קבלת סרטן גזע כדורים מגינקולוגית סרטן השד גידולים

פרוטוקול זה מאפשר זיהוי ובידוד של תאי גזע סרטניים בצורה איתנה באמצעות בדיקות תפקודיות ואפיון פנוטיפי. בידוד תאי גזע סרטניים מדגימת גידול יכול להיות פלטפורמה להנחיית היישום הקליני של טיפולים ספציפיים לגידולים בודדים, חיזוי עמידות והישנות כתוצאה מכך. כדי להכין תרבות השעיה שאינן חסידות, יש לציפוי ראשון של מיכלי תרבות התאים ב-50 מיקרוליטרים בריבוע של 15 מיליגרם למיליליטר פוליהמה, ומניחים את המכולות בתנור ייבוש של 37 מעלות צלזיוס למשך יומיים לפחות.

כאשר המיכלים יבשים לחלוטין, לשטוף 80 עד 90 אחוז תרבות קו התאים הסרטניים confluent עם PBS, ולנתק את התאים עם אחד עד שני מיליליטר של טריפסין EDTA. לאחר חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס, לעצור את התגובה עם שניים עד ארבעה מיליליטר של מדיום תרבות תאים טריים, ולשטוף את התאים ניתוק על ידי צנטריפוגה. להשעות מחדש את גלולה במדיום תרבות טרי לספירה, ולדלל את התאים בינוני culturing כדור טרי המכיל שני אחוזים תאית מתיל ב 500 כדי 2000 תאים סנטימטר בריבוע לכל ריכוז צלחת תרבות.

כדי להבטיח מונו-קונסאליות של כדור, זרע כל קו תא בצפיפות נמוכה בסביבה נטולת מעגן. ואז לזרוע את התאים על הלוחות מצופים polyHEMA עבור דגירה של חמישה ימים ב 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוז פחמן דו חמצני, הוספת עשרה ננוגרם למיליליטר של גורם גדילה אפידרמיס ועשרה ננוגרם למיליליטר של גורם גדילה fibroblast בסיסי למדיום תרבות התא כל יומיים. שלושה עד שתים עשרה ימים לאחר הציפוי, יש לצפות במושבות תאים תלת מימדיות בצורת כדור על ידי מיקרוסקופיה קלה.

כדי להשיג אוכלוסיות חסידיות נגזרת, להעביר את הספירות לצלחת תרבות חדשה תחת תנאי התרבות המתאימים עבור קו התאים המקורי סרטן. לאחר יום עד יומיים של תרבות, יש לצפות במונולייה של תאים הגדלים סביב הספירות החסידיות עם מורפולוגיה דומה לזו של קו התאים של המקור. כדי לקבוע את היכולת להרכיב את הכדור של קו העניין של התא הסרטני, לאחר השלמת פרוטוקול יצירת כדור, לאסוף את הספירות על ידי צנטריפוגה.

השתמש בעדינות בכדור הכדור במדיום טרי, ולהשתמש hemocytometer לספור את מספר הכדורים עם קוטר של יותר מ 40 מיקרומטר. לאחר מכן לחשב את יחס האחוזים של הכדור המתקבל לעומת מספר התאים מצופים בתחילה. כדי לקבוע את יכולת ההתחדשות העצמית של קו העניין התאי, לאסוף את הכדורים על ידי צנטריפוגה בעדינות resuspend גלולת הכדור טריפסין EDTA עבור דגירה של חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס.

בסוף הדגירה, להוסיף אנזים והפעלה בינוני לצינור, ו pipette הפתרון כדי להשיג השעיה של תא יחיד. באמצעות מד חמוצית ושיטת ההדרה הכחולה trypan, לספור את התאים קיימא בהשעיה צלחת התאים בצלחות מצופה polyHEMA עבור תוכחה יוצרת כדור כפי שהוכח רק. לאחר שמונה ימים, השתמש בהמוציטומטר כדי לספור את מספר הספירות בקוטר של יותר מ-40 מיקרומטר, ולחשב את יחס האחוזים של הספירות המתקבלות לעומת מספר התאים המוצפים בתחילה.

כדי להעריך את השטח שנכבש על ידי הספירות, מקם את צלחת התרבות על הבמה של מיקרוסקופ הפוך המצויד במודול רכישת תמונה ובחר הגדלה של פי 100 עד 400X. השג תמונות של לפחות עשרה שדות אקראיים לכל תנאי, ולהשתמש בתוכנה מתאימה לניתוח תמונה כדי לצייר אזורים מעניינים סביב הספירות. לאחר מכן למדוד את האזור של כל אזור עניין בפיקסלים ולחשב את אזור הקרנה כדור כאזור הממוצע של הפיקסלים נמדד.

האפיון התפקודי של יכולת יצירת הספירה, ההתחדשות העצמית וההקרנה של תאי הגזע הסרטניים מאפשר השוואה בין שושלת היוחסין הרחוקה שלהם לבין רקמת המוצא שלהם. פרוטוקול יצירת הכדור מאפשר למושבות כדוריות להתקבל בהשעיה מכמה קווי תאים של רירית הרחם וסרטן השד או לאחר עיכול אנזימטי עדין של רקמות מדגימות גידול אנושיות. הן כדורי רירית הרחם והן סרטן השד מעוררים מונוליאר תאים עם מורפולוגיות דומות לקו המוצא התאי שלהם יום עד יומיים לאחר הציפוי.

בניסויים ייצוגיים אלה, קולטן הורמונלי חיובי סרטן השד MCF-7 תאים הפגינו יכולת יצירת כדור גבוהה יותר, יכולת התחדשות עצמית, אזור הקרנה מאשר תאי סרטן השד HCC1806 שלילי משולש. מלבד העשרת תאי גזע סרטניים באמצעות פרוטוקול יצירת הספירה, אנו ממליצים על הערכה נוספת של גזעם בשיטות משלימות כגון ציטומטריית זרימה. בניתוח מייצג זה של תחומים המתקבלים מקווי תאי רירית הרחם, זוהו ארבע אוכלוסיות של תאים המבטאים סמני תאי גזע סרטניים בכל קו תא על ידי ציטומטריית זרימה.

הערכה של תחומי הגידול על ידי טכניקות ביולוגיה מולקולרית אחרות יכולה להיות מאשרת של גזע, ופלסטיות של תאי גזע סרטניים והקלה על התפתחות טיפולים ממוקדים. ניתוח כתם מערבי לאחר קצירת כדור עדינה חשף גם פנוטיפ תא גזע סרטני עבור הכדורים המופנמים שנוצרו. פרוטוקול בידוד זה תורם להבנתנו את המשמעות של תאי גזע סרטניים אשר מתורגמת קלינית להבנת התדרדרות, גרורות והתנגדות לטיפול.