שימוש ב- Drosophila ילה S2 תאים עבור הדמיה חיה של חטיבת התא

הפרוטוקול שלנו יכול לשמש כדי לקבוע אירועים דינמיים spacial ו temporal במהלך מיטוזה, והוא יכול לשמש גם כדי לדמיין את ההשפעות של הרגולטורים mytotic בזמן אמת. שימוש בהדמיית צבע כפולה מאפשר ניתוח סימולטני של שני סמנים מולקולריים. לדוגמה, אנו יכולים לדמיין את המיקרוטובולים של הציר המיטוטי ואת מבנה הליבה הקינטי של כרומוזומים משוכפלים.

כדי לגרום לביטוי חלבון פלואורסצנטי, ארבעה ימים לאחר טיפול הפרעה RNA, לחשוף תאים מקדם מטלו-תיאנין בלתי מוחשי לריכוז סופי של 500 נחושת מיקרומולרית סולפט במשך 24 עד 36 שעות. כדי להכין את החלבון הפלואורסצנטי המבטאת תאים להדמיה, להעביר את התאים לצינור סטרילי 15 מיליליטר, ולאחר הספירה, לעים את התאים על ידי צנטריפוגה. תן את גלולה טרי, 25 מעלות צלזיוס חימם SIM, בתוספת 10% FBS, בשתי פעמים 10 ל 6 תאים לריכוז מיליליטר, ולטפל בתאים עם תוספת 500 סולפט נחושת micromolar.

לאחר מכן הוסיפו 200 עד 500 מיקרוליטרים של תאים ל הבאר אחת של תא תאים חי רב-תכליתי, והצבו את התא על שלב מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך. בזמן שהתאים מתיישבים בתא, פתחו את תוכנת הדמיית התאים החיים ולחצו על חדש והתנסו. כדי להוסיף לולאת זמן לשגות שבו התמונות יצולמו, לחץ על סמל לולאת זמן לשגות.

הגדר את מרווח הזמן ל השניות וחלק את אורך הניסוי הכולל הרצוי בשניות לפי מרווח הזמן כדי להגדיר את מספר המחזורים. אפשר ללולאה לחזור על עצמה לאורך פרק הזמן הכולל הרצוי. כדי להוסיף בדיקת מיקוד אינפרא-אדום כדי לשמור על מוקד המטרה, לחץ על סמל הזז את XY ובחר פיצוי נדידת Z כדי להוסיף שלב פיצוי נדידת Z בתוך שכבת לולאת הזמן.

כדי לאפשר רכישה של תמונה מרובת ערוצים, לחצו על סמל הקבוצה מרובת הערוצים להוספת שכבת קבוצה מרובת ערוצים ולחצו על הסמל 'הוסף לולאת מחסנית Z' להוספת שכבת לולאת מחסנית Z. לאחר מכן הגדר את גודל הצעד הרצוי ואת מספר הפרוסות, והגדר את החשיפה של כל ערוץ לנמוכה ככל האפשר כדי למזער את הלבנת התמונות. כדי לדמיין חלוקת תאים, בחר מטרה של טבילת שמן פי 40 או 60, ואת ערוץ פלורסנס mCherry, ויישר את המטרה לאורך החלק העליון או התחתון של הבאר.

לאחר מכן התרחקו ממפריד הבאר האנכי כדי למנוע הפרעה לשלב הפיצוי של Z drift. אתר תא או תאים בשלב G2 או M מוקדם, ולחץ על לחצן התצוגה החיה כדי להתחיל להציג תאים במסך התוכנה. מציאת תאים מתאימים במעבר G2 ל- M היא המפתח להדמיית חלוקת תאים.

אתר תא עם גרעין שלם ושני centrosomes בדיוק לקבלת התוצאות הטובות ביותר. באמצעות ידית המיקוד העדינה של המיקרוסקופ, התמקדו בתאי העניין ולחצו על 'מצא היסט' כדי להגדיר את בדיקת המיקוד של האינפרא-אדום. לחץ על התחל כדי ליזום את תוכנית ההדמיה לשגות זמן, ובחר את הערוץ הרצוי ולהתאים את עוצמת הפיקסל הממוצע כדי להתאים את ההיסטוגרמות לפי הצורך, כדי לדמיין בבירור את התאים של עניין.

בדוק את התאים לאחר 15 עד 20 דקות כדי לאשר כי התמוטטות המעטפה הגרעינית התרחשה, כפי שנקבע על ידי היעלמותו של הסיבוב, נקודה שבירה כהה ליד מרכז התא. לאחר 15 עד 20 דקות נוספות, בדוק אם התרחשה הופעת אנפאזה. לאחר מכן הפסק את התוכנית ושמור את הקובץ.

כדי לקבוע את פירוק המעטפה הגרעינית כדי להפיג את התזמון, לחץ על לחצן מסגרת למעלה כדי לקבוע את הזמן של פירוק מעטפה גרעינית ואת הזמן של הפרדת כרומוזום ראשונית בתוך דקות, ולחסר את זמן ההתמוטטות מזמן תחילת כדי לקבל את פירוק המעטפה הגרעינית כדי אנפה תחילת זמן עבור תא נתון. לאחר מכן המשיכו בסריקה לאיתור תאים מפרידים מראש כדי להשיג קצוות מרובים עבור תנאי נתון למשך עד 12 שעות מההתיישבות הראשונית. תאים עומדים להתחלק יכולים להיות ממוקדים על ידי נוכחות של שני centrosomes וגרעין שלם, כפי שצוין על ידי אור שבירה נקודה כהה בתוך התא כאשר צפו בערוץ אלפא tubulin.

ניתן לדמיין את פירוק המעטפה הגרעינית דרך היעלמותה של נקודה כהה זו, וכתוצאה מכך צביעה אחידה של הציטופלסמה. לאחר פירוק המעטפה הגרעינית, הזמן שלוקח לכל תא ליצור את הציר ולקונגרס ולהפריד את הכרומוזומים ניתן למדוד על ידי שים קץ לנקודות הזמן של אירועים אלה ביחס לפירוק המעטפות הגרעיניות. טיפול עם RNA תקוע כפול ממוקד נגד בלם, חלבון צמד microtubule actin חשוד להשפיע על דינמיקה מחזור התא תוצאות עיכוב מיטוטי משמעותי.

טיפול זה גורם לעיכוב משמעותי, כאשר תאים רבים עוצרים במטה-פאזה ולעולם לא עוברים לאנאפאזה במהלך כל ניסוי ההדמיה של שעתיים עד שלוש שעות. טיפול שותף עם רנ"א דו-תקע נגד זריקה ועסקה גסה, מרכיב חשוב במחסום זה, מוביל לדיכוי של פנוטיפ המעצר, וכתוצאה מכך פירוק מעטפה גרעינית לזמנים אנפאז דומים לתאים מבוקרים ולא מטופלים. הקפד לבחור תאים מתאימים ואל תבזבז זמן על דימות תאים שאינם מתחילים בחלוקה.

אם תא אינו מתחיל להתחלק בתוך 20 דקות, מצא תא אחר. חוקרים יכולים לעקוב אחר הליך זה כדי לסייע בזיהוי רגולטורים מיטוטיים חדשים, או אולי תרכובות יבשות חדשניות המשפיעות על אירועים ספציפיים בחלוקת התאים.