולי שד. בטכניקה זו מסירים גידולי שד של עכברים ומכינים תאים ראשוניים מגידולים. פרוטוקול מיצוי ריאות כלול לחקר גרורות ריאות. יתר על כן, כלול פרוטוקול נוסף לניתוח פיברובלסטים עובריים של עכברים מעובר העכבר.

גידול ראשוני ובידוד תא MEF לחקר ריאות גרורה

מודל גידול ראשוני orthotopic סרטן השד סר כירורגית של גידול ראשוני כדי להאריך את חיי עכבר כדי ליצור גרורות ספונטניות מתוארים. גידול הגידול ולהתפתחותו מנוטר לכמת ידי דימות פלואורסצנטי בלוציפראז.

במודל עכבר orthotopic של שד ספונטני סרטן גרור

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשתיל תאים סרטניים בשד אל תוך כרית שומן החלב פשוטה, פחות פולשנית, אחיזה נוחה בדרך, והוא מודל סרטן השד זה העכבר orthotopic עם סביבה נאותה כרית שומן החלב יכול לשמש כדי לחקור היבטים שונים של סרטן.

הזרקת Orthotopic של תאים סרטניים בשד אל תוך כרית שומן החלב עכברים

פרוטוקול זה מספק כלים ניסיוניים במבחנה כדי להעריך את הטרנספורמציה של תאי אם אנושיים. מתוארים שלבים מפורטים לקצב התפשטות תאים, יכולת צמיחה בלתי תלויה בעיגון והפצה של שושלת תאים בתרבויות תלת-מימד עם מטריצת קרום מרתף.

הערכה במבחנה של טרנספורמציה אונקוגנית בתאי אפיתל ממ"ר אנושיים

כאן אנו מתארים שיטת ניטור לא פולשנית הכוללת לוציפראז וביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק בקווים שונים של תאי סרטן השד. פרוטוקול זה מספק טכניקה לניטור היווצרות גידולים והתיישבות גרורתית בזמן אמת בעכברים.

ניטור צמיחת סרטן השד והיווצרות מושבה גרורתית בעכברים באמצעות Bioluminescence

פרוטוקול זה מתאר שיטות לתרבות, מניפולציה וניתוח CAFs של עכברים, כולל מבחנים פונקציונליים במבחנה/in vivo , טרנסקריפטומיקה וניתוח חישובי. יתר על כן, הוא מתאר פלטפורמה מבוססת אינטרנט שפותחה כדי לנתח את הטרנסקריפטומים הזמינים לציבור של רכיבי סטרומה ואפיתל של לכידת לייזר מאוסף של גידולי סרטן שד אנושיים.

פיברובלסטים הקשורים לסרטן מגידולי חלב של עכברים ככלים למחקרים מולקולריים וחישוביים

חקור מנגנוני פלישת תאי סרטן שד בעכברים באמצעות מבחן הפלישה מחוץ למבחנה. שיטה זו מאפשרת למדוד נדידת תאים דרך מטריצת חלבון ולזהות מטרות תרפויטיות פוטנציאליות במחקר הסרטן.

השימוש של העכבר בתאי סרטן הגידול בתוך שיטת הפלישה מחוץ למבחנה כמדד של התנהגות התא אונגניים

גלה סרטונים נוספים