התרבות הראשית של הנוירונים מבודדים מתוך עכבר ממוח עובריים

ניהול ניסויים בלתי מתורבת כדי לשקף את התנאים הvivo ככל האפשר, אינו משימה קלה. השימוש בתרביות תאים ראשונית הוא צעד חשוב להבנת הביולוגיה התאית באורגניזם שלם. הפרוטוקול שסופקו מתאר כיצד לצמוח בהצלחה תרבות עובריים העכבר מתחלקים נוירונים.

תרבות התאים העצביים העיקרית היא מערכת מודל אידיאלית לחקר נוירונים דיסוציאציה בתרבות במבחנה. היתרון של שימוש בשיטה זו הוא היכולת לשמור על התכונות התאיות של תאים דיסוציאציה, כגון מנגנונים, פונקציות, ומורפולוגיה בתנאים במבחנה במשך כמה שבועות קרוב ככל האפשר למצב vivo. שים את החלקות הכיסוי העגולות בצלחת של 24 באר מתחת לארון ה-biosafety.

הוסף 90 מיקרוליטרים של פולי-L-ornithine על כל להחליק כיסוי. סוגרים את הכובע ומ מניחים בעדינות את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות במשך יומיים. מכינים את מדיום התרבות ואת בינוני הזרעים ולשמור אותם בארבע מעלות צלזיוס.

הכן את פתרון טריפסין העבודה ב- DMEM/F12 ושמור אותו בארבע מעלות. מניחים את מדיום התרבות ואת מדיום הזרעים באינקובטור ב 37 מעלות. תוציא את צלחת ה-24 בארות מהחמה.

לשטוף את החלקות הכיסוי שלוש פעמים עם מים מזוקקים כפולים. השאירו את הכיסוי מחליק לפחות שעתיים לייבוש מוחלט. הכינו שלוש מנות פטרי מלאות ב-PBS קר, שלוש מנות פטרי מלאות ב-HBSS קר, וחמש מנות פטרי מלאות בדיסקציה קרה בינונית על קרח.

בלמל את קרני הרחם ולשטוף אותם PBS קר שלוש פעמים על קרח. מכאן כל השלבים צריכים להתבצע על קרח כדי למזער את הנזק לרקמות. לאחר שלב הכביסה האחרון, מפרידים את הגורים מהרחם ב- HBSS ומעבירים אותם למדיום הניתוח הקר.

במדיום ניתוח, לערוף את הגורים עם מספריים. פתח את הקלבריום ממגנום foramen לגבול הנחות של חלל המסלול. באמצעות זוג מדפים עדין, להסיר את בסיס הגולגולת לקלף את הגולגולת הרחק מהמוח.

בזהירות להסיר את קרום המוח של המוח הקטן החל מן המשטח הדחוס של peduncle המוח הקטן באמצע פונס. חותכים את שני peduncles המוח הקטן ולהפריד את המוח הקטן משאר המוח. מיד מניחים את cerebella שנאסף בצינור חרוט סטרילי 15 מ"ל מלא DMEM / F12 על קרח.

צנטריפוגה הצינור ב 1, 000 גרם בארבע מעלות במשך דקה אחת ב DMEM / F12. חזור על זה שלוש פעמים, בכל פעם בעדינות להסיר את supernatant עם פיפטה מחדש להשעות את גלולה ב DMEM טרי / F12. מוסיפים שני מיליליטר של טריפסין מחומם מראש בעדינות פיפטה לערבב אותם יחד.

מניחים את הצינור באמבט מים 37 מעלות במשך 12 דקות. לאחר הדגירה, להביא את הצינור לארון הבטיחות ולהוסיף 10 mLs של DMEM / F12 כדי להשבית את טריפסין. צנטריפוגה של התערובת ב 1, 200 גרם של במשך חמש דקות.

השליכו את העל-טבעי והתינו מחדש במדיום טרי ואחריו צנטריפוגה שלוש פעמים. הרטבה מראש פיפטה פלסטיק סטרילי עם DMEM / F2. הוסף 3.5 מיליליטר של פתרון עבודה DNAse לאותו צינור.

Triturate הרקמה עם פיפטה מספר פעמים עד הנוזל מגיע צבע חלבי הומוגני. מוסיפים 10 מ"ל של DMEM/F12 קר לתערובת וממשיך לצנטריפוגה. צנטריפוגה המדגם ב 1, 200 גרם בארבע מעלות במשך חמש דקות.

בזהירות להסיר את supernatant מבלי להפריע את גלולה. מוציאים את מדיום הזריעה מהה חממה. מוסיפים 500 מיקרוליטרים של מדיום זריעה לפני המלחמה ומערבבים אותו היטב באמצעות פיפטה.

לספור את התאים באמצעות מד חמוציט. לדלל את ההשעיה התא עם זריעה בינונית לצפיפות של 500, 000 תאים למיליליטר. מוסיפים 90 מיקרוליטרים של התערובת לכל באר במרכז הכיסוי.

מניחים את הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות במשך שלוש עד ארבע שעות. לאחר הדגירה, הוסיפו 500 מיקרוליטרים של מדיום תרבות טרום המלחמה לתוך כל באר. החלף את הצלחת לתוך החממה ב 37 מעלות.

לאחר שבעה ימים, החלף את המדיום הישן בתרבות רעננה בינונית II.Prepare צלחת נפרדת של 24 בארות עם ארגון מספרי מתאים והוסף 100 מיקרוליטרים של PFA 4% לכל באר. לאחר הימים הרצויים בתרבות, בעדינות להסיר את החלקות כיסוי מן הבארים של צלחת התרבות המקורית למקם אותם לתוך הבארים המתאימים של צלחת PFA המתוארים בשלב הקודם. הוסף PFA ל בארות לחלוטין לטבול את החלקות כיסוי.

שמור את צלחת PFA בארבע מעלות במשך 30 עד 120 דקות. לאחר הדגירה, להחזיר את הצלחת לטמפרטורת החדר. לשטוף את הכיסוי מחליק בעדינות עם PBS במשך חמש דקות שלוש פעמים.

איור 2 בטקסט מציג את תרבות התאים המוחיים החל מ- E18. Immunofluorescence עבור קלבינדין מראה נוירונים Purkinje עם הרחבות אקסונאלי על ידי שלושה ימים במבחנה. על ידי שבעה עד 10 ימים במבחנה, תהליכים דנדריטיים ניכרים.

ב-21 ימים קיימים סניפים דנדריטיים מורכבים. איור 3 בטקסט מציג תרבויות תאים מוחיים החל בימים עובריים שונים. זיהוי immunofluorescence של קלבינדין מראה נוירונים Purkinje עם אקסונים מוקדמים רק לאחר 18 ימים במבחנה.

תרבויות נוירונים Purkinje התחיל ב E14 ו E15 יפתחו דנדריטים, אבל אף פעם לא מורכב כמו אלה המתפתחים כאשר E18 היא נקודת המוצא. איור 4 בטקסט מראה שסוגי תאים שונים מתפתחים מתרבויות E18 לאחר 21 ימים במבחנה. חוש חיסוני ירוק קלבינדין מראה נוירונים Purkinje.

שפעת חיסונית אדומה עבור parvalbumin ב B ו- C להראות interneurons מעכבים. שפעת חיסונית אדומה עבור ערוץ מגודר מתח נתרן ב E ו- F מראה נוירונים גרגיר. הפרוטוקול הנוכחי הוא חסכוני וקל להתנהלות.

בסוף וידאו זה, תוכל לאסוף ולתרבות נוירונים מוחיים ולתקן אותם ב DIVs הרצוי.